Tek Hücreli Mikrolitre Damlacık Kültürü Omik Sistemini Kullanarak Otomatik ve Yüksek Verimli Mikrobiyal Monoklonal Yetiştirme ve Toplama

Özet

Bu protokol, mikrobiyal monoklonal izolasyon, yetiştirme ve toplama işlemlerini gerçekleştirmek için Tek hücreli Mikrolitre damlacık Kültür Omik Sisteminin (MISS hücresi) nasıl kullanılacağını açıklar. MISS hücresi, mükemmel damlacık monodispersisitesi, yüksek paralel yetiştirme ve yüksek verimli biyokütle tespiti sunan damlacık mikroakışkan teknolojisine dayalı entegre bir iş akışı sağlar.

Özet

Saf bakteri kültürleri, mikrobiyal kültür çalışmaları için gereklidir. Katı plakalara, kuyu plakalarına ve mikro reaktörlere dayalı geleneksel yöntemler, hantal prosedürler ve düşük verim nedeniyle engellenerek mikrobiyal kültür araştırmalarının hızlı ilerlemesini engellemektedir. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, mikrobiyal monoklonal izolasyon, yetiştirme ve tarama için damlacık mikroakışkan teknolojisini kullanan otomatik bir yüksek verimli platform olan Tek Hücreli Mikrolitre damlacık Kültür Omik Sistemini (MISS hücresi) başarıyla geliştirdik. Bu sistem, çok sayıda tek hücreli damlacık üretebilir ve kısa sürede monoklonal kolonileri yetiştirebilir, tarayabilir ve toplayabilir, bu da mikrobiyal izolasyondan toplamaya kadar entegre bir süreci kolaylaştırır. Bu protokolde, örnek olarak insan bağırsak mikrobiyotasının izolasyonu ve kültivasyonunu kullanarak uygulamasını gösterdik ve katı plaka kültürü yöntemini kullanarak mikrobiyal izolasyon verimliliğini, monoklonal kültür performansını ve tarama verimini karşılaştırdık. Deneysel iş akışı basitti ve reaktif tüketimi çok düşüktü. Katı plaka kültürü yöntemleriyle karşılaştırıldığında, MISS hücresi, mikrobiyal kültür araştırmaları için önemli bir potansiyel ve değer sunarak daha fazla çeşitlilikte bağırsak mikrobiyota türü yetiştirebilir.

Giriş

Mikrobiyal kültüromik, gıda endüstrisindeki faydalı mikropların araştırılmasında, çevresel mikropların çeşitliliğinde, yeni antimikrobiyal bileşiklerin taranmasında ve hastalık 1,2,3,4 ile ilgili olarak insan mikrobiyomunda geniş uygulamalara sahiptir. Monoklonal kolonileri elde etmek ve seçmek için esas olarak katı plakalara, kuyu plakalarına veya mikro reaktörlere dayanan geleneksel yöntemlerin kullanımı kolaydır, ancak çoklu adımları nedeniyle düşük verimden muzdariptir. Bu sınırlama, tümü kapsamlı monoklonal tarama gerektiren mikrobiyal mutajenez taraması, mikrobiyal kültür çalışmaları ve yüksek verimli koloni seçimi gibi uygulamaları engeller.

Son zamanlarda, mikrobiyal numunelerin işleme hızını önemli ölçüde artırırken, işçiliği azaltmak ve manuel kullanımdan kaynaklanan hataları en aza indirmek için çeşitli tek hücreli algılama ve dağıtma cihazları tasarlanmıştır⁵. Bununla birlikte, bu cihazlar tipik olarak geleneksel yöntemlerde yalnızca belirli adımları ele alır, genellikle kapsamlı ekipman entegrasyonu gerektirir, önemli ölçüde yer kaplar ve yüksek maliyetlere neden olur. Bu nedenle, yukarıda belirtilen eksiklikleri telafi etmek için düşük maliyetli, evrensel olarak uygulanabilir bir mikrobiyal kültür ve tarama platformu geliştirmeye acil bir ihtiyaç vardı.

Önceki çalışmalarımızda, Tek Hücreli Mikrolitre damlacık Kültür Omik Sistemi (MISS hücresi, bundan böyle "Omik sistemi" olarak anılacaktır)⁶ olarak bilinen otomatik, yüksek verimli bir tarama platformunu başarıyla geliştirdik. Bu platform, mikrobiyal izolasyon, yetiştirme ve^toplama 7,8,9,10'da otomasyon ve entegrasyon sağlama sözü veren damlacık mikroakışkan teknolojisini kullanır. Omics sistemi, mikrobiyoloji araştırmalarında verimli tek hücre izolasyonu, kültivasyon, monoklonal tarama ve toplama sağlayan bir örnekleme modülü, mikroakışkan çip, damlacık algılama ve toplama sistemi dahil olmak üzere birkaç temel modülden oluşur. Corynebacterium glutamicum^6'nın yüksek verimli mutajenez taramasını elde etmek için Omics sistemini zaten kullandık.

Omics sisteminin otomasyon ve yüksek verimli tarama yetenekleri nedeniyle, mikrobiyal kültüre uygulanmasının büyük miktarda mikrobiyal veriyi hızlı bir şekilde elde etmesi beklenmektedir. Bu protokolde, mikrobiyal tek hücre izolasyonu, kültivasyon, monoklonal tespit ve tarama sürecini göstermek için bir örnek olarak insan bağırsak mikrobiyotasının izolasyonu ve kültivasyonu ile MISS hücresinin ayrıntılı operasyonel prosedürünü tanıttık. Omics sisteminin çalışması basittir ve araştırmacıların yalnızca mikro boru ve damlacık üretimi mikroakışkan çipinin sıralı kurulumu, parametre ayarları ve numune hazırlama için yazılım yönünü takip etmeleri gerekir.

Yazılım işletim arayüzünde, Omics sistemi üç ana işleve ayrılmıştır: izolasyon, yetiştirme ve tarama. Araştırmacılar deneye göre farklı aşamalar seçebilirler. Ayrıca, damlacık tarama aşamasında, araştırmacılar iki algılama modundan birini seçebilirler: floresan sinyali veya optik yoğunluk. Yazılım, damlacık tarama işleminin gerçek zamanlı görselleştirilmesini sağlar. Son olarak, araştırmacılar kültür koşulları, tespit edilen dalga boyu ve toplama kuyularının sayısı gibi parametreleri kendi özel deneysel taleplerine göre yapılandırma esnekliğine sahiptir ve diğer işlemleri gerçekleştirmek için cihazı istedikleri zaman duraklatabilirler. MISS hücresi, basit kullanım ve minimum reaktif tüketimi ile mikrop dostu, yüksek verimli bir monoklonal tarama platformudur.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm çalışma prosedürleri ilgili tüm etik düzenlemelere uygundur. Prosedürler Tsinghua Üniversitesi Bilim ve Teknoloji Etik Komitesi tarafından onaylandı. İnsan bağırsak mikrobiyotasını incelemek için, önemli bir tıbbi durumu olmayan ve yazılı bilgilendirilmiş onam veren sağlıklı bir yetişkinden dışkı örnekleri toplandı.

1. Enstrüman kurulumu

1. Omics sistem cihazını temiz veya steril bir ortama (steril oda veya anaerobik tezgah gibi) yerleştirin. Cihaz hassas bir cihazdır ve tesise yerleştirirken aşağıdakileri göz önünde bulundurun:
   1. Cihazı normal basınç ve sıcaklık altında tutun.
   2. Cihazı güçlü elektrik alanlarından, manyetik alanlardan ve ısı radyasyonu kaynaklarından uzak tutun.
   3. Cihaz yerleştirme alanının 2.500 mm (D) x 1.500 mm (G) x 2.000 mm (Y) boyutlarını aştığından emin olun.
   4. Cihazın çevresel nemini %60'ın altında tutun.

2. Hazırlıklar

1. Omics sisteminin, bilgisayarın ve Omics sistemi işletim yazılımının gücünü sırayla açın.
2. MISS hücre mikro boru ve damlacık üretimi mikroakışkan çip kurulumu:
   1. Damlacık oluşturma ve yetiştirme odasının kapısını açın (Şekil 1A) ve mikro boru ve damlacık oluşturma mikroakışkan çipi için koruyucu kapağı dikey olarak çıkarın. Damlacık yetiştirme odasının içindeki nemlendiriciye 10 mL steril damıtılmış su eklemek için tek kullanımlık bir şırınga kullanın (Şekil 1C) ve mikro boru ve damlacık üretimi mikroakışkan çipi için koruyucu kapağı yeniden takın.
   2. Mikro boru ve damlacık oluşturma mikroakışkan çipinin steril ambalajını açın ve dikey olarak doğrudan yetiştirme odasının üzerine yerleştirin (Şekil 1C).
   3. Yazılım arayüzünde, Kurulum'a tıklayın (Şekil 2A). Bu noktada, şu istemi içeren bir açılır pencere belirir: Mikro boru ve damlacık oluşturma mikroakışkan çipinin değiştirilmesini onaylayın? Yüklemeyi başlatmak için Evet'e tıklayın.
   4. Hava kabarcığı çıkarıcıyı çıkarın ve damlacık oluşturma ve yetiştirme odasındaki hava kabarcığı çıkarıcı yerleşimine baş aşağı sabitleyin. Hava kabarcığı çıkarıcının damlacık giriş ve çıkış borularına bastırmamaya dikkat edin (Şekil 1E).
   5. Hava kabarcığı çıkarıcının damlacık çıkış borusunu altındaki sıkıştırma valfine takın ve damlacık algılama ve toplama odasına yönlendirilen delikten geçmesine izin verin (Şekil 1B).
   6. Damlacık algılama ve toplama odasının kapısını açın, damlacık çıkış borusuna zaten bağlı olan algılama tüpünü algılama soketine dikey olarak yerleştirin ve algılama tüpünün tam olarak yerleştirildiğinden emin olun (Şekil 1D).
      NOT: Algılama tüpünü yerleştirirken, tüp üzerinde herhangi bir bükülme olmadan dikey olarak yerleştirin.
   7. Algılama tüpünü sabitleyen vidayı saat yönünde sıkın. Algılama tüpünün tam olarak yerleştirildiğini ve sabitlendiğini onayladıktan sonra, damlacık algılama ve toplama odasının kapısını kapatın.
   8. Mikro boru ve damlacık oluşturma mikroakışkan çipinden, her biri bir numara (L01-L10) ile etiketlenmiş 10 silikon tüp vardır. Etiketli her tüpü ilgili numaralı kelepçe valfine (01-10) bağlayın (Şekil 1C).
   9. Mikro boru ve damlacık oluşturma mikroakışkan çipinden gelen hızlı konektörü Omics sistemindeki ilgili bağlantı noktasına bağlayın: C1'den O1'e, C2'den O2'ye, C4'ten O4'e ve CF'den OF'ye.
      NOT: Mikro boru ve damlacık oluşturma mikroakışkan çipinin kurulumu tamamlanmıştır. C3'ün O3'e bağlanmasına gerek yoktur.
   10. Mikro boru ve damlacık üretimi mikroakışkan çip kurulumu tamamlandıktan sonra, Damlacık borusu sıkıştırma valfinin açılmasını isteyen bir açılır pencere belirir. Mikro tüp ve damlacık oluşturma mikroakışkan çip kurulumu tamamlandığında Tamam'a tıklayın. Mikro boru ve damlacık oluşturma mikroakışkan çipindeki tüm silikon tüplerin ilgili kelepçe valfine takıldığından emin olduktan sonra, Tamam'a tıklayın.
3. Enstrüman başlatma
   1. Başlatmayı gerçekleştirmeden önce, ilgili parametreleri yapılandırmak için Ayar arayüzüne (Şekil 2B) tıklayın: algılama modu (OD tabanlı veya floresan tabanlı algılama; OD burada), inkübasyon sıcaklığı (37 °C) ve zaman (30 gün = 720 saat), karıştırıcı hızı (20 rpm), OD algılamanın dalga boyu (600 nm) ve floresan algılamanın uyarma ve emisyon dalga boyu.
      NOT: Bu protokolde insan bağırsak mikrobiyotasının izolasyonu ve kültivasyonu için kullanılan parametreler parantez içinde verilmiştir. Parametreleri ayarlarken, yetiştirme sıcaklığı 5 °C ile 50 °C arasında olmalıdır. Algılama modunu seçerken, damlacık algılama modülündeki fiber aynı değilse optik fiber değiştirilmelidir (bkz. adım 2.3.2). Parametreleri yapılandırırken, yağ fazı referans değeri (temel spektral) yazılım tarafından otomatik olarak tanımlanır ve manuel ayarlama ihtiyacını ortadan kaldırır.
   2. Tespit edilen optik fiberin değiştirilmesi
      1. Algılanan fiberi fiber tutucudan çıkarın (saat yönünün tersine çevirerek çıkarın) ve damlacık modülündeki fiber sabitleme vidasını gevşetin (Şekil 1D).
      2. Optik fiber kullanılmayacaksa, modülden çıkarın, fiber tutucuya takın ve sıkın. Algılanan fiberi algılama portuna yerleştirin ve modüldeki fiber sabitleme vidasını sıkın. Optik fiberin değiştirilmesi tamamlandı.
   3. Ana arayüze dönün ve Başlat'a tıklayın Omics sisteminin enjeksiyon pompası, sıcaklık ayarları, atık sıvı boşaltma testi, tarama modülü ve damlacık algılama modülü dahil olmak üzere bileşenlerini kendi kendine kontrol etmesine izin vermek için.
      1. Başlatma sırasında, atık sıvı portuna 1 mL %75 alkol enjekte ederek ve sıvının normal şekilde akıp akmadığını gözlemleyerek damlacık algılama modülünden atık sıvı boşaltma testi gerçekleştirin.
      2. Tarama modülü testi için, plaka yerleşimine 96 oyuklu bir plaka yerleştirin ve plaka hareketinin normal olup olmadığını gözlemleyin.

3. Damlacık oluşumu

1. İnsan bağırsak mikrobiyota örneklerinin toplanması ve işlenmesi
   1. Bir hazne kabı ve dışkı kapları hazırlayın, ellerinizi yıkayın ve taze dışkı örnekleri toplamak için eldiven giyin.
      NOT: Dışkı örnekleri toplarken, idrar kontaminasyonundan mümkün olduğunca kaçının. Önceden idrara çıkmak ve dışkıyı temiz, kuru bir kaba koymak daha iyidir.
   2. Uygun miktarda orta segment dışkıyı aseptik olarak toplayın ve sterilize edilmiş kriyoviyallerde (flakon başına yaklaşık 3-5 g) kapatın. Daha sonra alıntılama ve etiketleme için şişeleri hemen buzun üzerine yerleştirin.
      NOT: Dışkı örneği büyükse veya hemen alınamıyorsa, en fazla 2 saat içinde toplanmalıdır.
   3. Anaerobik tezgahta, orta segment numunesi toplamak için steril bir çubuk veya dışkı numune alma aleti kullanın.
      NOT: Dışkı yüzey tabakası dökülmüş bağırsak mukozal hücreleri içerir ve dış kontaminasyona eğilimlidir; havaya maruz kaldıktan sonra, bazı mikrobiyal DNA'lar bozulmaya başlar.
   4. Toplanan dışkı örneklerini, her biri 0.5-2.0 g dışkı içerecek şekilde 2 mL steril mikrosantrifüj tüplerine veya steril kriyoviyallere aktarın. Numune başına dondurmak için iki alikot hazırlayın.
   5. Taze dışkı örneğini steril fizyolojik tuzlu su çözeltisi içinde yeniden süspanse edin, her 100 mg dışkı 1 mL çözelti içinde seyreltilir. Büyük parçacıklar görünmeyene kadar dışkıyı iyice karıştırın.
   6. 10 dakika boyunca doğal çökeltmeden sonra, sindirilmemiş yiyecekleri ve daha küçük partikül maddeleri uzaklaştırmak için süpernatanı 200 gözenekli (0,075 mm), 400 gözenekli (0,038 mm) ve 800 gözenekli (0,018 mm) gözenekli filtrelerden sırayla süzün. Son olarak, süzüntüyü steril santrifüj tüplerinde toplayın.
   7. Filtrelenmiş dışkı süspansiyonunun 10 μL'sini alın ve bir hemositometre ve ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu kullanarak mikrobiyal konsantrasyonu belirleyin.
      NOT: Dışkı numunesi süpernatanı farklı ağ boyutlarında filtreledikten sonra, bazı küçük dışkı parçacıkları kalır. Bu nedenle, mikrobiyal konsantrasyonu belirlerken, mikroskop altında gözlemlenen aktif partiküller mikroorganizma olarak kabul edilir ve bu da mikrobiyal konsantrasyonun yalnızca yaklaşık olarak hesaplanmasına izin verir.
   8. Dışkı süspansiyonunu 1.5 mL'lik bir steril santrifüj tüpüne aktarın ve tarih, mikrobiyal konsantrasyon ve numune adı ile etiketleyin. Bir kısmını sonraki deneyler için ayırın ve geri kalanını ileride kullanmak üzere 4 °C'de saklayın.
      NOT: Numunelerin aynı anda toplandığından emin olmak için numune bilgilerini (numune adı, toplama zamanı) derhal kaydedin (memeli bağırsağı mikrobiyal temporal ritim değişiklikleri göz önünde bulundurularak). Tüm numune toplama ve işleme anaerobik bir ortamda gerçekleştirilmelidir.
2. İlk dışkı süspansiyonu için hazırlık
   1. Beyin Kalp Suyu (BHI) ortamını üreticinin protokolüne göre hazırlayın ve 121 °C'de 15 dakika otoklavlayarak sterilize edin.
   2. Adım 3.1.8'den fekal süspansiyonu alın ve ~ 50 hücre / mL'lik bir konsantrasyon elde etmek için BHI ortamı ile seri seyreltmeler gerçekleştirin.
      NOT: Numune şişesini doldurmak için en az 40 mL dışkı süspansiyonu hazırlayın.
   3. Altta küçük bir manyetik karıştırma çubuğu olduğundan emin olarak, seyreltilmiş dışkı süspansiyonunu numune ekleme konumuna kadar numune şişesine dökün. Kapağı vidalayın ve sıkın. Ardından, numune yükleme işlemini tamamlamak için hızlı konektör A'yı hızlı konektör B'ye takın (Şekil 3A).
   4. Numune şişesini belirtilen konuma yerleştirin ve numune şişesinden A ve B hızlı konektörlerini ayırın. Numune şişesinin hızlı konektörünü A'yı Omics sistemindeki O3 bağlantı noktasına bağlayın ve mikro boru ve damlacık oluşturma mikroakışkan çipindeki C3 konektörünü hızlı konektör B'ye bağlayın. Damlacık oluşturma ve yetiştirme odasının kapısını kapatın (Şekil 3B).
3. Damlacık üretimi
   1. Yazılımın ana arayüzünde oluşturulacak istenen damlacık hortumu sayısını seçin (Şekil 2A).
      NOT: Her çalıştırma, her tüp yaklaşık 5.000 damlacık üreten 10 adede kadar damlacık borusu üretebilir.
   2. Tek hücreli damlacık üretimini başlatmak için yazılımın ana arayüzünde Üret'e tıklayın.
      NOT: Atık sıvı pompasının tahliyesinin çalışıp çalışmadığını onaylayın. Damlacık üretimi sırasında, her damlacık 2.0 μL'lik bir hacme sahiptir. Damlacık oluşumunun açıklaması için tartışma bölümüne bakın.
   3. Sesli uyarı alarmının damlacık oluşumunun bittiğini göstermesini bekleyin. cl'yi kapatınamp C3 konektörü üzerindeki (Şekil 1E) ve s'yi çıkarın.amp şişe.

4. Damlacık yetiştiriciliği

1. Yazılımın ana arayüzünde damlacık oluşturma sırasındakiyle aynı damlacık boru numarasını seçin, Kültür'e tıklayın, yetiştirme süresini ve sıcaklığını onaylayın ve işleme başlayın. Yetiştirme ilerlemesini ve kalan süreyi gösteren ana arayüzdeki ilerleme çubuğunu izleyin.
2. Sesli uyarı alarmının damlacık ekiminin bittiğini göstermesini bekleyin. Yetiştirme süresinin uzatılması gerekiyorsa, süreyi doğrudan Ayar arayüzünde ayarlayın.

5. Damlacık taraması

1. Ultraviyole (UV) ışığını açmak için Omics sistemindeki UV düğmesine basın (Şekil 1A), damlacık algılama ve toplama odasını 30 dakika boyunca ışınlayın ve ardından UV ışığını kapatın.
   NOT: UV ışığını açmadan önce, damlacık algılama ve toplama haznesinin kapısının kapalı olduğundan emin olun.
2. Süper temiz bir tezgahta, damlacıkları toplamak için kullanılan 96 oyuklu plakaların tümünü açın ve bunları aşağıdan yukarıya doğru sırayla numaralandırarak kapaksız olarak üst üste istifleyin. Üst kuyu plakasının bir kapakla kapatıldığından emin olun.
   NOT: Her çalıştırma, on adede kadar 96 oyuklu plakayı barındırabilir ve plaka sayısı, toplam damlacık sayısına bağlıdır.
3. Damlacık algılama ve toplama haznesinin kapısını açın, kuyu plakalarını belirlenen konumlara yerleştirin (Şekil 1D), kapağı üst kuyu plakasından çıkarın ve haznenin kapısını kapatın.
4. İkincil sterilizasyonu gerçekleştirmek için Omics sistemindeki UV ışığını 30 dakika boyunca açın.
5. Hava kabarcığı çıkarıcının montajı
   1. Hava kabarcığı çıkarıcıyı yerleştirme konumundan çıkarın, kapağı sökün ve kelebek şeklindeki vidayı kapaktan çıkarın (Şekil 3C).
   2. 200 mL hava kabarcığı giderici yağı hava kabarcığı çıkarıcıya dökün, şişeyi Omics sistemindeki hava kabarcığı çıkarıcının kapağıyla sıkıca vidalayın ve ardından çıkarıcıyı hava kabarcığı çıkarıcı yerleşimine baş aşağı sabitleyin. Hava kabarcığı çıkarıcının kurulumu tamamlandı.
      NOT: Hava kabarcığı çıkarıcıyı yerleşime sabitlerken, yağ sızıntısı olmadığından emin olun. Herhangi bir sızıntı meydana gelirse, kapağı sıkın.
6. Ev arayüzünde sıralama için damlacık borusunu seçin, Sıralama'ya tıklayın, toplanacak kuyu plakalarının sayısını girin ve ardından işlemi başlatın. Damlacık taraması başladıktan sonra, damlacık optik yoğunluğunun (OD) veya floresan değerlerinin gerçek zamanlı ölçümlerini gösteren proses ekranları alanını gözlemleyin.
7. OD değerini kontrol etmek için yaklaşık 20-30 damlacığı analiz edin. Örneğin, çoğunluğun boş damlacıkların OD değerine karşılık gelen ~0.2'lik bir OD değerine sahip olduğu bulunursa, Poisson dağılımına dayalı olarak, alt OD eşiğini 0.5 ve üst OD eşiğini 4.0 olarak ayarlayın. Bu aralıktaki damlacıklar otomatik olarak 96 oyuklu plakalarda toplanacaktır (Şekil 4A).
   NOT: Beer-Lambert Yasasına göre, boş damlacıkların OD değeri, damlacıklar içindeki kültür ortamı bileşimi tarafından belirlenir. Tipik olarak, düşük OD eşiği, boş damlacıklar ile mikroorganizma içeren damlacıklar arasında net bir ayrım sağlamak için boş damlacıkların OD değerinden 0.2-0.3 birim daha yüksek olarak ayarlanır.
8. Sesli uyarı alarmının damlacık taramasının ve toplamanın bittiğini göstermesini bekleyin. Damlacık algılama ve toplama odasının kapısını açın, kuyu plakası kapağını üst kuyu plakasına yerleştirin ve ardından sonraki sıralama ve yedeklemeyi gerçekleştirmek için tüm kuyu plakalarını birlikte odadan çıkarın.

6. Veri aktarımı ve ısı haritalarının görüntülenmesi

1. Toplanan damlacık sinyali verilerini kaydetmek için Verileri dışa aktar'a tıklayın (Şekil 4A,B).
2. Isı haritası'na tıklayın, damlacık toplama veri dosyasını seçin ve yazılım tarafından görüntülenen mikroplakada toplanan damlacıkların OD değerlerini gözlemleyin. Bu OD değerlerini, renk yoğunluğunun kuyular boyunca OD dağılımına karşılık geldiği ve toplanan monoklonal OD değerlerinin net ve sezgisel bir temsilini sağlayan bir ısı haritası olarak görselleştirin (Şekil 4A,C).

7. MISS hücresinin temizlenmesi

1. Deneyi tamamladıktan sonra, temizlenmesi gereken damlacık borusunu seçin ve cihaz temizliğini başlatmak için Temizle'ye tıklayın.

8. Mikrobiyal monoklonal yedekleme ve dizileme numune hazırlama

1. Sıralama numunesi hazırlama
   1. Anaerobik tezgahta, toplanan damlacık plakasının her bir oyuğuna 100 μL BHI besiyeri ekleyin, pipetleme ile iyice karıştırın ve ardından her oyuktan 10 μL alın ve hepsini 15 mL'lik bir steril tüpe aktarın. Karışık bir mikrobiyal süspansiyon elde etmek için girdap.
   2. Karışık mikrobiyal süspansiyona 5 mL fosfat tamponlu salin ekleyin, 1.000 × g'da 10 dakika santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve mikrobiyal peleti hızlı dondurma için sıvı nitrojene yerleştirin. Sıralama numunesi hazırlığı tamamlandı.
   3. 16S rDNA'nın V3 ve V4 alanını hedefleyen 16S rDNA amplikon dizileme yöntemlerini kullanın. Kullanılan spesifik sıralama primerleri aşağıdaki gibidir: 341F: ACTCCTACGGGAGGCAGCA ve 806R: GGACTACHVGGGTWTCTAAT.
2. Mikrobiyal monoklonal numune kriyoprezervasyonu:
   1. Damlacık plakalarındaki her bir oyuktan 10 μL numune topladıktan sonra (adım 8.1.1'den itibaren), her oyuğa 30 μL gliserol ekleyin. Mikrobiyal suşun korunması için plakaları -80 °C'nin altına yerleştirin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Baskın mikrobiyal topluluğu oluşturan insan bağırsak mikrobiyotasının, bağırsakta yaklaşık 4 × 10¹³ mikroorganizma barındırdığı tahmin edilmektedir, bu da çok sayıda ve karmaşık bileşimini sergilemektedir¹¹. Bu çalışmada, bağırsak mikrobiyotasını izole etmeyi ve kültürlemeyi amaçladık ve MISS hücresinin yüksek verimli performansını göstermek için katı plaka yöntemini kontrol olarak kullandık.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu protokol, otomatik ve yüksek verimli mikrobiyal monoklonal izolasyon, yetiştirme, tespit ve toplama için MISS hücresinin çalışmasını ana hatlarıyla belirtir. Bağırsak mikrobiyotasının sadece ~%20-30'unun izole edilebildiği ve kültürlenebildiği^geleneksel yöntemlerle karşılaştırıldığında ^2,12, Omics sistemi kullanılarak elde edilen monoklonal klonların sayısı katı plakalardan elde edilenlerden 1,9...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	P5731-500EA	For solid plate preparation
30 mL Stool Containers	Boen Healthcare Co., Ltd	611101	For collecting the stool samples
37 °C constant temperature incubator	Shanghai Yiheng Technology Co., Ltd.	LRH-150	Cultivate the solid plate in the incubator
96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates	Corning	3599	For well plate movement detection and droplet collection
Agar	Becton, Dickinson and Company	214010	For solid plate preparation
Air bubble removal oil	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISS cell-S-oil	The oil in the air bubble remover during droplet screening
Air bubble remover	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISS cell-S	Exclude the gas phase between droplets before performing droplet detection and collection
Anaerobic bench	Argon and Nitrogen Space Equipment Business Department, Haiyu Town, Changshu City	VGB-4CM	For aseptic operation and UV sterilization under anaerobic condition
Autoclave	Puhexi Health and Medical Equipment Co., Ltd.	MLS-830L	For autoclaving BHI medium, EP tube, and so on.
Brain Heart Infusion (BHI) Broth	Qingdao High-tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd	HB8297-1	Components of the BHI medium The ingredient list: 38.5 g/L BHI Broth in distilled water
Cell Spreader	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	HS8151	Inoculate the microbial solution onto the solid plate
Centrifuge tube, 15 mL	Beijing Xinhengyan Technology Co., Ltd	HB53397	For microbial solution preparation
Computer	Lenovo	E450	Software installation and MISS cell control
Cryovial	Thermo Fisher	2.0 mL	For stool preservation
Distilled water	Beijing Mreda Technology Co., Ltd.	M306444-100ml	Add into humidifier to keep the humidity in droplet cultivation chamber
EP tube	Thermo Fisher	2.0 mL	For collecting the stool samples
Fluorescent inverted microscope	Olympus Life Science (LS)	CKX53	Check and calculate the microbial concentration
Glycerol	GENERAL-REAGENT	G66258A	For strain preservation
Hemocytometer	Acmec	AYA0810-1ea	Calculate the microbial concentration
KCl	Ambeed	A442876	Components of phosphate buffered saline (PBS solution)The ingredient list: 8 g/L NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4 in distilled water
KH2PO4	MACKLIN	P815661	Components of phosphate buffered saline (PBS solution)The ingredient list: 8 g/L NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4 in distilled water
Mesh filter	Anping Jiufeng Wire Mesh Manufacturing Co., Ltd	200 mesh (0.075 mm), 400 mesh (0.038 mm), 800 mesh (0.018 mm)	Remove undigested food and smaller particulate matter from the stool samples
Micro-tubing and droplet generation microfluidic chip	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISC-B2	For droplet generation and droplet incubation
MISS cell oil	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISS cell-BOS-B	The oil phase for droplet microfluidics
MISS cell software	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISS cell V3.2.4	Perform experimental operations on the MISS cell instrument
Na2HPO4	Solarbio	D7292	Components of phosphate buffered saline (PBS solution)The ingredient list: 8 g/L NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4 in distilled water
NaCl	GENERAL-REAGENT	G81793J	Components of the physiological saline solution The ingredient list: 9 g/L NaCl in distilled water
Pipette	eppendorf	2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL	For liquid handling
Polytetrafluoroethylene tube	Shenzhen WOER Heat-shrinkable Material Co., Ltd.	3401000141	For droplet incubation. This material was already included in micro-tubing and droplet generation microfluidic chip
Sample bottle	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISS cell-bottle	Sampling of microbial solution
Single Cell Microliter-droplet Culture Omics System (MISS cell)	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISS cell-G3f	Performing the microbial monoclonal isolation, cultivation, detection and collection
Superspeed Centrifuge	Thermo Fisher	Sorvall Lynx 4000	Prepare the microbial solution for sequencing
Syringe	Jiangsu Zhiyu Medical Instructment Co., Ltd	10 mL	Draw the distilled water and inject it into the humidifier in droplet cultivation chamber
Ultra low temperature refrigerator	SANYO Ultra-low	MDF-U4086S	For strain preservation (-80 °C)