גידול וקטיף חד-שבטי מיקרוביאלי אוטומטי ובתפוקה גבוהה באמצעות מערכת אומיקס תרבית מיקרוליטר-טיפה חד-תאית

Summary

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש במערכת Omics של תרבית מיקרוליטר טיפה חד-תאית (תא MISS) כדי לבצע בידוד, טיפוח וקטיף חד-שבטי מיקרוביאלי. תא ה-MISS משיג זרימת עבודה משולבת המבוססת על טכנולוגיית מיקרופלואידית טיפות, המציעה פיזור חד-טיפתי מעולה, גידול מקביל גבוה וזיהוי ביומסה בתפוקה גבוהה.

Abstract

תרביות חיידקים טהורות חיוניות לחקר התרבות המיקרוביאלית. שיטות מסורתיות המבוססות על לוחות מוצקים, לוחות באר ומיקרו-כורים מעוכבות על ידי נהלים מסורבלים ותפוקה נמוכה, מה שמעכב את ההתקדמות המהירה של מחקר התרבות המיקרוביאלית. כדי להתמודד עם אתגרים אלה, פיתחנו בהצלחה את מערכת Omics של תרבית מיקרוליטר טיפה חד-תאית (תא MISS), פלטפורמה אוטומטית בעלת תפוקה גבוהה המשתמשת בטכנולוגיה מיקרופלואידית טיפתית לבידוד, גידול וסינון חד-שבטיים מיקרוביאליים. מערכת זו יכולה לייצר מספר רב של טיפות חד-תאיות ולטפח, לסנן ולאסוף מושבות חד-שבטיות תוך זמן קצר, מה שמקל על תהליך משולב מבידוד מיקרוביאלי ועד קטיף. בפרוטוקול זה, הדגמנו את יישומו באמצעות בידוד וטיפוח של מיקרוביוטת מעיים אנושית כדוגמה והשווינו את יעילות הבידוד המיקרוביאלי, ביצועי התרבית החד-שבטית ותפוקת הסינון בשיטת תרבית הצלחת המוצקה. זרימת העבודה הניסיונית הייתה פשוטה, וצריכת הריאגנטים הייתה נמוכה מאוד. בהשוואה לשיטות תרבית בצלחת מוצקה, תא ה-MISS יכול לטפח מגוון גדול יותר של מיני מיקרוביוטה במעיים, מה שמציע פוטנציאל וערך משמעותיים למחקר קולטורומיקה מיקרוביאלית.

Introduction

לתרבות מיקרוביאלית יש יישומים נרחבים בחקר חיידקים מועילים בתעשיית המזון, מגוון החיידקים הסביבתיים, סינון תרכובות אנטי-מיקרוביאליות חדשות והמיקרוביום האנושי ביחס למחלה 1,2,3,4. שיטות מסורתיות, המבוססות בעיקר על לוחות מוצקים, לוחות באר או מיקרו-ריאקטורים להשגת ובחירת מושבות חד-שבטיות, קלות לתפעול אך סובלות מתפוקה נמוכה בשל השלבים המרובים שלהן. מגבלה זו מעכבת יישומים כגון סינון מוטגנזה מיקרוביאלית, מחקרי תרבות מיקרוביאלית ובחירת מושבות בייצור גבוה, שכולם דורשים סינון חד-שבטי נרחב.

לאחרונה, תוכננו התקני זיהוי וחלוקה שונים של תאים בודדים כדי לשפר משמעותית את מהירות העיבוד של דגימות מיקרוביאליות, תוך הפחתת העבודה ומזעור שגיאות מטיפול ידני⁵. עם זאת, מכשירים אלה מתייחסים בדרך כלל רק לשלבים ספציפיים בשיטות מסורתיות, ולעתים קרובות דורשים שילוב ציוד נרחב, תופסים מקום משמעותי וכרוכים בעלויות גבוהות. לכן, היה צורך דחוף לפתח פלטפורמת תרבית וסינון מיקרוביאלית בעלות נמוכה וניתנת ליישום אוניברסלי כדי לפצות על החסרונות שהוזכרו לעיל.

בעבודתנו הקודמת, פיתחנו בהצלחה פלטפורמת סינון אוטומטית בעלת תפוקה גבוהה, הידועה בשם Single-cell Microliter-droplet Culture Omics System (תא מיס, להלן "מערכת Omics")⁶. פלטפורמה זו משתמשת בטכנולוגיה מיקרופלואידית טיפתית, הטומנת בחובה הבטחה להשגת אוטומציה ואינטגרציה בבידוד מיקרוביאלי, גידול וקטיף 7,8,9,10. מערכת Omics כוללת מספר מודולים מרכזיים, כולל מודול דגימה, שבב מיקרופלואידי, מערכת זיהוי ואיסוף טיפות, המאפשרת בידוד יעיל של תא בודד, גידול, סינון חד שבטי ואיסוף במחקר מיקרוביולוגיה. כבר השתמשנו במערכת Omics כדי להשיג בדיקת מוטגנזה בתפוקה גבוהה של Corynebacterium glutamicum⁶.

בשל האוטומציה ויכולות הסינון הגבוהות של מערכת Omics, יישומה על תרבות מיקרוביאלית צפוי להשיג במהירות כמות גדולה של נתונים מיקרוביאליים. בפרוטוקול זה, הצגנו את ההליך התפעולי המפורט של תא ה-MISS, עם בידוד וטיפוח של מיקרוביוטת המעיים האנושית כדוגמה להדגמת תהליך הבידוד המיקרוביאלי של תא בודד, גידול, זיהוי חד-שבטי וסינון. פעולת מערכת Omics היא פשוטה, והחוקרים צריכים רק לעקוב אחר כיוון התוכנה להתקנה רציפה של שבב מיקרו-נוזלי ליצירת מיקרו-צינורות וטיפות, הגדרות פרמטרים והכנת דגימות.

בממשק פעולת התוכנה, מערכת Omics מחולקת לשלוש פונקציות עיקריות - בידוד, טיפוח וסינון. החוקרים יכולים לבחור שלבים שונים בהתאם לניסוי. יתר על כן, בשלב סינון הטיפות, החוקרים יכולים לבחור בין שני מצבי זיהוי: אות פלואורסצנטי או צפיפות אופטית. התוכנה מספקת הדמיה בזמן אמת של תהליך סינון הטיפות. לבסוף, לחוקרים יש את הגמישות להגדיר פרמטרים כגון תנאי תרבית, אורך גל שזוהה ומספר בארות האיסוף על סמך דרישות הניסוי הספציפיות שלהם, והם יכולים להשהות את המכשיר בכל עת כדי לבצע פעולות אחרות. תא ה-MISS הוא פלטפורמת סינון חד-שבטית ידידותית לחיידקים, בעלת תפוקה גבוהה עם הפעלה פשוטה וצריכת ריאגנטים מינימלית.

Protocol

כל נהלי המחקר תואמים את כל התקנות האתיות הרלוונטיות. הנהלים אושרו על ידי ועדת האתיקה של המדע והטכנולוגיה של אוניברסיטת צינגהואה. לצורך חקר המיקרוביוטה של המעי האנושי, נאספו דגימות צואה ממבוגר בריא ללא בעיות רפואיות משמעותיות, שנתן הסכמה מדעת בכתב.

1. התקנת מכשירים

1. הנח את מכשיר מערכת Omics בסביבה נקייה או סטרילית (כגון חדר סטרילי או ספסל אנאירובי). המכשיר הוא מכשיר מדויק, וכאשר מניחים אותו במתקן, יש לקחת בחשבון את הדברים הבאים:
   1. שמור על המכשיר בלחץ וטמפרטורה רגילים.
   2. הרחק את המכשיר משדות חשמליים חזקים, שדות מגנטיים ומקורות קרינת חום.
   3. ודא ששטח מיקום המכשיר עולה על מידות של 2,500 מ"מ (D) x 1,500 מ"מ (W) x 2,000 מ"מ (H).
   4. שמור על לחות הסביבה של המכשיר מתחת ל-60%.

2. הכנות

1. הפעל ברצף את החשמל עבור מערכת Omics, המחשב ותוכנת ההפעלה של מערכת Omics.
2. התקנת שבב מיקרו-נוזלי של תא MISS ויצירת טיפות:
   1. פתח את הדלת של תא הייצור והטיפוח של טיפות (איור 1A) והסר אנכית את כיסוי המגן עבור השבב המיקרו-נוזלי ליצירת המיקרו-צינורות והטיפות. השתמש במזרק חד פעמי כדי להוסיף 10 מ"ל של מים מזוקקים סטריליים למכשיר האדים בתוך תא גידול הטיפות (איור 1C) והתקן מחדש את כיסוי המגן עבור השבב המיקרו-נוזלי ליצירת מיקרו-צינורות וטיפות.
   2. פתח את האריזה הסטרילית של השבב המיקרו-נוזלי ליצירת המיקרו-צינורות והטיפות והנח אותו אנכית ישירות מעל תא הטיפוח (איור 1C).
   3. בממשק התוכנה, לחץ על התקנה (איור 2A). בשלב זה, מופיע חלון מוקפץ עם ההנחיה, לאשר את החלפת השבב המיקרו-נוזלי ליצירת מיקרו-צינורות וטיפות? לחץ על כן כדי להתחיל בהתקנה.
   4. הוצא את מסיר בועות האוויר וקבע אותו הפוך על מיקום מסיר בועות האוויר בתא יצירת הטיפות והטיפוח. היזהר לא ללחוץ על צינורות הכניסה והיציאה של הטיפות של מסיר בועות האוויר (איור 1E).
   5. חבר את צינור יציאת הטיפות של מסיר בועות האוויר ל-clampשסתום שמתחתיו ותן לו לעבור דרך החור, המופנה לתא גילוי ואיסוף הטיפות (איור 1B).
   6. פתח את הדלת של תא גילוי ואיסוף טיפות, הכנס אנכית את צינור הגילוי, שכבר מחובר לצינור יציאת הטיפות, לתוך שקע הגילוי, וודא שצינור הגילוי מוכנס במלואו (איור 1D).
      הערה: בעת הכנסת צינור הזיהוי, הכנס אותו אנכית ללא כיפופים על הצינור.
   7. הדק את הבורג המאבטח את צינור הזיהוי בכיוון השעון. לאחר אישור שצינור הזיהוי מוכנס ומאובטח במלואו, סגור את דלת תא הזיהוי והאיסוף של הטיפות.
   8. מהשבב המיקרו-נוזלי ליצירת המיקרו-צינורות והטיפות, ישנם 10 צינורות סיליקון, כל אחד מסומן במספר (L01-L10). חבר כל צינור מסומן ל-clamp שסתום הממוספר המתאים (01-10) (איור 1C).
   9. חבר את המחבר המהיר מהשבב המיקרו-נוזלי ליצירת המיקרו-צינורות והטיפות ליציאה המתאימה במערכת Omics: C1 ל-O1, C2 ל-O2, C4 ל-O4 ו-CF ל-OF.
      הערה: ההתקנה של השבב המיקרו-נוזלי ליצירת מיקרו-צינורות וטיפות הושלמה. אין צורך לחבר את C3 ל-O3.
   10. לאחר השלמת התקנת השבב המיקרו-נוזלי ליצירת המיקרו-צינורות והטיפות, מופיע חלון מוקפץ המבקש פתיחת שסתום הידוק צינורות טיפות. לחץ על אישור לאחר השלמת התקנת השבב המיקרו-נוזלי ליצירת מיקרו-צינורות וטיפות. לאחר שווידאת שכל צינורות הסיליקון מהשבב המיקרו-נוזלי של המיקרו-צינורות ויצירת הטיפות מחוברים ל-clamp שסתום המתאים, לחץ על אישור.
3. אתחול מכשיר
   1. לפני ביצוע האתחול, לחץ על ממשק ההגדרה (איור 2B) כדי להגדיר פרמטרים רלוונטיים: מצב זיהוי (זיהוי מבוסס OD או מבוסס פלואורסצנטי; OD כאן), טמפרטורת הדגירה (37 מעלות צלזיוס) והזמן (30 יום = 720 שעות), מהירות המערבל (20 סל"ד), אורך הגל של זיהוי OD (600 ננומטר), ואורך גל העירור והפליטה של זיהוי הקרינה.
      הערה: הפרמטרים המשמשים לבידוד וטיפוח של מיקרוביוטת המעי האנושי בפרוטוקול זה ניתנים בסוגריים. בעת קביעת הפרמטרים, טמפרטורת הגידול צריכה להיות בין 5 מעלות צלזיוס ל-50 מעלות צלזיוס. בעת בחירת מצב הזיהוי, יש להחליף את הסיב האופטי אם הסיב במודול זיהוי הטיפות אינו זהה (ראה שלב 2.3.2). בעת קביעת התצורה של פרמטרים, ערך ייחוס שלב השמן (ספקטרל בסיסי) מזוהה אוטומטית על ידי התוכנה, ומבטל את הצורך בהתאמות ידניות.
   2. החלפת הסיב האופטי שזוהה
      1. הסר את הסיב שזוהה ממחזיק הסיבים (הברג נגד כיוון השעון) ושחרר את בורג קיבוע הסיבים במודול הטיפות (איור 1D).
      2. אם לא ייעשה שימוש בסיב האופטי, הסר אותו מהמודול, הכנס אותו למחזיק הסיבים והדק אותו. הכנס את הסיב שזוהה ליציאת הזיהוי, והדק את בורג קיבוע הסיבים במודול. החלפת הסיב האופטי הסתיימה.
   3. פנה לממשק הבית ולחץ על אתחול כדי לאפשר למערכת Omics לבצע בדיקה עצמית של רכיביה, כולל משאבת ההזרקה, הגדרות הטמפרטורה, בדיקת פריקת נוזלי פסולת, מודול סינון ומודול זיהוי טיפות.
      1. במהלך האתחול, בצע בדיקת פריקת נוזלי פסולת ממודול זיהוי הטיפות על ידי הזרקת 1 מ"ל של 75% אלכוהול לתוך יציאת נוזל הפסולת והתבוננות אם הנוזל זורם החוצה כרגיל.
      2. לבדיקת מודול הסינון, הנח צלחת של 96 בארות על מיקום הצלחת ובדוק אם תנועת הצלחת תקינה.

3. יצירת טיפות

1. איסוף ועיבוד דגימות מיקרוביוטה במעיים אנושיים
   1. הכן סיר תא ומיכלי שרפרף, שטוף ידיים ולבש כפפות כדי לאסוף דגימות צואה טריות.
      הערה: בעת איסוף דגימות צואה, הימנע ככל האפשר מזיהום שתן. עדיף להשתין לפני כן, ולהניח את הצואה בכלי נקי ויבש.
   2. יש לאסוף באופן אספטי את הכמות המתאימה של צואה באמצע הקטע ולאטום אותה בקריוביאלים מעוקרים (כ-3-5 גרם לבקבוקון). הנח את הבקבוקונים על קרח מיד לצורך ציטוט ותיוג לאחר מכן.
      הערה: אם דגימת הצואה גדולה או שלא ניתן לאסוף אותה מיד, יש לאסוף אותה תוך שעתיים לכל היותר.
   3. בספסל האנאירובי, השתמש במקלון סטרילי או בכלי דגימת צואה כדי לאסוף דגימה באמצע הקטע.
      הערה: שכבת פני השטח של הצואה מכילה תאי רירית מעיים שנשפכו ונוטה לזיהום חיצוני; לאחר חשיפה לאוויר, חלק מהדנ"א המיקרוביאלי מתחיל להתפרק.
   4. העבירו את דגימות הצואה שנאספו לצינורות מיקרו-צנטריפוגה סטריליים של 2 מ"ל או קריוביאלים סטריליים, כאשר כל צינור מכיל 0.5-2.0 גרם צואה. הכן שתי מכסות להקפאה לכל דגימה.
   5. השעו מחדש את דגימת הצואה הטרייה בתמיסת מלח פיזיולוגית סטרילית, כאשר כל 100 מ"ג של הצואה מדוללת ב-1 מ"ל תמיסה. מערבבים היטב את הצואה עד שלא נראים חלקיקים גדולים.
   6. לאחר שקיעה טבעית במשך 10 דקות, סנן ברצף את הסופרנטנט דרך מסנני רשת סטריליים עם גדלי נקבוביות של 200 רשת (0.075 מ"מ), 400 רשת (0.038 מ"מ) ו-800 רשת (0.018 מ"מ) כדי להסיר מזון לא מעוכל וחלקיקים קטנים יותר. לבסוף, אוספים את המסנן בצינורות צנטריפוגה סטריליים.
   7. קח 10 מיקרוליטר מהתרחיף הצואתי המסונן וקבע את ריכוז החיידקים באמצעות המוציטומטר ומיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך.
      הערה: לאחר סינון דגימת הצואה דרך גדלי רשת שונים, נשארים כמה חלקיקי צואה קטנים יותר. לכן, בעת קביעת ריכוז המיקרוביאלי, חלקיקים פעילים הנצפים במיקרוסקופ נחשבים כמיקרואורגניזמים, מה שמאפשר רק חישוב משוער של ריכוז החיידקים.
   8. העבירו את תרחיף הצואה לצינור צנטריפוגה סטרילי של 1.5 מ"ל וסמנו אותו עם התאריך, ריכוז החיידקים ושם המדגם. שמור חלק לניסויים הבאים, ואחסן את השאר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כשימוש עתידי.
      הערה: רשום מיד מידע מדגם (שם המדגם, זמן האיסוף) כדי להבטיח שהדגימות נאספות בו זמנית (בהתחשב בשינויים בקצב הזמן של חיידקי המעי של יונקים). כל איסוף ועיבוד הדגימות צריך להתבצע בסביבה אנאירובית.
2. הכנה להשעיית הצואה הראשונית
   1. הכינו מדיום מרק לב מוח (BHI) לפי פרוטוקול היצרן ועקרו אותו על ידי חיטוי בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
   2. קח את תרחיף הצואה משלב 3.1.8 ובצע דילולים סדרתיים עם מדיום BHI כדי להשיג ריכוז של ~50 תאים/מ"ל.
      הערה: כדי למלא את בקבוק הדגימה, הכינו לפחות 40 מ"ל של תרחיף צואה.
   3. ודא שמוט ערבוב מגנטי קטן נמצא בתחתית, שפכו את תרחיף הצואה המדולל לתוך בקבוק הדגימה עד למצב הוספת הדגימה. הברג את המכסה והדק אותו. לאחר מכן, הכניסו את המחבר המהיר A למחבר המהיר B כדי להשלים את תהליך טעינת הדגימה (איור 3A).
   4. הנח את בקבוק הדגימה במיקום המיועד והפרד את המחברים המהירים A ו-B מבקבוק הדגימה. חבר את המחבר המהיר A של בקבוק הדגימה ליציאת O3 במערכת Omics, ומחבר C3 בשבב המיקרו-נוזלי של מיקרו-צינורות וטיפות מתחבר למחבר המהיר B. סגור את הדלת של תא יצירת טיפות וטיפוח (איור 3B).
3. יצירת טיפות
   1. בחר את המספר הרצוי של צינורות טיפות שייווצרו בממשק הבית של התוכנה (איור 2A).
      הערה: כל ריצה יכולה לייצר עד 10 צינורות טיפות, כאשר כל צינור מייצר כ-5,000 טיפות.
   2. נקישה לייצר בממשק הבית של התוכנה כדי להתחיל ביצירת טיפות של תא בודד.
      הערה: ודא אם פריקת משאבת נוזל הפסולת פועלת או לא. במהלך יצירת הטיפות, לכל טיפה יש נפח של 2.0 מיקרוליטר. עיין בפרק הדיון לתיאור של יצירת טיפות.
   3. המתן עד שאזעקת הביפר תציין שיצירת הטיפות הסתיימה. סגור את clamp על מחבר C3 (איור 1E) והסר את בקבוק הדגימה.

4. גידול טיפות

1. בחר את אותו מספר צינורות טיפות כמו במהלך יצירת טיפות בממשק הבית של התוכנה, לחץ על תרבות, אשר את זמן הטיפוח והטמפרטורה והתחל בתהליך. עקוב אחר סרגל ההתקדמות בממשק הביתי המציג את התקדמות הטיפוח והזמן שנותר.
2. המתן עד שאזעקת הביפר תציין כי גידול הטיפות הסתיים. אם יש להאריך את זמן הטיפוח, התאימו את השעה ישירות בממשק ההגדרות .

5. סינון טיפות

1. לחץ על לחצן ה-UV במערכת Omics כדי להדליק אור אולטרה סגול (UV) (איור 1A), להקרין את תא זיהוי הטיפות והאיסוף למשך 30 דקות, ולאחר מכן לכבות את אור ה-UV.
   הערה: לפני הדלקת אור ה-UV, ודא שדלת תא זיהוי הטיפות והאיסוף סגורה.
2. בספסל נקי במיוחד, פתחו את כל צלחות 96 הבארות המשמשות לאיסוף טיפות וערמו אותן זו על גבי זו ללא מכסים, ומספור אותן ברצף מלמטה למעלה. ודא כי צלחת הבאר העליונה מכוסה במכסה.
   הערה: כל ריצה יכולה להכיל עד עשר צלחות של 96 בארות, ומספר הלוחות תלוי במספר הכולל של הטיפות.
3. פתח את הדלת של תא זיהוי ואיסוף הטיפות, הנח את לוחות הבאר במיקומים המיועדים (איור 1D), הוצא את המכסה מלוח הבאר העליון וסגור את דלת החדר.
4. הפעל את נורת ה-UV במערכת Omics למשך 30 דקות כדי לבצע עיקור משני.
5. התקנת מסיר בועות האוויר
   1. הסר את מסיר בועות האוויר ממצב המיקום שלו, הברג את המכסה והסר את הבורג בצורת פרפר מהמכסה (איור 3C).
   2. יוצקים 200 מ"ל משמן הסרת בועות האוויר לתוך מסיר בועות האוויר, הברג את הבקבוק בחוזקה עם המכסה של מסיר בועות האוויר במערכת Omics, ולאחר מכן קבע את המסיר הפוך על מיקום מסיר בועות האוויר. ההתקנה של מסיר בועות האוויר הושלמה.
      הערה: בעת קיבוע מסיר בועות האוויר במיקום, ודא שלא ידלוף שמן החוצה. אם מתרחשת דליפה כלשהי, הדק את המכסה.
6. בחר את צינורות הטיפות למיון בממשק הביתי , לחץ על מיון, הזן את מספר לוחות הבאר שיש לאסוף ולאחר מכן התחל בתהליך. לאחר תחילת סינון הטיפות, התבונן באזור תצוגת התהליך, המציג מדידות בזמן אמת של צפיפות אופטית של טיפות (OD) או ערכי פלואורסצנטיות.
7. נתח כ-20-30 טיפות כדי לבדוק את ערך ה-OD. לדוגמה, אם נמצא שלרוב יש ערך OD של ~0.2, המתאים לערך ה-OD של טיפות ריקות, בהתבסס על התפלגות פואסון, הגדר את סף ה-OD התחתון ל-0.5, ואת סף ה-OD העליון ל-4.0. הטיפות בטווח זה ייאספו אוטומטית ללוחות של 96 בארות (איור 4A).
   הערה: על פי חוק באר-למברט, ערך ה-OD של טיפות ריקות נקבע על ידי הרכב מדיום התרבות בתוך הטיפות. בדרך כלל, סף ה-OD הנמוך יותר מוגדר ב-0.2-0.3 יחידות גבוה יותר מערך ה-OD של טיפות ריקות כדי להבטיח הבחנה ברורה בין טיפות ריקות לטיפות המכילות מיקרואורגניזמים.
8. המתן עד שאזעקת הביפר תציין שסינון ואיסוף הטיפות הסתיימו. פתח את הדלת של תא זיהוי ואיסוף הטיפות, הנח את מכסה לוחית הבאר על צלחת הבאר העליונה, ולאחר מכן הוצא את כל לוחות הבאר מהתא יחד כדי לבצע את הרצף והגיבוי שלאחר מכן.

6. ייצוא נתונים והצגת מפות חום

1. נקישה ייצוא נתונים כדי לשמור את נתוני אות הטיפות שנאספו (איור 4A,B).
2. נקישה מפת חום, בחר את קובץ הנתונים של איסוף הטיפות וצפה בערכי ה-OD של טיפות שנאספו במיקרו-פלטה המוצגת על ידי התוכנה. דמיין את ערכי ה-OD הללו כמפת חום, כאשר עוצמת הצבע תואמת את התפלגות ה-OD על פני הבארות, ומספקת ייצוג ברור ואינטואיטיבי של ערכי ה-OD החד-שבטיים שנאספו (איור 4A,C).

7. ניקוי תא ה- MISS

1. לאחר השלמת הניסוי, בחר את צינור הטיפות הדורש ניקוי, ולחץ על נקה כדי להתחיל בניקוי המכשיר.

8. גיבוי חד שבטי מיקרוביאלי והכנת דגימת ריצוף

1. הכנת מדגם ריצוף
   1. בספסל האנאירובי, הוסיפו 100 מיקרוליטר של מדיום BHI לכל באר של צלחת הטיפות שנאספה, ערבבו היטב על ידי פיפטינג, ואז קחו 10 מיקרוליטר מכל באר והעבירו את הכל לצינור סטרילי אחד של 15 מ"ל. מערבולת לקבלת תרחיף מיקרוביאלי מעורב.
   2. הוסף 5 מ"ל של מי מלח עם חוצץ פוספט לתרחיף המיקרוביאלי המעורב, צנטריפוגה ב-1,000 × גרם למשך 10 דקות, הסר את הסופרנטנט והנח את הגלולה המיקרוביאלית בחנקן נוזלי להקפאה מהירה. הכנת מדגם הרצף הושלמה.
   3. השתמש בשיטות ריצוף אמפליקון 16S rDNA המכוונות לתחום V3 ו-V4 של 16S rDNA. פריימרים לריצוף הספציפיים המשמשים הם כדלקמן: 341F: ACTCCTACGGGAGGCAGCA ו-806R: GGACTACHVGGGTWTCTAAT.
2. שימור הקפאה של מדגם חד שבטי מיקרוביאלי:
   1. לאחר איסוף 10 מיקרוליטר מהדגימה מכל באר בצלחות הטיפות (משלב 8.1.1), הוסף 30 מיקרוליטר גליצרול לכל באר. מניחים את הצלחות מתחת ל-80 מעלות צלזיוס לשימור מתח מיקרוביאלי.

תוצאות

על פי ההערכות, מיקרוביוטת המעיים האנושית, המהווה את הקהילה המיקרוביאלית הדומיננטית, מאכלסת כ-4 × 10¹³ מיקרואורגניזמים במעיים, ומציגה את מספריה העצומים ואת הרכבה המורכב¹¹. במחקר זה, מטרתנו הייתה לבודד ולתרבית את מיקרוביוטת המעיים והשתמשנו בשיטת הצלחת המו?...

Discussion

פרוטוקול זה מתאר את פעולת תא ה-MISS לבידוד, גידול, גילוי ואיסוף חד-שבטיים מיקרוביאליים אוטומטיים ובעלי תפוקה גבוהה. בהשוואה לשיטות מסורתיות שבאמצעותן ניתן היה לבודד ולתרבית רק ~20%-30% ממיקרוביוטת המעיים ^2,12, מספר השיבוטים החד-שבטיים שהתקבלו בא...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	P5731-500EA	For solid plate preparation
30 mL Stool Containers	Boen Healthcare Co., Ltd	611101	For collecting the stool samples
37 °C constant temperature incubator	Shanghai Yiheng Technology Co., Ltd.	LRH-150	Cultivate the solid plate in the incubator
96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates	Corning	3599	For well plate movement detection and droplet collection
Agar	Becton, Dickinson and Company	214010	For solid plate preparation
Air bubble removal oil	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISS cell-S-oil	The oil in the air bubble remover during droplet screening
Air bubble remover	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISS cell-S	Exclude the gas phase between droplets before performing droplet detection and collection
Anaerobic bench	Argon and Nitrogen Space Equipment Business Department, Haiyu Town, Changshu City	VGB-4CM	For aseptic operation and UV sterilization under anaerobic condition
Autoclave	Puhexi Health and Medical Equipment Co., Ltd.	MLS-830L	For autoclaving BHI medium, EP tube, and so on.
Brain Heart Infusion (BHI) Broth	Qingdao High-tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd	HB8297-1	Components of the BHI medium The ingredient list: 38.5 g/L BHI Broth in distilled water
Cell Spreader	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	HS8151	Inoculate the microbial solution onto the solid plate
Centrifuge tube, 15 mL	Beijing Xinhengyan Technology Co., Ltd	HB53397	For microbial solution preparation
Computer	Lenovo	E450	Software installation and MISS cell control
Cryovial	Thermo Fisher	2.0 mL	For stool preservation
Distilled water	Beijing Mreda Technology Co., Ltd.	M306444-100ml	Add into humidifier to keep the humidity in droplet cultivation chamber
EP tube	Thermo Fisher	2.0 mL	For collecting the stool samples
Fluorescent inverted microscope	Olympus Life Science (LS)	CKX53	Check and calculate the microbial concentration
Glycerol	GENERAL-REAGENT	G66258A	For strain preservation
Hemocytometer	Acmec	AYA0810-1ea	Calculate the microbial concentration
KCl	Ambeed	A442876	Components of phosphate buffered saline (PBS solution)The ingredient list: 8 g/L NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4 in distilled water
KH2PO4	MACKLIN	P815661	Components of phosphate buffered saline (PBS solution)The ingredient list: 8 g/L NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4 in distilled water
Mesh filter	Anping Jiufeng Wire Mesh Manufacturing Co., Ltd	200 mesh (0.075 mm), 400 mesh (0.038 mm), 800 mesh (0.018 mm)	Remove undigested food and smaller particulate matter from the stool samples
Micro-tubing and droplet generation microfluidic chip	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISC-B2	For droplet generation and droplet incubation
MISS cell oil	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISS cell-BOS-B	The oil phase for droplet microfluidics
MISS cell software	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISS cell V3.2.4	Perform experimental operations on the MISS cell instrument
Na2HPO4	Solarbio	D7292	Components of phosphate buffered saline (PBS solution)The ingredient list: 8 g/L NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4 in distilled water
NaCl	GENERAL-REAGENT	G81793J	Components of the physiological saline solution The ingredient list: 9 g/L NaCl in distilled water
Pipette	eppendorf	2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL	For liquid handling
Polytetrafluoroethylene tube	Shenzhen WOER Heat-shrinkable Material Co., Ltd.	3401000141	For droplet incubation. This material was already included in micro-tubing and droplet generation microfluidic chip
Sample bottle	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISS cell-bottle	Sampling of microbial solution
Single Cell Microliter-droplet Culture Omics System (MISS cell)	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISS cell-G3f	Performing the microbial monoclonal isolation, cultivation, detection and collection
Superspeed Centrifuge	Thermo Fisher	Sorvall Lynx 4000	Prepare the microbial solution for sequencing
Syringe	Jiangsu Zhiyu Medical Instructment Co., Ltd	10 mL	Draw the distilled water and inject it into the humidifier in droplet cultivation chamber
Ultra low temperature refrigerator	SANYO Ultra-low	MDF-U4086S	For strain preservation (-80 °C)