ラベリング、ハイブリダイゼーション、および洗浄プロトコールは、ここにゲノム研究所（TIGR）の間、博士J.クアッケンブッシュが以前に開発されたものに若干の変更、ヴァンダービルトマイクロアレイ共有リソース（VMSR）、博士博士ショーンレヴィが含まれていますロブアルバボイストンプソン研究所、（BTI）コーネル大学在学中。

（セクション1注 - 4ビデオでは分かりませんが） CY -標識された標的cDNAを準備以下は、我々はハイブリダイゼーションをマイクロアレイに前テーダマツの全RNAおよび間接的なcDNAラベリングからcDNA合成に使用するプロトコルです。いくつかの非自明な修正が行われているが、以下のプロトコールは、Invitrogenのスーパースクリプト間接cDNAラベリングキットに付属の取扱説明書と同様である。 パート1：ファーストストランドcDNA合成反応<ol><li>混和後、使用前に各キットのコンポーネントを回転させる。 </li><li>次のように反応を準備します。 <ul><li> XμlDEPC - H 2 O </li><li> XμlトータルRNAを、20μgの/反応（AmbionのターボDNaseで前処理） </li><li> 2μlのアンカーオリゴ（dT）20プライマー（2.5μg/μl） </li><li> 1μlのランダムヘキサマープライマー</li><li style="list-style:none;"> 合計量=18μl </li></ul></li><li> 70でチューブをインキュベートしますその後5分間、1〜2分間氷上で場所を。 </li><li>氷上で各反応チューブに以下を追加します。 <ul><li> 6μl5Xファーストストランドバッファー</li><li> 1.5μlずつ0.1M DTT </li><li> 1.5μlずつ10mMのdNTPミックス</li><li> 1μlのRNaseOUT（40U/μl） </li><li> 2μlのスーパースクリプトIII RT（400U/μl） </li></ul></li><li>穏やかに混合し、手短にスピン。 45一晩チューブをインキュベート℃を</li><li>各反応チューブに1M NaOHを15μlを加えてよく混ぜる。 </li><li> 10分間70℃でチューブをインキュベートします。 </li><li> 1MのHCl15μlを加えます。穏やかに混合する。 </li><li> 20μlの3M酢酸ナトリウム（pH 5.2）を追加し、穏やかに混合する。 </li></ol>パート2：浄化1stストランドcDNA。 <ol><li> （ステップ1.9から）のcDNAへのローディングバッファー500μLを加え、よく混ぜる。 </li><li>コレクションチューブにSNAP精製カラムを（間接標識キットに付属）を配置し、カラム上でcDNAを読み込みます。 </li><li> 1分間、室温、14,000 gでスピン、フロースルーを捨てる。 </li><li>同じコレクションチューブにSNAPカラムをセットし、洗浄バッファーの500μLを加える。 </li><li> 1分間、室温、14,000 gでスピン、フロースルーを捨てる。 </li><li> three500μL洗浄の合計については、ステップ2.4​​および2.5を3回繰り返します。 </li><li> 1分秒間、室温、14,000 gで複数の時間をスピン、フロースルーを捨てる。 </li><li>新しい1.5mlチューブにSNAP Columnを置きます。 </li><li> SNAPカラムと1分間室温でインキュベート列に暖かいDEPC -水（50℃）50μlのを追加。 1分間室温、14,000 gでスピンを経由してcDNAを溶出します。 </li><li> DEPC -水暖かい100μlの溶出液に対して同じ1.5mlチューブを使用して、ステップ2.9を繰り返します。 </li><li>ステップ2.9および2.10から溶離液に3M酢酸ナトリウム（pH 5.2）の20μlのを追加。 </li><li>チューブとミックスにグリコーゲンの3μl（20mg/ml）を追加します。 </li><li> 、氷冷100％エタノールの500μLを追加しよく混合し、-80℃で1時間チューブをインキュベート℃に</li><li> 4、14,000 gでチューブをスピン℃で20分間。注意深く上清を取り除く。 </li><li>氷冷70％エタノールの500μLを追加し、4、14,000 gでチューブを回転℃で5分間。注意深く上清を取り除く。 </li><li> 5分間のサンプルを空気乾燥させる、すべてのエタノールが削除されていることを確認してください。 </li><li> 5分間37℃でCを2Xカップリングバッファーを温め、暖かい2Xカップリングバッファー5μlのでcDNAサンプルを再懸濁する。 </li><li> 50℃のcDNA /カップリングバッファを加熱℃で10分間と渦のためのCも。のcDNAペレットが完全に2Xカップリングバッファーに再懸濁していることを確認してください。 </li></ol>パート3：蛍光色素で標識 反応を準備する際に、光への色素溶液の曝露を最小限に抑えるように注意してください。また、DMSOは吸湿性であり、色素のNHSエステルと反応し、大幅にカップリング反応の効率を低下させる空気から水分を吸収します。 -20℃でアンバースクリューキャップバイアルのキットに同梱されているDMSOを維持し、結露を防ぐために開く前に室温にバイアルを暖かくしましょう。このキットで提供される唯一のDMSOを使用してください。 <ol><li>のCy - 3またはCy - 5色素の1つのパケットを開き、色素バイアルに直接DMSOの75μlを加える。 </li><li>ステップ2.18からチューブにDMSO /色素溶液の5μlのを追加。 </li><li>よく混和して、1時間暗所で室温でチューブをインキュベートする。 </li><li>色素結合cDNA溶液に3M酢酸ナトリウムの20μlの液（pH 5.2）を追加します。 </li><li> cDNA溶液にローディングバッファー500μLを追加。ボルテックスでよく混ぜる。 </li><li>明確なコレクションチューブにSNAP列を配置し、cDNA /バッファのソリューションを読み込みます。 </li><li> 1分間、室温、14,000 gでスピン、フロースルーを捨てる。 </li><li>同じコレクションでSNAPカラムを配置チューブ、カラムにWash Bufferを500μLを加える。 </li><li> 1分間、室温、14,000 gでスピン、フロースルーを捨てる。 </li><li>ステップ3を繰り返します。 8〜3.9 3つの3500μL洗浄の合計回数、。 </li><li> 1分間、室温、14,000 gで複数の時間をスピン、フロースルーを捨てる。 </li><li>新しいオレンジ色のコレクションチューブにSNAP Columnを置きます。 </li><li>室温で1分間SNAPカラムとインキュベートする暖かいDEPC -水（50℃）の65μlを追加。 </li><li> 1分間、室温、14,000 gでスピンし、フロースルーを収集する。フロースルーは、あなたの精製されたcDNAの色素結合の60μlが含まれている必要があります。 </li></ol>パート4：標識手順の評価。 <ol><li>各CY - cDNAラベリングを評価するための分光光度計の検定を行う。合成されたcDNAのpmolの合計数を計算：[OD 260 ×巻。 X37ng/μl× 10 3 ngの/ PG] / 324.5 PG / pmolの。各標識反応のために法人のCy -色素の合計pmolのを計算する：ピコモルのCy3 = [OD 550 X巻] / 0.15; pmolのCy5と= [OD 650 X巻] / 0.25。次に、各反応の塩基/ pmolの色素比のpmolを計算する。最適な反応はCy -色素（60ulあたり）のcDNA（あたり60ul）、&gt; 200pmol、および&lt;30であるヌクレオチド/染料比の&gt; 6000pmolを生成します。 </li></ol>パート5：スライドプレウォッシュ<ol><li> PtGen2配列は、コーニングUltraGapsスライド（アミノシランコートされた）に印刷されており、cDNAは、UVクロスリンクされています。プリントスポットが原因でバッファの高塩分にはっきりと見える。 </li><li>印刷領域（オプション）の上部と下部の領域のためのスライドをマークするためにダイヤモンドチップのペンを使用してください。 </li><li>顕微鏡のスライドの洗浄ディッシュ（3&quot;× 4&quot;）に約250ミリリットル43〜予め温めておいた° C 0.2％SDS溶液を置く。 </li><li>場所は、スライド上に塩を除去するために15〜20倍、非常に精力的にSDSの溶液中にスライドラックとプランジでプレハイブリダイズされるまでスライドさせます。 </li><li>鉗子を使用すると、慎重にラックからスライドを削除し、43℃にあらかじめ温めておいたれているプレハイブリダイゼーションバッファー（5 × SSC、0.1％SDS、1％BSA）を含むコプリンジャーの中に置いてください少なくとも1時間、43℃でインキュベートする。 </li></ol>第6部：プレハイブリダイゼーション<ol><li> fiveスライド皿を洗う、millipureのdH 2 Oで満たさそれぞれ、および分子等級イソプロパノールを充填した1コプリンジャーを設定します。スライドラックにスライドを配置し、20回、それぞれのダンクで5皿を順次処理します。 </li><li>第五水洗浄から一度に2つのスライドと微量にスライドのイソプロパノールとすぐに場所（Chipmateのベンチトップ、2箇所）に5〜6回をディップして乾燥するために1分間の回転を削除します。 </li><li>圧縮空気ときれいなスライドでは、0.22μmのフィルターカートリッジで濾過し、ゲノムソリューションのハイブリダイゼーションチャンバーに上向きにバーコードでそれらを置きます。 </li><li>クリーンLifterSlips™濾過空気とし、下向きに白いストリップでスライド上に配置する。軽くスライド上のリフタースリップを合わせるために黄色のピペットチップを使用（LifterSlipsを洗濯™70％エタノールで最初のオプションです。我々はそれが不要であることが判明しました。） </li></ol>パート7：ハイブリダイゼーション 暗い場所や暗い場所で行われるべきである。 <ol><li>ハイブリダイズする各スライドの場合は、各ターゲットの50 - 75pmolを与えるために標識cDNAのCy - 5、CY - 3の量を計算する。 37〜45で一本のチューブにそれらの額を結合し、熱セットで真空デシケータで乾燥℃の完全に乾燥しないでください！ </li><li> 60mlのハイブリダイゼーション緩衝液（新鮮なその日作られた）と渦短時間で乾燥させたプローブを再懸濁します。 </li><li> 30秒間95℃、入浴して、迅速に微量で5分間再懸濁されたcDNAをインキュベートする。 </li><li>ゆっくりとスライドの下部にあるスライドLifterSlip™ジャンクショ​​ン（バーコードの末尾）でピペッティングすることにより全体の再懸濁したプローブのボリュームをロードする。スライドは、毛細管現象を介してロードされます。 （いくつかのスライドにピペッティングしてから、優しくLifterSlipをオーバーレイ™これは、泡を取得する場合に、スミアのアーティファクトを発見につながることができる配置後LifterSlip™を移動できないので、ワンショット法であることを好む） </li><li>ウェルチャンバーの両端に位置する各湿度に100mMのDTTの2​​0uL場所。 </li><li>チャンバーの上部に配置し、カムネジを締めます。 50〜60 rpmでおだやかに振とうしながら12〜18時間では48℃の水浴にアルミ箔と浸すとチャンバーカバー。 </li></ol>パート8：ポストハイブリダイゼーションの洗浄 すべての洗浄は、暗いまたは暗い場所で行われるべきである。スライドは最後のステップまで、乾燥させてはいけません。 <ol><li> 1）W：Wash Solutionを＃1 @ 53以下のそれぞれの250ミリリットルで満たさ° C、および4つのスライドの洗浄皿を充填した1コプリンジャーを設定する灰の解決策＃1 @ 53 ° C、2）洗浄液＃2 @室温、3＆4）のWash Solution＃3 @室温を含む二つの皿。 </li><li>慎重にハイブリダイゼーションチャンバーからスライドを削除し、コプリンジャーに一度、それら2つを置く。 30秒に向けて出発、その後徐々にスライドを持ち上げ、リフタースリップは、瓶のままになります。のWash Solution＃1（1X SSC、0.2％SDS、予熱から43 ° C）に直ちに浸漬場所のスライドラックのスライドと。すべてLifterSlipsが削除されており、すべてのスライドを洗浄するまでのWash Solution＃1皿になって繰り返します。 10回精力的に上下にラックを突き通す。 </li><li> 53場所の皿℃で10分間50〜100 rpmで振盪しながら空気シェーカーでC。 </li><li> 、＃2（0.1 × SSC、0.2％SDS）をソリューションを洗浄するためにラックを転送プランジ10回、そして室温でインキュベート、10分間振とう遅い。 </li><li> 15倍の残留SDSは、Wash Solutionを＃2からのキャリーオーバーを削除する最初のWash Solution＃3（0.1 × SSC）にディップラック。第二のWash Solutionの場所のラック＃3皿、プランジ10回後、10分間振とう遅い。 </li><li> 50mLのファルコンキャップチューブとスイングバケットローターを装備した遠心機でスピン@ 1,500 rpmでの場所のスライド。防音コンテナを明るみにスライドを削除する、我々はアルミ箔で覆い、別のファルコンチューブを使用し、窒素ガスと管からパージ空気、キャップきつく（オゾンレベルが高いとき、これは夏に特にCy色素、CY - 5の酸化を低減）。スライドは、前の窒素パージ管の走査に数時間保存できます。スキャンを洗浄した直後に行われる場合しかし、最良の信号の結果が得られます。 </li></ol>パート9：データ収集と統計解析<ol><li>パーキンエルマーのScanArrayで収集された画像データをスキャンします。我々は、10ミクロンのスキャン設定とバランス、製造元の指示に従って、ラインの調整法を用いてCy3とCy5のシグナルを使用してください。 </li><li> TIFファイルは、ImaGeneバージョン7.5（BioDiscovery、（株）、エルセグンド、カリフォルニア州）で収集し、フィルタリングされたグリッドと生の信号のデータです。 </li><li>データの正規化と統計的に有効な発現の異なる種を決定する評価はBRB配列ツールバージョンを使用して行われます。 3.7。 </li><li>協調的発現遺伝子の定量を容易にするために、パターン分析は、遺伝子発現パターンの解析ソフトウェア（GEPAS）版を使って行われます。 3.1。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1182/Figure1_WWLorenz-1.png" alt="図1" /> 図1このprotoco L.を使用して処理PtGen2配列の例<img src="/files/ftp_upload/1182/Figure2_WWLorenz.png" alt="図2" /> 図2。PtGen2配列の例は、標準的なハイブリダイゼーションおよび洗浄プロトコールを使用して処理。

<ol>
	<li>Lorenz, W. W., Sun, F., Liang, C., Kolychev, D., Wang, H., Zhao, X., Cordonnier-Pratt, M. M., Pratt, L. H., Dean, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+stress-responsive+genes+in+loblolly+pine+(Pinus+taeda)+roots+identified+by+analyses+of+expressed+sequence+tag+libraries.">Water stress-responsive genes in loblolly pine (Pinus taeda) roots identified by analyses of expressed sequence tag libraries.</a> Tree Physiol. 26, 1-16 (2006).</li><li>Lorenz, W. W., Dean, J. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> unpublished data. , .</li><li>Hegde, P., Qi, R., Abernathy, K., Gay, C., Dharap, S., Gaspard, R., Hughes, J. E., Snesrud, E., Lee, N., Quackenbush, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+concise+guide+to+cDNA+microarray+analysis.">A concise guide to cDNA microarray analysis.</a> Biotechniques. 29, 548-562 (2000).</li><li>Alba, R., Fei, Z., Payton, P., Liu, Y., Moore, S. L., Debbie, P., Cohn, J., D'Ascenzo, M., Gordon, J. S., Rose, J. K. C., Martin, G., Tanksley, S. D., Bouzayen, M., Molly, M., Jahn, M. M., Giovannoni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESTs,+cDNA+microarrays,+and+gene+expression+profiling:+tools+for+dissecting+plant+physiology+and+development.">ESTs, cDNA microarrays, and gene expression profiling: tools for dissecting plant physiology and development.</a> The Plant Journal. 39, 697-714 (2004).</li><li>Lorenz, W. W., Simões, M., Miguel, C., Dean, J. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Gene+Expression+changes+in+Pinus+species+using+a+Loblolly+pine+cDNA+microarray.">Analysis of Gene Expression changes in Pinus species using a Loblolly pine cDNA microarray.</a> IUFRO-CTIA 2008 Joint Conference. , (2008).</li><li>Simões, M., Lorenz, W. W., Alba, A., Gonçalves, S., Dean, J., Miguel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+gene+expression+analysis+during+P.+pinaster+embryo+development.">Global gene expression analysis during P. pinaster embryo development.</a> 7th Plant Genomics European Meeting. , (2008).</li></ol>

PtGen2は、テーダマツの研究コミュニティで主に使用するように設計されて最近開発された、カスタムcDNAマイクロアレイです。これまでに生成された予備的な結果は、我々が持っている乾燥ストレスに応答して発生する転写事象の評価に有用なツールであることが配列を示すだけでなく、海岸松の胚発生中に発生した変更を監視するには、 マツカイガンショウ 5,6きたまた、最?...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Pre-hybridization Buffer</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5X SSC, 0.1% SDS, 1% BSA</td>
</tr>
<tr>
<td>Hybridization Buffer</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>30% formamide, 5X SSC, 5X Denhardt&#x2019;s, 1% PolyA RNA (Invitrogen, POLYA.GF), 0.1% SDS</td>
</tr>
<tr>
<td>Wash Solution #1</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1X SSC, 0.2% SDS, preheat to 43&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Wash Solution #2</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>0.1X SSC, 0.2% SDS</td>
</tr>
<tr>
<td>Wash Solution #3</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>0.1X SSC</td>
</tr>
<tr>
<td>Isopropyl Alcohol</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>34959-2.5L</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50mL Conical Tubes</td>
<td>Other</td>
<td>Falcon&#x2122;</td>
<td>352070</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15mL Conical Tubes</td>
<td>Other</td>
<td>Falcon&#x2122;</td>
<td>352196</td>
<td>Use this or a similar cap placed at the bottom of each 50mL conical tube during centrifugation</td>
</tr>
<tr>
<td>Coplin Jar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Wheaton&#x2122;</td>
<td>900520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Staining Dish & Rack </td>
<td>Other</td>
<td>Wheaton&#x2122;</td>
<td>900200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Albumin from bovine serum (BSA)</td>
<td>Other</td>
<td>Sigma&#x2122;</td>
<td>A-9418</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PolyA RNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen&#x2122;</td>
<td>POLYA.GF</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SuperScriptTM Indirect cDNA Labeling </td>
<td>Kit</td>
<td>Invitrogen&#x2122;</td>
<td>L1014-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Turbo DNase</td>
<td>Kit</td>
<td>Ambion</td>
<td>AM1907</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy-5 Dye</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE&#x2122;</td>
<td>PA25001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy-3 Dye</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE&#x2122;</td>
<td>PA23001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LifterSlips&trade;</td>
<td>Other</td>
<td>Erie Scientific Company&#x2122; </td>
<td>25X601</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HybChambers</td>
<td>Equipment</td>
<td>GeneMachines</td>
<td>JHYB200003</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

processing the loblolly pine ptgen2 cdna microarray

PtGen2は増幅さテーダマツのESTを含む26496機能cDNAマイクロアレイです。配列は、松や他の針葉樹種で遺伝子発現を研究する研究者による使用のために我々の研究室で生産されている。 PtGen2は、テーダマツにおける私たちの遺伝子の発見の努力の結果として開発され、主に根の組織からだけでなく、針と幹から同定された配列で構成されています。1,2 PtGen2は異なるのCy -色素標識された針葉樹のターゲットcDNAをハイブリダイズすることによりテストされています、増幅および間接標識法を非増幅し、また、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件の数とテストの両方を使用する。このビデオでは、以前に開発された手続きに多少の変更を使用して、プレハイブリダイゼーション前後だけでなく、ハイブリダイゼーション後のスライドの取り扱いおよび処理に焦点を当てています。3,4また、発電に使用されるプロトコルである、テキスト形式でのみ、付属のラベリングとターゲットcDNAのsのクリーンアップだけでなく、ソフトウェアの詳細については、ダウンストリームデータ処理のために使用。 PtGen2は完全に除去することが困難な場合も塩の高濃度が含まれている独自のプリントバッファに出力されます。スライドは、プレハイブリダイゼーションの前に暖かいSDS溶液で最初に洗浄されています。プレハイブリダイゼーション後、スライドは、残りの塩の除去を完了するために水のいくつかの変化に積極的に洗浄されています。 LifterSlips™は、その後洗浄し、スライド上に配置し、標識cDNAされるかは、慎重にスライド全体のサンプルを均等に分散のために提供する毛細管現象の方法によりマイクロアレイ上に装填し、気泡の取り込みの可能性を減少させる。配列へのターゲットのハイブリダイゼーションは48℃で高湿度の条件で行われます。ハイブリダイゼーションの後、標準的な一連の洗浄は53℃の拡張時間のためのCおよび室温で行われている。このテクニックを使用して処理PtGen2スライドは、塩と、配列が少ない厳密に処理されるときにしばしば見られるSDS -由来のアーチファクトを低減します。いくつかの異なる針葉樹RNAのソースから派生したターゲットをハイブリダイズする、この処理のプロトコルは、より少ないアーティファクト、減少の背景を生み出し、そして配列の異なる実験群間でより良い整合性を提供する。

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Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

cDNAマイクロアレイPtGen2は、テーダマツの遺伝子発現研究のために開発されました<em&gt; P. taeda</em&gt;、および他の針葉樹種。ここで、我々は、事前に、より良い一貫性をもたらすためにこの配列で使用できるテクニックを処理し、洗浄後、ハイブリダイゼーション、削減の成果物、および低バックグラウンドを示す。

ロボロリーパインPtGen2 cDNAマイクロアレイの処理

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs.  The array is produced in our laboratory for use by researchers ...

processing-the-loblolly-pine-ptgen2-cdna-microarray

Research

JoVE Journal

Biology

7.3K ビュー.  University of Georgia (UGA). cDNAマイクロアレイPtGen2は、テーダマツの遺伝子発現研究のために開発されました P. taeda、および他の針葉樹種。ここで、我々は、事前に、より良い一貫性をもたらすためにこの配列で使用できるテクニックを処理し、洗浄後、ハイブリダイゼーション、削減の成果物、および低バックグラウンドを示す。

ビデオ: Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

Gibberella zeae Ascospore Production and Collection for Microarray Experiments.

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) is a plant pathogen causing scab disease on wheat and barley that reduces crop yield and grain quality. F. graminearum also causes stalk and ear rots of maize and is a producer of mycotoxins such as the trichothecenes that contaminate grain and are harmful to humans and livestock (Goswami and Kistler, 2004).

The fungus produces two types of spores. Ascospores, the propagules resulting from sexual reproduction, are the main source of primary infection.  These spores are forcibly discharged from mature perithecia and dispersed by wind (Francl et al 1999). Secondary infections are mainly caused by macroconidia which are produced by asexual means on the plant surface. To study the developmental processes of ascospores in this fungus, a procedure for their collection in large quantity under sterile conditions was required. Our protocol was filmed in order to generate the highest level of information for understanding and reproducibility; crucial aspects when full genome gene expression profiles are generated and interpreted. In particular, the variability of ascospore germination and biological activity are dependent on the prior manipulation of the material. The use of video for documenting every step in ascospore production is proposed in order to increase standardization, complying with the increasingly stringent requirements for microarray analysis. The procedure requires only standard laboratory equipment. Steps are shown to prevent contamination and favor time synchronization of ascospores.

To study the developmental processes of ascospores in Gibberella zeae, a procedure for collection under sterile conditions is filmed in order to generate the highest level of information for protocol description. This should facilitate the reproducibility of the experiment, a crucial aspect when full genome expression profile tests are implemented.

マイクロアレイ実験のためのジベレラzeae子嚢胞子の生産とコレクション。

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) is a plant pathogen causing scab disease on wheat and barley that reduces crop yield and grain ...

生物学

The Microfluidic Probe: Operation and Use for Localized Surface Processing

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. Microfluidics is commonly associated with closed microchannels which limit their use to samples that can be introduced, and cultured in the case of cells, within a confined volume. On the other hand, micropipetting system have been used to locally perfuse cells and surfaces, notably using push-pull setups where one pipette acts as source and the other one as sink, but the confinement of the flow is difficult in three dimensions. Furthermore, pipettes are fragile and difficult to position and hence are used in static configuration only. 
The microfluidic probe (MFP) circumvents the constraints imposed by the construction of closed microfluidic channels and instead of enclosing the sample into the microfluidic system, the microfluidic flow can be directly delivered onto the sample, and scanned across the sample, using the MFP. . The injection and aspiration openings are located within a few tens of micrometers of one another so that a microjet injected into the gap is confined by the hydrodynamic forces of the surrounding liquid and entirely aspirated back into the other opening. The microjet can be flushed across the substrate surface and provides a precise tool for localized deposition/delivery of reagents which can be used over large areas by scanning the probe across the surface. 
In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer.

In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer solution.

マイクロ流体プローブ：局在表面処理のための操作と使用方法

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. ...

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

遺伝子発現解析のための胚ゼブラフィッシュとcDNA合成からのRNA分離

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

ゼブラフィッシュオリゴヌクレオチドのマイクロアレイプラットフォームを使用してグローバルな遺伝子発現解析

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and prognosis of disease. While clinical proteomic methods vary widely, a common characteristic is the need for (i) extraction of proteins from extremely heterogeneous fluids (i.e. serum, whole blood, etc.) and (ii) extensive biochemical processing prior to analysis. Here, we report a new digital microfluidics (DMF) based method integrating several processing steps used in clinical proteomics. This includes protein extraction, resolubilization, reduction, alkylation and enzymatic digestion. Digital microfluidics is a microscale fluid-handling technique in which nanoliter-microliter sized droplets are manipulated on an open surface. Droplets are positioned on top of an array of electrodes that are coated by a dielectric layer - when an electrical potential is applied to the droplet, charges accumulate on either side of the dielectric. The charges serve as electrostatic handles that can be used to control droplet position, and by biasing a sequence of electrodes in series, droplets can be made to dispense, move, merge, mix, and split on the surface. Therefore, DMF is a natural fit for carrying rapid, sequential, multistep, miniaturized automated biochemical assays. This represents a significant advance over conventional methods (relying on manual pipetting or robots), and has the potential to be a useful new tool in clinical proteomics.
Mais J. Jebrail, Vivienne N. Luk, and Steve C. C. Shih contributed equally to this work.
Sergio L. S. Freire's current address is at the University of the Sciences in Philadelphia located at 600 South 43rd Street, Philadelphia, PA 19104.

Digital Microfluidics is a technique characterized by the manipulation of discrete droplets (~nL - mL) on an array of electrodes by the application of electrical fields. It is well-suited for carrying out rapid, sequential, miniaturized automated biochemical assays. Here, we report a platform capable of automating several proteomic processing steps.

自動プロテオーム処理のためのデジタルマイクロ流体

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine (P. taeda L.) and Other Conifer Species

Tissues isolated from conifer species, particularly those belonging to the Pinaceae family, such as loblolly pine (Pinus taeda L.), contain high concentrations of phenolic compounds and polysaccharides that interfere with RNA purification. Isolation of high-quality RNA from these species requires rigorous tissue collection procedures in the field and the employment of an RNA isolation protocol comprised of multiple organic extraction steps in order to isolate RNA of sufficient quality for microarray and other genomic analyses. The isolation of high-quality RNA from field-collected loblolly pine samples can be challenging, but several modifications to standard tissue and RNA isolation procedures greatly improve results. The extent of general RNA degradation increases if samples are not properly collected and transported from the field, especially during large-scale harvests. Total RNA yields can be increased significantly by pulverizing samples in a liquid nitrogen freezer mill prior to RNA isolation, especially when samples come from woody tissues. This is primarily due to the presence of oxidizing agents, such as phenolic compounds, and polysaccharides that are both present at high levels in extracts from the woody tissues of most conifer species. If not removed, these contaminants can carry over leading to problems, such as RNA degradation, that result in low yields and a poor quality RNA sample. Carryover of phenolic compounds, as well as polysaccharides, can also reduce or even completely eliminate the activity of reverse transcriptase or other polymerases commonly used for cDNA synthesis. In particular, RNA destined to be used as template for double-stranded cDNA synthesis in the generation of cDNA libraries, single-stranded cDNA synthesis for PCR or qPCR's, or for the synthesis of microarray target materials must be of the highest quality if researchers expect to obtain optimal results. RNA isolation techniques commonly employed for many other plant species are often insufficient in their ability to remove these contaminants from conifer samples and thus do not yield total RNA samples suitable for downstream manipulations. In this video we demonstrate methods for field collection of conifer tissues, beginning with the felling of a forty year-old tree, to the harvesting of phloem, secondary xylem, and reaction wood xylem. We also demonstrate an RNA isolation protocol that has consistently yielded high-quality RNA for subsequent enzymatic manipulations.

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine P. taeda L. and Other Conifer Species

Many plant tissues, including phloem and xylem from loblolly pine (Pinus taeda L.), contain high levels of phenolics and polysaccharides that interfere with RNA purification. This presentation discusses techniques for the harvest of field-grown tissues and isolation of RNA of sufficient quality for microarrays and other genomic analyses.

ロボロリーパインからのRNA分離の改良法（ P. taeda L.）及びその他の針葉樹種

Tissues isolated from conifer species, particularly those belonging to the Pinaceae family, such as loblolly pine (Pinus taeda L.), contain high ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

マイクロアレイ解析のためのサッカロマイセスセレビシエ</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Performing Custom MicroRNA Microarray Experiments

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1. Complex genomes encode at least hundreds of miRNAs, which primarily inhibit the expression of a vast number of target genes post-transcriptionally 2, 3. miRNAs control a broad range of biological processes 1. In addition, altered miRNA expression has been associated with human diseases such as cancers, and miRNAs may serve as biomarkers for diseases and prognosis 4, 5. It is important, therefore, to understand the expression and functions of miRNAs under many different conditions.
Three major approaches have been employed to profile miRNA expression: real-time PCR, microarray, and deep sequencing. The technique of miRNA microarray has the advantage of being high-throughput, generally less expensive, and most of the experimental and analysis steps can be carried out in a molecular biology laboratory at most universities, medical schools and associated hospitals. Here, we describe a method for performing custom miRNA microarray experiments. A miRNA probe set will be printed on glass slides to produce miRNA microarrays. RNA is isolated using a method or reagent that preserves small RNA species, and then labeled with a fluorescence dye. As a control, reference DNA oligonucleotides corresponding to a subset of miRNAs are also labeled with a different fluorescence dye. The reference DNA will serve to demonstrate the quality of the slide and hybridization and will also be used for data normalization. The RNA and DNA are mixed and hybridized to a microarray slide containing probes for most of the miRNAs in the database. After washing, the slide is scanned to obtain images, and intensities of the individual spots quantified. These raw signals will be further processed and analyzed as the expression data of the corresponding miRNAs. Microarray slides can be stripped and regenerated to reduce the cost of microarrays and to enhance the consistency of microarray experiments. The same principles and procedures are applicable to other types of custom microarray experiments.

A simple procedure of performing custom microRNA microarray experiments is described. The steps include isolating RNA, labeling RNA and reference DNA, hybridizing the samples to microarrays, scanning the microarrays, quantifying and analyzing hybridization signals.

カスタムmicroRNAのマイクロアレイの実験を行う

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1.  Complex genomes encode ...

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA Expression

A major approach in the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of genes of interest in selected cell lines, with the aim to reveal one or several of the gene's function(s) using transient/stable overexpression or knockdown of the gene of interest. Unfortunately, for various cell biological investigations this approach is unsuitable when manipulations of gene expression result in cell growth/proliferation defects or unwanted cell differentiation. Therefore, researchers have adapted the Tetracycline repressor protein (TetR), taken from the E. coli tetracycline resistance operon1, to generate very efficient and tight regulatory systems to express cDNAs in mammalian cells2,3. In short, TetR has been modified to either (1) block initiation of transcription by binding to the Tet-operator (TO) in the promoter region upon addition of tetracycline (termed Tet-off system) or (2) bind to the TO in the absence of tetracycline (termed Tet-on system) (Figure 1). Given the inconvenience that the Tet-off system requires the continuous presence of tetracycline (which has a half-life of about 24 hr in tissue cell culture medium) the Tet-on system has been more extensively optimized, resulting in the development of very tight and efficient vector systems for cDNA expression as used here.
Shortly after establishment of RNA interference (RNAi) for gene knockdown in mammalian cells4, vectors expressing short-hairpin RNAs (shRNAs) were described that function very similar to siRNAs5-11. However, these shRNA-mediated knockdown approaches have the same limitation as conventional knockout strategies, since stable depletion is not feasible when gene targets are essential for cellular survival. To overcome this limitation, van de Wetering et al.12 modified the shRNA expression vector pSUPER5 by inserting a TO in the promoter region, which enabled them to generate stable cell lines with tetracycline-inducible depletion of their target genes of interest.
Here, we describe a method to efficiently generate stable human Tet-on cell lines that reliably drive either inducible overexpression or depletion of the gene of interest. Using this method, we have successfully generated Tet-on cell lines which significantly facilitated the analysis of the MST/hMOB/NDR cascade in centrosome13,14 and apoptosis signaling15,16. In this report, we describe our vectors of choice, in addition to describing the two consecutive manipulation steps that are necessary to efficiently generate human Tet-on cell lines (Figure 2). Moreover, besides outlining a protocol for the generation of human Tet-on cell lines, we will discuss critical aspects regarding the technical procedures and the characterization of Tet-on cells.

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible Tet-on shRNA or cDNA Expression

A rapid and simple way to generate human cell lines with inducible and reversible cDNA overexpression or shRNA-mediated knock-down of the gene of interest. This method enables researchers to reliably and highly reproducibly manipulate cell lines that are difficult to alter by transient transfection methods or conventional knockdown/knockout strategies.

テトラサイクリン誘導性（テトオン）shRNAまたはcDNA発現で安定ヒト細胞株の世代

A major approach in  the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of  genes of interest in selected cell lines, with the aim ...

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes precursor mRNA beyond the end of mature RNAs, and an active process of endonuclease activity is required at a specific site. Cleavage of the precursor RNA normally occurs 10-30 nt downstream from the consensus polyA site (AAUAAA) after the CA dinucleotides. Proteins from the cleavage complex, a multifactorial protein complex of approximately 800 kDa, accomplish this specific nuclease activity. Specific RNA sequences upstream and downstream of the polyA site control the recruitment of the cleavage complex. Immediately after cleavage, pre-mRNAs are polyadenylated by the polyA polymerase (PAP) to produce mature stable RNA messages.
Processing of the 3&#8217; end of an RNA transcript may be studied using cellular nuclear extracts with specific radiolabeled RNA substrates. In sum, a long 32P-labeled uncleaved precursor RNA is incubated with nuclear extracts in vitro, and cleavage is assessed by gel electrophoresis and autoradiography. When proper cleavage occurs, a shorter 5&#8217; cleaved product is detected and quantified. Here, we describe the cleavage assay in detail using, as an example, the 3&#8217; end processing of HIV-1 mRNAs.

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

RNA polymerase II synthesizes a precursor RNA that extends beyond the 3' end of the mature mRNA. The end of the mature RNA is generated cotranscriptionally, at a site dictated by RNA sequences, via the endonuclease activity of the cleavage complex. Here, we detail the method to study cleavage reactions in vitro.

ロボロリーパインPtGen2 cDNAマイクロアレイの処理

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