JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этом протоколе описывается, как использовать систему омикса культуры микролитровых капель (MISS cell) для выделения, культивирования и сбора микробных моноклональных клеток. Ячейка MISS обеспечивает интегрированный рабочий процесс на основе капельной микрофлюидной технологии, которая обеспечивает превосходную монодисперсность капель, высокую параллельность культивирования и высокую производительность обнаружения биомассы.

Аннотация

Чистые бактериальные культуры необходимы для изучения микробной культуромики. Традиционные методы, основанные на твердотельных планшетах, луночных планшетах и микрореакторах, затрудняются громоздкими процедурами и низкой пропускной способностью, что препятствует быстрому прогрессу исследований микробной культуры. Для решения этих проблем мы успешно разработали систему Single-cell Microliter-droplet Culture Omics System (MISS cell) — автоматизированную высокопроизводительную платформу, которая использует микрофлюидную технологию капель для выделения, культивирования и скрининга микробных моноклональных культур. Эта система может генерировать большое количество капель одиночных клеток и культивировать, экранировать и собирать моноклональные колонии за короткое время, облегчая интегрированный процесс от микробной изоляции до сбора. В этом протоколе мы продемонстрировали его применение на примере выделения и культивирования микробиоты кишечника человека и сравнили эффективность микробной изоляции, эффективность моноклонального культивирования и производительность скрининга с использованием метода сплошной культуры. Экспериментальный процесс был простым, а расход реагентов очень низким. По сравнению с методами культивирования на твердых планшетах, клетка MISS может культивировать большее разнообразие видов кишечной микробиоты, предлагая значительный потенциал и ценность для исследований микробной культуромики.

Введение

Микробная культуромика имеет широкое применение в исследовании полезных микробов в пищевой промышленности, разнообразия микробов окружающей среды, скрининге новых антимикробных соединений и микробиома человека в связи с болезнями 1,2,3,4. Традиционные методы, в первую очередь основанные на твердых планшетах, луночных планшетах или микрореакторах для получения и отбора моноклональных колоний, просты в эксплуатации, но имеют низкую пропускную способность из-за их многоступенчатости. Это ограничение препятствует таким приложениям, как скрининг микробного мутагенеза, исследования микробной культуромики и селекция высокопродуктивных колоний, которые требуют обширного моноклонального скрининга.

В последнее время были разработаны различные устройства для обнаружения и диспенсирования одиночных клеток, которые значительно повышают скорость обработки микробных образцов при одновременном снижении трудозатрат и минимизации ошибок при ручной обработке5. Тем не менее, эти инструменты обычно предназначены только для определенных этапов в рамках традиционных методов, часто требующих обширной интеграции оборудования, занимающих значительное пространство и несущих высокие затраты. В связи с этим возникла острая необходимость в разработке недорогой, универсально применимой платформы для микробного культивирования и скрининга, чтобы компенсировать упомянутые выше недостатки.

В нашей предыдущей работе мы успешно разработали автоматизированную высокопроизводительную платформу скрининга, известную как Single-cell Microliter-droplet-Culture Culture Omics System (MISS cell, далее именуемая «Omics-система»)6. Эта платформа использует капельную микрофлюидную технологию, которая обещает достичь автоматизации и интеграции в микробной изоляции, культивировании исборе 7,8,9,10. Система Omics состоит из нескольких ключевых модулей, включая модуль отбора проб, микрофлюидный чип, систему обнаружения и сбора капель, что позволяет эффективно выделять одиночные клетки, культивировать, моноклональный скрининг и собирать в микробиологических исследованиях. Мы уже использовали систему Omics для достижения высокопроизводительного скрининга мутагенеза Corynebacterium glutamicum6.

Благодаря автоматизации и высокопроизводительным возможностям скрининга системы Omics, ожидается, что ее применение в микробной культуромике позволит быстро получить большой объем микробиологических данных. В этом протоколе мы представили подробную операционную процедуру MISS-клетки на примере выделения и культивирования кишечной микробиоты человека, чтобы продемонстрировать процесс выделения, культивирования, моноклонального обнаружения и скрининга микробных одиночных клеток. Работа с системой Omics проста, и исследователям нужно только следовать указаниям программного обеспечения для последовательной установки микротрубок и микрофлюидного чипа для генерации капель, настройки параметров и подготовки образцов.

В интерфейсе работы программного обеспечения система Omics разделена на три основные функции: изоляция, выращивание и скрининг. Исследователи могут выбирать разные этапы в соответствии с экспериментом. Кроме того, на этапе скрининга капель исследователи могут выбрать один из двух режимов обнаружения: флуоресцентный сигнал или оптическая плотность. Программное обеспечение обеспечивает визуализацию процесса просеивания капель в режиме реального времени. Наконец, исследователи имеют возможность конфигурировать такие параметры, как условия культивирования, обнаруженная длина волны и количество сборных лунок в зависимости от их конкретных экспериментальных требований, и они могут приостановить работу прибора в любое время для выполнения других операций. MISS cell — это безопасная для микробов высокопроизводительная моноклональная скрининговая платформа, простая в эксплуатации и с минимальным расходом реагентов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все процедуры исследования соответствуют всем применимым этическим нормам. Процедуры были одобрены Комитетом по этике науки и техники Университета Цинхуа. Для изучения микробиоты кишечника человека были взяты образцы кала у здорового взрослого человека без серьезных заболеваний, который дал письменное информированное согласие.

1. Установка прибора

  1. Поместите прибор системы Omics в чистую или стерильную среду (например, в стерильную комнату или анаэробный стол). Прибор является прецизионным устройством, и при его размещении на объекте учитывайте следующее:
    1. Поддерживайте в приборе нормальное давление и температуру.
    2. Держите прибор вдали от сильных электрических полей, магнитных полей и источников теплового излучения.
    3. Убедитесь, что площадь размещения прибора превышает размеры 2 500 мм (Г) x 1 500 мм (Ш) x 2 000 мм (В).
    4. Поддерживайте влажность прибора в окружающей среде ниже 60%.

2. Подготовка

  1. Последовательно включайте питание системы Omics, компьютера и операционного программного обеспечения системы Omics.
  2. Установка микрофлюидных чипов MISS cell и микрофлюидных чипов для генерации капель:
    1. Откройте дверцу камеры генерации и культивирования капель (рис. 1A) и вертикально снимите защитную крышку микротрубки и микрофлюидного чипа для генерации капель. С помощью одноразового шприца добавьте 10 мл стерильной дистиллированной воды в увлажнитель внутри камеры для выращивания капель (рис. 1C) и установите на место защитную крышку микротрубки и микрофлюидного чипа для генерации капель.
    2. Откройте стерильную упаковку микротрубки и микрофлюидного чипа, генерирующего капли, и вертикально поместите его прямо над камерой культивирования (рис. 1C).
    3. В интерфейсе программного обеспечения нажмите « Установка » (рисунок 2A). В этот момент появляется всплывающее окно с запросом: Подтвердите замену микротрубки и микрофлюидный чип для генерации капель? Нажмите кнопку Да , чтобы начать установку.
    4. Выньте средство для удаления пузырьков воздуха и закрепите его вверх ногами на месте удаления пузырьков воздуха в камере генерации и культивирования капель. Будьте осторожны, чтобы не надавить на входную и выходную трубки капли устройства для удаления пузырьков воздуха (Рисунок 1E).
    5. Подсоедините трубку для выхода капель устройства для удаления пузырьков воздуха к расположенному под ним зажимному клапану и пропустите его через отверстие, которое направлено в камеру обнаружения и сбора капель (рис. 1B).
    6. Откройте дверцу камеры обнаружения и сбора капель, вертикально вставьте трубку обнаружения, уже подключенную к отводящей трубке, в гнездо обнаружения и убедитесь, что трубка обнаружения полностью вставлена (Рисунок 1D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: При установке контрольной трубки вставьте ее вертикально без каких-либо изгибов на трубке.
    7. Затяните винт, которым фиксируется контрольная трубка по часовой стрелке. Убедившись, что трубка обнаружения полностью вставлена и закреплена, закройте дверцу камеры обнаружения и сбора капель.
    8. Микротрубка и микрофлюидный чип для генерации капель состоят из 10 силиконовых трубок, каждая из которых помечена номером (L01-L10). Подсоедините каждую промаркированную трубку к соответствующему пронумерованному зажимному клапану (01-10) (Рисунок 1C).
    9. Подключите быстроразъемный соединитель микротрубки и микрофлюидного чипа для генерации капель к соответствующему порту в системе Omics: C1 к O1, C2 к O2, C4 к O4 и CF к OF.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Установка микротрубки и микрофлюидного чипа для генерации капель завершена. C3 не нужно подключать к O3.
    10. После того, как установка микротрубок и микрофлюидной стружки для генерации капель завершена, появляется всплывающее окно с предложением открыть зажимной клапан для капельной трубки. Нажмите OK, когда установка микрофлюидного чипа с микротрубками и генерацией капель будет завершена. Убедившись, что все силиконовые трубки из микротрубки и микрофлюидного чипа для генерации капель прикреплены к соответствующему зажимному клапану, нажмите OK.
  3. Инициализация инструмента
    1. Перед выполнением инициализации нажмите на интерфейс Setting (рисунок 2B) для настройки соответствующих параметров: режим обнаружения (обнаружение на основе OD или на основе флуоресценции; Наружный диаметр), температуру инкубации (37 °C) и время (30 дней = 720 ч), скорость мешалки (20 об/мин), длину волны обнаружения наружного диаметра (600 нм), а также длину волны возбуждения и излучения флуоресцентного детектирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры, используемые для выделения и культивирования кишечной микробиоты человека в данном протоколе, приведены в скобках. При настройке параметров температура выращивания должна быть в пределах от 5 °C до 50 °C. При выборе режима обнаружения оптическое волокно необходимо заменить, если волокно на модуле обнаружения капель отличается (см. шаг 2.3.2). При настройке параметров опорное значение масляной фазы (базовое спектральное) автоматически определяется программным обеспечением, что устраняет необходимость в ручной регулировке.
    2. Замена обнаруженного оптического волокна
      1. Извлеките обнаруженное волокно из держателя волокна (открутите против часовой стрелки) и ослабьте крепежный винт волокна на модуле капель (рис. 1D).
      2. Если оптическое волокно не будет использоваться, извлеките его из модуля, вставьте в держатель волокна и затяните. Вставьте обнаруженное волокно в порт обнаружения и затяните крепежный винт волокна на модуле. Замена оптического волокна завершена.
    3. Перейдите в главный интерфейс и нажмите «Инициализировать», чтобы система Omics выполнила самопроверку своих компонентов, включая насос впрыска, настройки температуры, тестирование сброса отработанной жидкости, модуль скрининга и модуль обнаружения капель.
      1. Во время инициализации проведите испытание сброса отработанной жидкости из модуля обнаружения капель, впрыскав 1 мл 75% спирта в порт для отработанной жидкости и наблюдая, нормально ли вытекает жидкость.
      2. Для тестирования скринингового модуля поместите 96-луночный планшет на место расположения планшета и посмотрите, нормально ли движение планшета.

3. Генерация капель

  1. Сбор и обработка образцов микробиоты кишечника человека
    1. Подготовьте ночной горшок и контейнеры для стула, вымойте руки и наденьте перчатки, чтобы собрать свежие образцы стула.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При сборе образцов кала по возможности избегайте загрязнения мочи. Лучше заранее помочиться, а стул поместить в чистую сухую емкость.
    2. Асептически соберите необходимое количество стула среднего сегмента и запечатайте его в стерилизованные криовиалы (примерно 3-5 г на флакон). Немедленно поместите флаконы на лед для последующей аликвотации и маркировки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если образец кала большой или не может быть собран сразу, его следует собрать в течение максимум 2 часов.
    3. На анаэробной скамье используйте стерильный тампон или инструмент для забора кала для сбора образца среднего сегмента.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поверхностный слой стула содержит отторгнутые клетки слизистой оболочки кишечника и подвержен внешнему загрязнению; после контакта с воздухом некоторые микробные ДНК начинают разрушаться.
    4. Собранные образцы кала переложите в стерильные микроцентрифужные пробирки объемом 2 мл или стерильные криовиалы, каждая пробирка должна содержать 0,5-2,0 г стула. Подготовьте две аликвоты для заморозки на каждый образец.
    5. Повторно суспендируйте свежий образец кала в стерильном физиологическом растворе, при этом каждые 100 мг стула разводят в 1 мл раствора. Тщательно перемешайте стул до тех пор, пока не будут видны крупные частицы.
    6. После естественного осаждения в течение 10 минут последовательно отфильтруйте надосадочную жидкость через стерильные сетчатые фильтры с размерами пор 200 меш (0,075 мм), 400 меш (0,038 мм) и 800 меш (0,018 мм) для удаления непереваренной пищи и более мелких твердых частиц. Наконец, соберите фильтрат в стерильные центрифужные пробирки.
    7. Возьмите 10 μл отфильтрованной фекальной суспензии и определите микробную концентрацию с помощью гемоцитометра и инвертированного флуоресцентного микроскопа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После фильтрации надосадочной жидкости образца кала через ячейки разного размера остаются некоторые более мелкие частицы кала. Поэтому при определении концентрации микробов активные частицы, наблюдаемые под микроскопом, рассматриваются как микроорганизмы, что позволяет лишь приблизительно рассчитать концентрацию микроорганизмов.
    8. Перенесите фекальную суспензию в стерильную центрифужную пробирку объемом 1,5 мл и пометьте ее датой, концентрацией микроорганизмов и названием образца. Оставьте часть для последующих экспериментов, а остальное храните при температуре 4 °C в будущем.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Своевременно записывайте информацию об образце (название образца, время сбора), чтобы обеспечить одновременный сбор образцов (с учетом изменений временного ритма кишечных микроорганизмов млекопитающих). Весь сбор и обработка проб должны осуществляться в анаэробной среде.
  2. Подготовка к начальной суспензии кала
    1. Приготовьте среду Brain Heart Broth (BHI) в соответствии с протоколом производителя и простерилизуйте ее путем автоклавирования при 121 °C в течение 15 минут.
    2. Возьмите фекальную суспензию из шага 3.1.8 и выполните последовательное разведение средой BHI до достижения концентрации ~50 клеток/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы наполнить флакон с образцом, приготовьте не менее 40 мл фекальной суспензии.
    3. Убедившись, что на дне находится небольшая магнитная мешалка, вылейте разбавленную фекальную суспензию в бутылку с образцом до места добавления образца. Закрутите колпачок и закрутите его. Затем вставьте быстроразъем A в быстроразъем B, чтобы завершить процесс загрузки образца (рис. 3A).
    4. Поместите флакон с образцом в указанное положение и отделите быстроразъемные соединения A и B от флакона с образцом. Подсоедините быстроразъем A флакона с образцом к порту O3 в системе Omics, а разъем C3 на микротрубке и микрофлюидном чипе для генерации капель подключите к быстроразъемному разъему B. Закройте дверцу камеры генерации капель и культивирования (рис. 3B).
  3. Генерация капель
    1. Выберите желаемое количество капельных трубок, которые будут сгенерированы в домашнем интерфейсе программного обеспечения (рис. 2A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый прогон может производить до 10 капельных трубок, при этом каждая трубка генерирует около 5 000 капель.
    2. Нажмите «Создать» в домашнем интерфейсе программного обеспечения, чтобы начать генерацию капель одиночных клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, работает ли насос для сброса отработанной жидкости или нет. Во время генерации капель каждая капля имеет объем 2,0 мкл. Смотрите раздел обсуждения для описания генерации капель.
    3. Подождите, пока звуковой сигнал не укажет на то, что генерация капель завершена. Закройте зажим на разъеме C3 (рис. 1E) и извлеките флакон с образцом.

4. Выращивание капель

  1. Выберите тот же номер капельной трубки, что и во время генерации капель, в домашнем интерфейсе программного обеспечения, нажмите «Культура», подтвердите время и температуру выращивания и начните процесс. Следите за индикатором выполнения в домашнем интерфейсе, который показывает прогресс обработки и оставшееся время.
  2. Подождите, пока звуковой сигнал не укажет на то, что выращивание капель завершено. Если время обработки необходимо продлить, отрегулируйте время непосредственно в интерфейсе настроек .

5. Просеивание капель

  1. Нажмите кнопку UV на системе Omics, чтобы включить ультрафиолетовое (УФ) излучение (рис. 1A), облучайте камеру обнаружения и сбора капель в течение 30 минут, а затем выключите ультрафиолетовое излучение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед включением ультрафиолетового излучения убедитесь, что дверца камеры обнаружения и сбора капель закрыта.
  2. В сверхчистом скамейке откройте все 96-луночные планшеты, используемые для сбора капель, и сложите их друг на друга без крышек, последовательно пронумеровав их снизу вверх. Следите за тем, чтобы верхняя пластина колодца была закрыта крышкой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В каждом прогоне может быть до десяти 96-луночных планшетов, а количество планшетов зависит от общего количества капель.
  3. Откройте дверцу камеры обнаружения и сбора капель, установите луночные пластины в обозначенные места (рис. 1D), снимите крышку с верхней луночной пластины и закройте дверцу камеры.
  4. Включите ультрафиолетовый свет на системе Omics на 30 минут, чтобы выполнить вторичную стерилизацию.
  5. Установка устройства для удаления пузырьков воздуха
    1. Снимите средство для удаления пузырьков воздуха с места установки, открутите крышку и снимите винт в форме бабочки с крышки (рисунок 3C).
    2. Налейте 200 мл масла для удаления пузырьков воздуха в средство для удаления пузырьков воздуха, плотно закрутите флакон с крышкой средства для удаления пузырьков воздуха на системе Omics, а затем зафиксируйте средство для удаления пузырьков воздуха вверх ногами на месте удаления пузырьков воздуха. Установка средства для удаления пузырьков воздуха завершена.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При фиксации средства для удаления пузырьков воздуха на месте убедитесь, что масло не вытекает. Если произошла утечка, закрутите крышку.
  6. Выберите капельную трубку для сортировки в домашнем интерфейсе, нажмите кнопку Сортировка, введите количество луночных пластин, которые необходимо собрать, а затем начните процесс. После начала скрининга капель наблюдайте за областью отображения процесса, на которой в режиме реального времени отображаются измерения оптической плотности (OD) капель или значений флуоресценции.
  7. Проанализируйте примерно 20-30 капель, чтобы проверить значение OD. Например, если обнаружено, что большинство из них имеют значение OD ~0,2, что соответствует значению OD пустых капель, основанное на распределении Пуассона, установите нижний порог OD равным 0,5, а верхний порог OD равным 4,0. Капли в этом диапазоне будут автоматически собираться в 96-луночные планшеты (Рисунок 4A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Согласно закону Беера-Ламберта, значение OD пустых капель определяется составом питательной среды внутри капель. Как правило, нижний порог OD устанавливается на 0,2-0,3 единицы выше, чем значение OD пустых капель, чтобы обеспечить четкое различие между пустыми каплями и каплями, содержащими микроорганизмы.
  8. Подождите, пока звуковой сигнал не укажет на то, что фильтрация и сбор капель завершены. Откройте дверцу камеры обнаружения и сбора капель, наденьте крышку луночной пластины на верхнюю луночную пластину, а затем выньте все луночные планшеты из камеры вместе, чтобы провести последующее секвенирование и резервное копирование.

6. Экспорт данных и отображение тепловых карт

  1. Нажмите кнопку Экспорт данных, чтобы сохранить собранные данные о сигнале капель (рис. 4A, B).
  2. Нажмите Тепловая карта, выберите файл данных сбора капель и наблюдайте за значениями наружного диаметра капель, собранных на микропланшете, отображаемом программным обеспечением. Визуализируйте эти значения ОП в виде тепловой карты, где интенсивность цвета соответствует распределению ОП по лункам, обеспечивая четкое и интуитивно понятное представление собранных значений ОП моноклональных ОП (рис. 4A, C).

7. Чистка ячейки MISS

  1. После завершения эксперимента выберите капельную трубку, которую необходимо очистить, и нажмите кнопку Очистить , чтобы начать очистку прибора.

8. Микробное моноклональное резервное копирование и секвенирование образцов

  1. Секвенирование пробоподготовки
    1. На анаэробном стенде добавьте по 100 мкл среды BHI в каждую лунку собранной капельной пластины, хорошо перемешайте с помощью пипетирования, а затем возьмите по 10 мкл из каждой лунки и переложите все это в одну стерильную пробирку объемом 15 мл. Vortex для получения смешанной микробной суспензии.
    2. Добавьте 5 мл фосфатно-солевого буфера в смешанную микробную суспензию, центрифугируйте при 1000 × г в течение 10 минут, удалите надосадочную жидкость и поместите микробную гранулу в жидкий азот для быстрого замораживания. Подготовка образца для секвенирования завершена.
    3. Используйте методы ампликон-секвенирования 16S рДНК, нацеленные на домены V3 и V4 16S рДНК. Конкретные используемые праймеры для секвенирования: 341F: ACTCCTACGGGAGGCAGCA и 806R: GGACTACHVGGGTWTCTAAT.
  2. Криоконсервация микробного моноклонального образца:
    1. После сбора 10 мкл образца из каждой лунки в капельные пластины (с шага 8.1.1) добавьте 30 мкл глицерина в каждую лунку. Поместите планшеты при температуру ниже -80 °C для сохранения микробного штамма.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

По оценкам, микробиота кишечника человека, составляющая преобладающее микробное сообщество, содержит в кишечнике примерно 4 ×10 13 микроорганизмов, что свидетельствует о ее огромном количестве и сложном составе11. В этом исследовании мы стремились из...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В этом протоколе описывается работа клетки MISS для автоматизированной и высокопроизводительной микробной моноклональной изоляции, культивирования, обнаружения и сбора. По сравнению с традиционными методами, с помощью которых можно было выделить и культивировать то?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Это исследование было поддержано проектами исследований и разработок в ключевых районах провинции Гуандун (2024B1111130002), проектами исследований и разработок провинции Хэбэй (22375503D) и проектом открытия Аньхойской инженерной лаборатории по промышленной микробиологии молекулярной селекции (грант ELMB-07).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm Petri dishMerck KGaA, Darmstadt, GermanyP5731-500EAFor solid plate preparation
30 mL Stool ContainersBoen Healthcare Co., Ltd611101For collecting the stool samples
37 °C constant temperature incubatorShanghai Yiheng Technology Co., Ltd.LRH-150Cultivate the solid plate in the incubator
96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated MicroplatesCorning3599For well plate movement detection and droplet collection
AgarBecton, Dickinson and Company214010For solid plate preparation
Air bubble removal oilLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MISS cell-S-oilThe oil in the air bubble remover during droplet screening
Air bubble removerLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MISS cell-SExclude the gas phase between droplets before performing droplet detection and collection
Anaerobic benchArgon and Nitrogen Space Equipment Business Department, Haiyu Town, Changshu CityVGB-4CM For aseptic operation and UV sterilization under anaerobic condition
AutoclavePuhexi Health and Medical Equipment Co., Ltd.MLS-830LFor autoclaving BHI medium, EP tube, and so on.
Brain Heart Infusion (BHI) BrothQingdao High-tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., LtdHB8297-1Components of the BHI medium
The ingredient list:
38.5 g/L BHI Broth in distilled water
Cell SpreaderMerck KGaA, Darmstadt, GermanyHS8151Inoculate the microbial solution onto the solid plate
Centrifuge tube, 15 mLBeijing Xinhengyan Technology Co., LtdHB53397For microbial solution preparation
ComputerLenovoE450Software installation and MISS cell control
CryovialThermo Fisher2.0 mLFor stool preservation
Distilled waterBeijing Mreda Technology Co., Ltd.M306444-100mlAdd into humidifier to keep the humidity in droplet cultivation chamber
EP tubeThermo Fisher2.0 mLFor collecting the stool samples
Fluorescent inverted microscopeOlympus Life Science (LS)CKX53Check and calculate the microbial concentration
GlycerolGENERAL-REAGENTG66258AFor strain preservation
HemocytometerAcmecAYA0810-1eaCalculate the microbial concentration
KClAmbeedA442876Components of phosphate buffered saline (PBS solution)The ingredient list: 8 g/L NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4 in distilled water
KH2PO4MACKLINP815661Components of phosphate buffered saline (PBS solution)The ingredient list: 8 g/L NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4 in distilled water
Mesh filterAnping Jiufeng Wire Mesh Manufacturing Co., Ltd200 mesh (0.075 mm), 400 mesh (0.038 mm), 800 mesh (0.018 mm) Remove undigested food and smaller particulate matter from the stool samples
Micro-tubing and droplet generation microfluidic chipLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MISC-B2For droplet generation and droplet incubation
MISS cell oilLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MISS cell-BOS-BThe oil phase for droplet microfluidics
MISS cell softwareLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MISS cell V3.2.4Perform experimental operations on the MISS cell instrument
Na2HPO4SolarbioD7292Components of phosphate buffered saline (PBS solution)The ingredient list: 8 g/L NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4 in distilled water
NaClGENERAL-REAGENTG81793JComponents of the physiological saline solution
The ingredient list:
9 g/L NaCl in distilled water
Pipetteeppendorf2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μLFor liquid handling
Polytetrafluoroethylene tubeShenzhen WOER Heat-shrinkable Material Co., Ltd.3401000141For droplet incubation. This material was already included in micro-tubing and droplet generation microfluidic chip
Sample bottleLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MISS cell-bottleSampling of microbial solution
Single Cell Microliter-droplet Culture Omics System (MISS cell)Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MISS cell-G3fPerforming the microbial monoclonal isolation, cultivation, detection and collection
Superspeed CentrifugeThermo FisherSorvall Lynx 4000 Prepare the microbial solution for sequencing
SyringeJiangsu Zhiyu Medical Instructment Co., Ltd10 mLDraw the distilled water and inject it into the humidifier in droplet cultivation chamber
Ultra low temperature refrigeratorSANYO Ultra-low MDF-U4086S For strain preservation (-80 °C)

Ссылки

  1. Hurst, C. J. Isolation and cultivation of bacteria. The structure and function of aquatic microbial communities. , Springer International Publishing. Cham. 313-351 (2019).
  2. Xu, M. Q., Pan, F., Peng, L. H., Yang, Y. S. Advances in the isolation, cultivation, and identification of gut microbes. Mil Med Res. 11 (1), 34(2024).
  3. Lattermann, C., Büchs, J. Microscale and miniscale fermentation and screening. Curr Opin Biotechnol. 35, 1-6 (2015).
  4. Huang, Y., et al. High-throughput microbial culturomics using automation and machine learning. Nat Biotechnol. 41 (10), 1424-1433 (2023).
  5. Brehm-Stecher Byron, F., Johnson Eric, A. Single-cell microbiology: Tools, technologies, and applications. Microbiol Mol Biol Rev. 68 (3), 538-559 (2004).
  6. Jian, X., et al. Single-cell microliter-droplet screening system (miss cell): An integrated platform for automated high-throughput microbial monoclonal cultivation and picking. Biotechnol Bioeng. 120 (3), 778-792 (2023).
  7. Hu, B., et al. One cell at a time: Droplet-based microbial cultivation, screening and sequencing. Mar Life Sci Technol. 3 (2), 169-188 (2021).
  8. Leygeber, M., et al. Analyzing microbial population heterogeneity-expanding the toolbox of microfluidic single-cell cultivations. J Mol Biol. 431 (23), 4569-4588 (2019).
  9. He, Z., Wu, H., Yan, X., Liu, W. Recent advances in droplet microfluidics for microbiology. Chinese Chemical Letters. 33 (4), 1729-1742 (2022).
  10. Kaminski, T. S., Garstecki, P. Controlled droplet microfluidic systems for multistep chemical and biological assays. Chem Soc Rev. 46 (20), 6210-6226 (2017).
  11. Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Are we really vastly outnumbered? Revisiting the ratio of bacterial to host cells in humans. Cell. 164 (3), 337-340 (2016).
  12. Simrén, M., et al. Intestinal microbiota in functional bowel disorders: A rome foundation report. Gut. 62 (1), 159-176 (2013).
  13. Periyannan Rajeswari, P. K., Joensson, H. N., Andersson-Svahn, H. Droplet size influences division of mammalian cell factories in droplet microfluidic cultivation. Electrophoresis. 38 (2), 305-310 (2017).
  14. Jian, X., et al. Microbial microdroplet culture system (mmc): An integrated platform for automated, high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution. Biotechnol Bioeng. 117 (6), 1724-1737 (2020).
  15. Baret, J. -C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
  16. Kubie, L. S. The solubility of O2, CO2, and N2 in mineral oil and the transfer of carbon dioxide from oil to air. J Biol Chem. 72 (2), 545-548 (1927).
  17. Poon, C. Measuring the density and viscosity of culture media for optimized computational fluid dynamics analysis of in vitro devices. J Mech Behav Biomed Mater. 126, 105024(2022).
  18. Yao, J., Lin, F., Kim, H. S., Park, J. The effect of oil viscosity on droplet generation rate and droplet size in a t-junction microfluidic droplet generator. Micromachines. 10 (12), 808(2019).
  19. Venkateshwarlu, A., Bharti, R. P. Effects of capillary number and flow rates on the hydrodynamics of droplet generation in two-phase cross-flow microfluidic systems. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers. 129, 64-79 (2021).
  20. Nekouei, M., Vanapalli, S. A. Volume-of-fluid simulations in microfluidic t-junction devices: Influence of viscosity ratio on droplet size. Physics of Fluids. 29, 032007(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены