라벨, 하이브리드화, 그리고 세척 프로토콜은 여기에 몇 가지 게놈 연구 (TIGR), 밴더빌트 Microarray 공유 리소스 (VMSR)에서 박사 숀 레비의 연구소에서 동시에 박사 J. 쿼큰부쉬에 의해 이전에 개발된들에게 수정하고, 박사를 포함 롭 알바 보이스 톰슨 연구소 (BTI) 코넬 대학교에서있는 동안.

(참고 제 1-4 비디오 시연되지 않음) 싸이 - 라벨 대상 cDNA 준비 어떤 다음은 우리가 hybridizations를 microarray하기 전에 로블롤리 파인 총 RNA 및 cDNA 간접 라벨에서 cDNA 합성을 위해 사용하는 프로토콜입니다. 몇 아닌 사소한 수정이되었습니다 있지만, 아래의 프로토콜 Invitrogen의 어깨 간접 cDNA 라벨링 키트와 함께 제공된 설명서에서 비슷합니다. 1 부 : 첫 번째 - 스트랜드 cDNA 합성 반응 <ol><li> 믹스와 간단히 사용하기 전에 각각의 키트 구성 요소를 스핀. </li><li> 다음과 같이 반응 준비 : <ul><li> Xμl DEPC - H 2 O </li><li> Xμl 총 RNA 20 μg / 반응 (앰비온의 터보 DNase와 pretreated) </li><li> 2μl 닻을 Oligo (DT) 20 프리머 (2.5μg/μl) </li><li> 1μl 랜덤 Hexamer 프라이머 </li><li style="list-style:none;"> 총 볼륨 = 18μl </li></ul></li><li> 70 1-2분 위해 얼음 ° 후 5 분 C, 장소에서 튜브를 품어. </li><li> 얼음 각 반응 관에 다음 추가 : <ul><li> 6μl 5 배 첫 번째 - 스트랜드 버퍼 </li><li> 1.5μl 0.1M DTT </li><li> 1.5μl 10mM dNTP 혼합 </li><li> 1μl RNaseOUT (40U/μl) </li><li> 2μl 어깨 III RT (400U/μl) </li></ul></li><li> 부드럽게 믹스와 짧게 스핀. 45 박 튜브를 품어 ° C. </li><li> 각 반응 관에 1M NaOH의 15μl를 추가하고 철저히 섞는다. </li><li> 10 분 70 ° C에서 튜브를 품어. </li><li> 1M HCL의 15μl를 추가, 부드럽게 섞는다. </li><li> 20μl 3M의 아세트산 나트륨 (산도 5.2) 추가, 가볍게 섞는다. </li></ol> 2 부 : 퓨리화잉 첫째 - 스트랜드 cDNA. <ol><li> (단계 1.9에서) cDNA에 버퍼를로드 중 500μl를 추가하고 잘 섞는다. </li><li> 컬렉션 튜브에 스냅 정화 열 (간접 라벨링 키트와 함께 제공된) 장소 및 열에 cDNA를로드합니다. </li><li> 1 분 상온에서 1만4천그램에서 스핀하며 흐름을 통해 폐기하십시오. </li><li> 같은 컬렉션 튜브에 SNAP 칼럼을 놓고 씻으 버퍼의 500μl를 추가합니다. </li><li> 1 분 상온에서 1만4천그램에서 스핀하며 흐름을 통해 폐기하십시오. </li><li> 세 500μl 세척의 총 단계 2.4 및 2.5을 세 번 반복합니다. </li><li> 일분 잠깐 실온에서 14,000g에서 한 번 더 돌려, 흐름을 통해 폐기하십시오. </li><li> 새로운 1.5ml 튜브에 스냅 열 놓으십시오. </li><li> SNAP 칼럼 1 분간 온도는 실온에서 품어 컬럼에 따뜻한 DEPC - 물 (50 ° C)의 50μl를 추가합니다. 1 분 온도는 실온에서 1만4천그램에서 스핀을 통해 cDNA를 Elute. </li><li> DEPC - 물이 따뜻하고의 100μl와 eluent에 대해 동일한 1.5ml 튜브를 사용하여, 단계 2.9를 반복합니다. </li><li> 단계 2.9 및 2.10에서 eluent로 3M의 아세트산 나트륨의 20μl (산도 5.2) 추가합니다. </li><li> 튜브 및 혼합에 글리코겐 (20mg/ml)의 3μl를 추가합니다. </li><li> 얼음처럼 차가운 100 % EtOH의 500μl를 추가 잘 혼합하고, -80 1 시간 동안 튜브를 품어 ° C. </li><li> 4 14,000g에서 튜브를 스핀 ° C를 20 분. 조심스럽게 뜨는을 제거합니다. </li><li> 얼음처럼 차가운 70 % EtOH의 500μl를 추가하고 4 1만4천그램에서 튜브를 스핀 ° C를 오분하십시오. 조심스럽게 뜨는을 제거합니다. </li><li> 5 분 샘플을 공기 건조, 모든 EtOH가 제거되었는지 확인합니다. </li><li> 5 분 37 ° C를 2X 커플링 버퍼 따뜻하고 따뜻한 2X 커플링 버퍼의 5μl에서 cDNA 샘플을 다시 일시 중지합니다. </li><li> 50 cDNA / 커플링 버퍼를 가열 ° 10 분 와동에 대한 C 음. 귀하의 cDNA 펠렛 완전히 2X 커플링 버퍼에 다시 일시 중지되었는지 확인하십시오. </li></ol> 3 부 : 형광 염료와 라벨링 반응을 비교할 때, 빛을 염료 솔루션의 노출을 최소화하기 위해주의하십시오. 또한, DMSO는 흡습이며 염료의 NHS 에스테르와 반응하여 크게 커플링 반응 효율을 감소시킬 공기에서 습기를 흡수합니다. -20 ° C에서 호박 나사 뒤덮힌 유리병에 키트에 제공된 DMSO 유지하고, 응축을 방지하기 위해 열기 전에 상온에 약병을 따뜻한 보자. 이 키트와 함께 제공만을 DMSO를 사용하십시오. <ol><li> 싸이 - 3 싸이 - 5 염료 중 하나 패킷을 열고 염색 약병에 직접 D​​MSO의 75μl를 추가합니다. </li><li> 단계 2.18에서 튜브에 DMSO / 염색 솔루션의 5μl를 추가합니다. </li><li> 잘 믹스 1 시간 동안 어둠 속에서 실온에서 튜브를 품어. </li><li> 염료 결합된 cDNA 솔루션 3M의 아세트산 나트륨의 20μl (산도 5.2) 추가합니다. </li><li> cDNA 솔루션에 버퍼를로드 중 500μl를 추가합니다. vortexing하여 잘 섞는다. </li><li> 명확한 회수 관에 스냅 열 플레이스와 cDNA / 버퍼 솔루션을로드합니다. </li><li> 1 분 상온에서 1만4천그램에서 스핀하며 흐름을 통해 폐기하십시오. </li><li> 같은 컬렉션에서 스냅 열 플레이스튜브, 열 워시 버퍼의 500μl를 추가합니다. </li><li> 1 분 상온에서 1만4천그램에서 스핀하며 흐름을 통해 폐기하십시오. </li><li> 반복 3 단계를 반복합니다. 8-3.9 세 세 500μl 세척의 총 시간. </li><li> 1 분 상온에서 1만4천그램에서 한 번 더 돌려, 흐름을 통해 폐기하십시오. </li><li> 새로운 황색 수집 관에 스냅 열 놓으십시오. </li><li> 1 분 상온에서 SNAP 칼럼과 부화 따뜻한 DEPC - 물 (50 ° C)의 65μl를 추가합니다. </li><li> 1 분 상온에서 1만4천그램에서 스핀과 흐름을 통해 수집합니다. 흐름을 통해 귀하의 cDNA 염료 결합 정화의 60μl 포함해야합니다. </li></ol> 파트 4 : 라벨 절차를 평가. <ol><li> 각 싸이 - cDNA 라벨을 평가하기위한 분광 광도계 분석을 실시. 합성 cDNA의 pmol의 총 수를 계산 : [OD 260 X하셨습니다. X 37ng/μl X 10 3 NG / PG] / 324.5 PG / pmol. 각 라벨 반응에 대한 통합 싸이 염색의 총 pmol을 계산 : pmol Cy3 = [OD 550 X하셨습니다.] / 0.15; pmol Cy5 = [OD 650 X하셨습니다.] / 0.25. 다음 각 반응에 대한 pmol / 염기 색소 비율 pmol을 계산합니다. 최적의 반응의&gt; 6000pmol을 생성하는 cDNA (사람마다 60ul)&gt; 싸이 염색의 200pmol (60ul 당), 그리고 &lt;30 뉴클레오 티드 / 염료 비율. </li></ol> 파트 5 : 슬라이드 사전 와시 <ol><li> PtGen2 배열 코닝 UltraGaps 슬라이드 (아미노 실란 코팅)에 인쇄 cDNAs는 UV - 상호 연결되어 있습니다됩니다. 인쇄 명소 인해 버퍼의 높은 소금 콘텐츠를 명확하게 볼 수 있습니다. </li><li> 인쇄 영역 (옵션)의 상위 및 하위 영역에 대한 슬라이드를 표시하는 다이아몬드 팁 펜을 사용합니다. </li><li> 넣어 약 250mL 43 미리 예열 ° 현미경 슬라이드 세척 접시 (3 &quot;X 4&quot;)에 C 0.2 % SDS 솔루션입니다. </li><li> 플레이스 슬라이드는 슬라이드에있는 염분을 제거하는 15-20 번 매우 적극적으로 SDS 솔루션에 슬라이드 랙 및 다이빙에 미리 hybridized 수 있습니다. </li><li> 포셉를 사용하면, 조심스럽게 랙에서 슬라이드를 제거하고 43 ° C. 미리 예열되어 사전 하이브 리다이 제이션 버퍼 (5 배 SSC, 0.1 % SDS, 1 % BSA)이 포함된 코플린있는 항아리에 넣어 적어도 한 시간 동안 43 ° C에서 알을 품다. </li></ol> 6 부 : 사전 하이브 리다이 제이션 <ol><li> 오 슬라이드 세척 요리 millipure DH 2 O 가득 각과 분자 학년 이소프로판올 가득 한 코플린 병을 설정합니다. 슬라이드 랙에 슬라이드를 삽입하고 20 회 각각 그런 일은하여 다섯 접시를 통해 순차적으로 처리합니다. </li><li> 제거 슬라이드 microfuge (Chipmate의 benchtop, 2 순위)로 슬라이드에 즉시 이소프로판올과 장소에서 다섯 번째 물 세척 및 물놀이 5-6 시간에서 한 번에 두 슬라이드 건조에 1 분 돌린다. </li><li> 압축 공기와 깨끗한 슬라이드 0.22 μm의 필터 카트리지를 통해 필터와 게놈 하이브 리다이 제이션 솔루션 회의소에 직면하고있는 바 코드를 넣으십시오. </li><li> 클린 LifterSlips ™ 필터링 공기와 아래로 직면하고있는 흰색 스트립과 함께 슬라이드에 위치를 함께. 부드럽게 슬라이드 리프터 용지를 정렬하기 위해 노란색 pipet 팁을 사용 (70 % 에탄올에서 ™ 첫번째 LifterSlips 워싱하는 것은 선택 사항입니다. 우리는 그것이 불필요한 것으로 나타났습니다.) </li></ol> 7 부 : 하이브 리다이 제이션 어두운 또는 낮은 조명에서 수행되어야합니다. <ol><li> hybridized로 각 슬라이드 들어, 싸이 - 5의 양을 계산하고 싸이 - 3 각 대상의 50 75pmol를 제공하기 위해 cDNA 표시. 37-45에서 하나의 튜브로 그 금액을 결합하여 열 설정을 진공 건조기에서 건조 ° C. 완전히 건조하지 마십시오! </li><li> 말린 60mL 하이브 리다이 제이션 버퍼에 프로브 (그날 만든 신선한)와 소용돌이를 간단히 Resuspend. </li><li> 30 초 동안 95 ° C 목욕 후 빠른 microfuge 5 분 동안 resuspended cDNAs을 품어. </li><li> 천천히 슬라이드의 하단에있는 슬라이드 LifterSlip ™ 접합 (바코드 엔드)에서 pipetting하여 전체 resuspended 프로브 볼륨을로드합니다. 슬라이드 모세의 행동 방식에 의해로드됩니다. (일부는 슬라이드에 피펫 후 부드럽게 LifterSlip을 오버레이 ™ 이것이 거품을 경우 번짐 유물을 현장으로 이어질 수있는 배치 후 LifterSlip ™를 이동할 수 없기 때문에 한 번에 그칠 방법이다하는 것을 선호) </li><li> 각각의 습도에 100mM DTT의 장소 20uL 잘 챔버의 끝에 위치하고 있습니다. </li><li> 챔버에서 최고를 놓고 캠 나사를 조입니다. 50-60 RPM에서 부드러운 교반과 12~18시간에 대한 48 ° C의 물을 욕조에 알루미늄 호일과 담가와 챔버 커버. </li></ol> 8 부 : 포스트 하이브 리다이 제이션 씻는다 모든 세척은 어두운 또는 낮은 조명에서 수행되어야합니다. 슬라이드는 최종 단계까지 건조 허용해서는 안됩니다. <ol><li> 1) W : 씻으 솔루션 # 1 @ 53 다음 중 각 250mL 가득 ° C, 4 슬라이드 세척 접시 가득 한 코플린 병을 설정애쉬 솔루션 # 1 @ 53 ° C, 2) 와시 솔루션 # 2 @ 상온, 3 &amp; 4) 와시 솔루션 # 3 @ 실내 온도 담긴 두개의 요리. </li><li> 조심스럽게 하이브 리다이 제이션 실에서 슬라이드를 제거하고 코플린 용기에 한 번에 두 장소. 30 초 남겨 후 천천히 슬라이드를 채취해서 리프터 신청서는 병 속에 남아있게됩니다. 플레이스 슬라이드 랙 및 씻으 솔루션 # 1 (1X SSC, 0.2 % SDS, 앞서 열을 가하다 43 ° C)에 즉시 담가에 슬라이드. 모든 LifterSlips 제거하고 세탁하는 모든 슬라이드가 씻으 솔루션 # 1 접시에 때까지 반복합니다. 노골적인 협상을 10 번 랙를 플런지 아래. </li><li> 53 플레이스 요리 ° 10 분 50-100 rpm으로 잡고 공기 통에 C. </li><li> 상온에서 해결책 # 2 (0.1X SSC, 0.2 % SDS), 플런지 10 배, 그리고 부화를 씻어 랙을 전송, 10 분 동안 흔들어 천천히. </li><li> 딥 랙은 첫 번째 씻으 솔루션 # 3 (0.1X SSC)에 15 배는 잔여 SDS는 씻어 솔루션 # 2에서 이월 제거합니다. 두 번째 와시 솔루션의 장소 랙은 # 3 요리, 플런지 10 배, 그리고 10 분 동안 흔들어 천천히. </li><li> 원심 분리기에 50mL 팰컨 뒤덮힌 튜브와 스핀 @ 1,500 RPM에서 플레이스 슬라이드 스윙 버킷 로터가 장착되어. 침대 용기를 조명하기 위해 슬라이드를 제거, 우리는 (오존 수준이 높은 경우 이것은 여름에 특히 싸이의 염료, 싸이 - 5의 산화를 감소 단단히 다른 알루미늄 호일로 덮여 팔콘 튜브, 그리고 질소 가스와 함께 튜브에서 퍼지 공기 캡을 사용하여 ). 슬라이드 전에 질소 정화 튜브에 검색하기 위해 몇 시간 동안 저장할 수 있습니다, 스캐닝이 즉시 세척 후 완료되면 그러나, 최상의 신호 결과를 얻을 수있다. </li></ol> 파트 9 : 데이터 수집 및 통계 분석 <ol><li> 스캔 이미지 데이터는 PerkinElmer의 ScanArray에 수집됩니다. 우리는 10 미크론 스캔 설정 및 균형 Cy3와 제조 업체의 지침에 따라 같은 라인 조정 방법을 사용하여 Cy5 신호를 사용합니다. </li><li> TIF 파일은 gridded하고 원시 신호 데이터 ImaGene 버전 7.5 (BioDiscovery (주), 엘 세군도, CA)를 수집 및 여과 </li><li> 데이터 정규화 및 통계 유효 differentially 표현 수종을 결정하기 위해 평가 BRB 배열 도구 버전과 함께 이루어집니다. 3.7. </li><li> coordinately 표현 유전자 결정을 촉진하기위한 패턴 분석 유전자 발현 패턴 분석 소프트웨어 (GEPAS) 버전과 함께 이루어집니다. 3.1. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1182/Figure1_WWLorenz-1.png" alt="그림 1" /> 그림 1.이 protoco 난을 사용하여 처리 PtGen2 배열의 예 <img src="/files/ftp_upload/1182/Figure2_WWLorenz.png" alt="그림 2" /> 그림 2. 표준 하이브 리다이 제이션 및 세탁 프로토콜을 사용하여 처리 PtGen2 배열의 예.

<ol>
	<li>Lorenz, W. W., Sun, F., Liang, C., Kolychev, D., Wang, H., Zhao, X., Cordonnier-Pratt, M. M., Pratt, L. H., Dean, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+stress-responsive+genes+in+loblolly+pine+(Pinus+taeda)+roots+identified+by+analyses+of+expressed+sequence+tag+libraries.">Water stress-responsive genes in loblolly pine (Pinus taeda) roots identified by analyses of expressed sequence tag libraries.</a> Tree Physiol. 26, 1-16 (2006).</li><li>Lorenz, W. W., Dean, J. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> unpublished data. , .</li><li>Hegde, P., Qi, R., Abernathy, K., Gay, C., Dharap, S., Gaspard, R., Hughes, J. E., Snesrud, E., Lee, N., Quackenbush, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+concise+guide+to+cDNA+microarray+analysis.">A concise guide to cDNA microarray analysis.</a> Biotechniques. 29, 548-562 (2000).</li><li>Alba, R., Fei, Z., Payton, P., Liu, Y., Moore, S. L., Debbie, P., Cohn, J., D'Ascenzo, M., Gordon, J. S., Rose, J. K. C., Martin, G., Tanksley, S. D., Bouzayen, M., Molly, M., Jahn, M. M., Giovannoni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESTs,+cDNA+microarrays,+and+gene+expression+profiling:+tools+for+dissecting+plant+physiology+and+development.">ESTs, cDNA microarrays, and gene expression profiling: tools for dissecting plant physiology and development.</a> The Plant Journal. 39, 697-714 (2004).</li><li>Lorenz, W. W., Simões, M., Miguel, C., Dean, J. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Gene+Expression+changes+in+Pinus+species+using+a+Loblolly+pine+cDNA+microarray.">Analysis of Gene Expression changes in Pinus species using a Loblolly pine cDNA microarray.</a> IUFRO-CTIA 2008 Joint Conference. , (2008).</li><li>Simões, M., Lorenz, W. W., Alba, A., Gonçalves, S., Dean, J., Miguel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+gene+expression+analysis+during+P.+pinaster+embryo+development.">Global gene expression analysis during P. pinaster embryo development.</a> 7th Plant Genomics European Meeting. , (2008).</li></ol>

PtGen2는 로블롤리 파인 연구 커뮤니티 주로 사용되도록 설계되었고 최근 개발, 사용자 정의 cDNA microarray입니다. 생성된 예비 결과는 지금까지 transcriptional 가뭄 스트레스에 대한 응답으로 발생하는 이벤트뿐만 아니라 해양 소나무, 피너스 피나 우리가 5,6의 배아 발달 동안 발생하는 모니터링 기능 변경 사항으로의 평가에 유용한 도구가 될 수있는 배열을 보였습니다 또한 최근 5<...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Pre-hybridization Buffer</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5X SSC, 0.1% SDS, 1% BSA</td>
</tr>
<tr>
<td>Hybridization Buffer</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>30% formamide, 5X SSC, 5X Denhardt&#x2019;s, 1% PolyA RNA (Invitrogen, POLYA.GF), 0.1% SDS</td>
</tr>
<tr>
<td>Wash Solution #1</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1X SSC, 0.2% SDS, preheat to 43&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Wash Solution #2</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>0.1X SSC, 0.2% SDS</td>
</tr>
<tr>
<td>Wash Solution #3</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>0.1X SSC</td>
</tr>
<tr>
<td>Isopropyl Alcohol</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>34959-2.5L</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50mL Conical Tubes</td>
<td>Other</td>
<td>Falcon&#x2122;</td>
<td>352070</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15mL Conical Tubes</td>
<td>Other</td>
<td>Falcon&#x2122;</td>
<td>352196</td>
<td>Use this or a similar cap placed at the bottom of each 50mL conical tube during centrifugation</td>
</tr>
<tr>
<td>Coplin Jar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Wheaton&#x2122;</td>
<td>900520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Staining Dish & Rack </td>
<td>Other</td>
<td>Wheaton&#x2122;</td>
<td>900200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Albumin from bovine serum (BSA)</td>
<td>Other</td>
<td>Sigma&#x2122;</td>
<td>A-9418</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PolyA RNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen&#x2122;</td>
<td>POLYA.GF</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SuperScriptTM Indirect cDNA Labeling </td>
<td>Kit</td>
<td>Invitrogen&#x2122;</td>
<td>L1014-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Turbo DNase</td>
<td>Kit</td>
<td>Ambion</td>
<td>AM1907</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy-5 Dye</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE&#x2122;</td>
<td>PA25001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy-3 Dye</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE&#x2122;</td>
<td>PA23001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LifterSlips&trade;</td>
<td>Other</td>
<td>Erie Scientific Company&#x2122; </td>
<td>25X601</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HybChambers</td>
<td>Equipment</td>
<td>GeneMachines</td>
<td>JHYB200003</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

processing the loblolly pine ptgen2 cdna microarray

PtGen2이 증폭 로블롤리 파인 에스트을 포함하는 26,496 기능 cDNA microarray입니다. 배열은 소나무와 다른 침엽수 종의 유전자 발현을 연구 연구자가 사용하는 우리 실험실에서 생산됩니다. PtGen2는 로블롤리 파인 우리의 유전자 발견 노력의 결과로 개발되었고, 주로 뿌리 조직에서 식별 시퀀스로 구성되어 있습니다,뿐만 아니라 바늘과 줄기에서. 1,2 PtGen2 서로 다른 레이블 싸이 염색 코니퍼 대상 cDNAs을 hybridizing하여 테스트되었습니다 모두 증폭이 아닌 증폭 간접 라벨링 방법을, 또한 하이브 리다이 제이션 및 세척 조건의 번호와 테스트 사용합니다. 이 비디오는 이전에 개발 절차에 일부 수정을 사용하여뿐만 하이브리드화 후로 사전 하이브리드화 전후 슬라이드의 취급 및 처리에 초점을 맞추고 있습니다. 3,4도 포함, 텍스트 형식에만 생성에 사용되는 프로토콜 있으며, 레이블 및 대상 cDNA s의 청소뿐만 아니라 소프트웨어에 대한 정보는 다운 스트림 데이터 처리에 사용. PtGen2 완전히 제거하기 어려울 수 있습니다 소금의 높은 농도를 포함하는 독점 인쇄 버퍼와 함께 인쇄됩니다. 슬라이드는 미리 하이브리드화하기 전에 따뜻한 SDS 솔루션에 처음 세탁 있습니다. 사전 하이브리드화 후 슬라이드는 남은 염분의 제거를 완료하기 위해 물을 몇 가지 변경 사항 적극적으로 씻어 수 있습니다. LifterSlips ™는 다음 청소 및 슬라이드에 위치하고 cDNA로 분류하는 것은 신중 아르 슬라이드에 걸쳐 샘플에도 유통 제공하는 모세관 작용의 방법으로 microarray에로드하고, 거품 설립의 기회를 줄일 수있다. 배열에 목표의 하이브 리다이 제이션은 48 ° C에서 높은 습도 조건에서 이루어집니다. 하이브리드화 후, 표준 세척 일련의는 53에서 완료 ° C 및 확장 시간을위한 실내 온도. 이 기술을 이용하여 처리 PtGen2 슬라이드 소금을 줄이고 SDS - 파생 유물 자주 배열이 덜 엄격하게 처리되면 보았다. 여러 코니퍼 RNA 소스에서 파생된 목표를 Hybridizing이 처리 프로토콜 적은 유물 감소 배경을 굴복하고, 배열의 다른 실험 그룹 간의 더 나은 일관성을 제공했습니다.

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Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

cDNA microarray PtGen2은 로블롤리 파인의 유전자 발현 연구를 위해 개발되었습니다<em&gt; P. taeda</em&gt; 기타 침엽수 종. 여기, 우리가 게재 사전 나은 일관성 감소 유물, 그리고 낮은 배경 수율이 배열을 함께 사용할 수있는 기술을 취급하고 세척 후 하이브 리다이 제이션.

로블롤리 파인 PtGen2 cDNA Microarray 처리

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs.  The array is produced in our laboratory for use by researchers ...

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Research

JoVE Journal

Biology

7.3K 조회수.  University of Georgia (UGA). cDNA microarray PtGen2은 로블롤리 파인의 유전자 발현 연구를 위해 개발되었습니다 P. taeda 기타 침엽수 종. 여기, 우리가 게재 사전 나은 일관성 감소 유물, 그리고 낮은 배경 수율이 배열을 함께 사용할 수있는 기술을 취급하고 세척 후 하이브 리다이 제이션.

비디오: Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

Gibberella zeae Ascospore Production and Collection for Microarray Experiments.

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) is a plant pathogen causing scab disease on wheat and barley that reduces crop yield and grain quality. F. graminearum also causes stalk and ear rots of maize and is a producer of mycotoxins such as the trichothecenes that contaminate grain and are harmful to humans and livestock (Goswami and Kistler, 2004).

The fungus produces two types of spores. Ascospores, the propagules resulting from sexual reproduction, are the main source of primary infection.  These spores are forcibly discharged from mature perithecia and dispersed by wind (Francl et al 1999). Secondary infections are mainly caused by macroconidia which are produced by asexual means on the plant surface. To study the developmental processes of ascospores in this fungus, a procedure for their collection in large quantity under sterile conditions was required. Our protocol was filmed in order to generate the highest level of information for understanding and reproducibility; crucial aspects when full genome gene expression profiles are generated and interpreted. In particular, the variability of ascospore germination and biological activity are dependent on the prior manipulation of the material. The use of video for documenting every step in ascospore production is proposed in order to increase standardization, complying with the increasingly stringent requirements for microarray analysis. The procedure requires only standard laboratory equipment. Steps are shown to prevent contamination and favor time synchronization of ascospores.

To study the developmental processes of ascospores in Gibberella zeae, a procedure for collection under sterile conditions is filmed in order to generate the highest level of information for protocol description. This should facilitate the reproducibility of the experiment, a crucial aspect when full genome expression profile tests are implemented.

Microarray 실험에 대한 Gibberella zeae Ascospore 생산 및 수집.

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) is a plant pathogen causing scab disease on wheat and barley that reduces crop yield and grain ...

연구

생물학

The Microfluidic Probe: Operation and Use for Localized Surface Processing

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. Microfluidics is commonly associated with closed microchannels which limit their use to samples that can be introduced, and cultured in the case of cells, within a confined volume. On the other hand, micropipetting system have been used to locally perfuse cells and surfaces, notably using push-pull setups where one pipette acts as source and the other one as sink, but the confinement of the flow is difficult in three dimensions. Furthermore, pipettes are fragile and difficult to position and hence are used in static configuration only. 
The microfluidic probe (MFP) circumvents the constraints imposed by the construction of closed microfluidic channels and instead of enclosing the sample into the microfluidic system, the microfluidic flow can be directly delivered onto the sample, and scanned across the sample, using the MFP. . The injection and aspiration openings are located within a few tens of micrometers of one another so that a microjet injected into the gap is confined by the hydrodynamic forces of the surrounding liquid and entirely aspirated back into the other opening. The microjet can be flushed across the substrate surface and provides a precise tool for localized deposition/delivery of reagents which can be used over large areas by scanning the probe across the surface. 
In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer.

In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer solution.

Microfluidic 프로브 : 운영 및 현지화된 표면 처리에 사용

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. ...

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

유전자 발현 분석을위한 배아 Zebrafish 및 cDNA 합성에서 RNA 격리

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

Zebrafish Oligonucleotide Microarray의 플랫폼을 사용하여 글로벌 유전자 발현 분석

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and prognosis of disease. While clinical proteomic methods vary widely, a common characteristic is the need for (i) extraction of proteins from extremely heterogeneous fluids (i.e. serum, whole blood, etc.) and (ii) extensive biochemical processing prior to analysis. Here, we report a new digital microfluidics (DMF) based method integrating several processing steps used in clinical proteomics. This includes protein extraction, resolubilization, reduction, alkylation and enzymatic digestion. Digital microfluidics is a microscale fluid-handling technique in which nanoliter-microliter sized droplets are manipulated on an open surface. Droplets are positioned on top of an array of electrodes that are coated by a dielectric layer - when an electrical potential is applied to the droplet, charges accumulate on either side of the dielectric. The charges serve as electrostatic handles that can be used to control droplet position, and by biasing a sequence of electrodes in series, droplets can be made to dispense, move, merge, mix, and split on the surface. Therefore, DMF is a natural fit for carrying rapid, sequential, multistep, miniaturized automated biochemical assays. This represents a significant advance over conventional methods (relying on manual pipetting or robots), and has the potential to be a useful new tool in clinical proteomics.
Mais J. Jebrail, Vivienne N. Luk, and Steve C. C. Shih contributed equally to this work.
Sergio L. S. Freire's current address is at the University of the Sciences in Philadelphia located at 600 South 43rd Street, Philadelphia, PA 19104.

Digital Microfluidics is a technique characterized by the manipulation of discrete droplets (~nL - mL) on an array of electrodes by the application of electrical fields. It is well-suited for carrying out rapid, sequential, miniaturized automated biochemical assays. Here, we report a platform capable of automating several proteomic processing steps.

자동 Proteomic 처리를위한 디지털 Microfluidics

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine (P. taeda L.) and Other Conifer Species

Tissues isolated from conifer species, particularly those belonging to the Pinaceae family, such as loblolly pine (Pinus taeda L.), contain high concentrations of phenolic compounds and polysaccharides that interfere with RNA purification. Isolation of high-quality RNA from these species requires rigorous tissue collection procedures in the field and the employment of an RNA isolation protocol comprised of multiple organic extraction steps in order to isolate RNA of sufficient quality for microarray and other genomic analyses. The isolation of high-quality RNA from field-collected loblolly pine samples can be challenging, but several modifications to standard tissue and RNA isolation procedures greatly improve results. The extent of general RNA degradation increases if samples are not properly collected and transported from the field, especially during large-scale harvests. Total RNA yields can be increased significantly by pulverizing samples in a liquid nitrogen freezer mill prior to RNA isolation, especially when samples come from woody tissues. This is primarily due to the presence of oxidizing agents, such as phenolic compounds, and polysaccharides that are both present at high levels in extracts from the woody tissues of most conifer species. If not removed, these contaminants can carry over leading to problems, such as RNA degradation, that result in low yields and a poor quality RNA sample. Carryover of phenolic compounds, as well as polysaccharides, can also reduce or even completely eliminate the activity of reverse transcriptase or other polymerases commonly used for cDNA synthesis. In particular, RNA destined to be used as template for double-stranded cDNA synthesis in the generation of cDNA libraries, single-stranded cDNA synthesis for PCR or qPCR's, or for the synthesis of microarray target materials must be of the highest quality if researchers expect to obtain optimal results. RNA isolation techniques commonly employed for many other plant species are often insufficient in their ability to remove these contaminants from conifer samples and thus do not yield total RNA samples suitable for downstream manipulations. In this video we demonstrate methods for field collection of conifer tissues, beginning with the felling of a forty year-old tree, to the harvesting of phloem, secondary xylem, and reaction wood xylem. We also demonstrate an RNA isolation protocol that has consistently yielded high-quality RNA for subsequent enzymatic manipulations.

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine P. taeda L. and Other Conifer Species

Many plant tissues, including phloem and xylem from loblolly pine (Pinus taeda L.), contain high levels of phenolics and polysaccharides that interfere with RNA purification. This presentation discusses techniques for the harvest of field-grown tissues and isolation of RNA of sufficient quality for microarrays and other genomic analyses.

로블롤리 파인로부터 RNA 분리의 개선 방법 ( P. taeda L.) 및 기타 코니퍼 종

Tissues isolated from conifer species, particularly those belonging to the Pinaceae family, such as loblolly pine (Pinus taeda L.), contain high ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray 분석을위한 Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Performing Custom MicroRNA Microarray Experiments

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1. Complex genomes encode at least hundreds of miRNAs, which primarily inhibit the expression of a vast number of target genes post-transcriptionally 2, 3. miRNAs control a broad range of biological processes 1. In addition, altered miRNA expression has been associated with human diseases such as cancers, and miRNAs may serve as biomarkers for diseases and prognosis 4, 5. It is important, therefore, to understand the expression and functions of miRNAs under many different conditions.
Three major approaches have been employed to profile miRNA expression: real-time PCR, microarray, and deep sequencing. The technique of miRNA microarray has the advantage of being high-throughput, generally less expensive, and most of the experimental and analysis steps can be carried out in a molecular biology laboratory at most universities, medical schools and associated hospitals. Here, we describe a method for performing custom miRNA microarray experiments. A miRNA probe set will be printed on glass slides to produce miRNA microarrays. RNA is isolated using a method or reagent that preserves small RNA species, and then labeled with a fluorescence dye. As a control, reference DNA oligonucleotides corresponding to a subset of miRNAs are also labeled with a different fluorescence dye. The reference DNA will serve to demonstrate the quality of the slide and hybridization and will also be used for data normalization. The RNA and DNA are mixed and hybridized to a microarray slide containing probes for most of the miRNAs in the database. After washing, the slide is scanned to obtain images, and intensities of the individual spots quantified. These raw signals will be further processed and analyzed as the expression data of the corresponding miRNAs. Microarray slides can be stripped and regenerated to reduce the cost of microarrays and to enhance the consistency of microarray experiments. The same principles and procedures are applicable to other types of custom microarray experiments.

A simple procedure of performing custom microRNA microarray experiments is described. The steps include isolating RNA, labeling RNA and reference DNA, hybridizing the samples to microarrays, scanning the microarrays, quantifying and analyzing hybridization signals.

사용자 정의 MicroRNA의 Microarray 실험을 수행

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1.  Complex genomes encode ...

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA Expression

A major approach in the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of genes of interest in selected cell lines, with the aim to reveal one or several of the gene's function(s) using transient/stable overexpression or knockdown of the gene of interest. Unfortunately, for various cell biological investigations this approach is unsuitable when manipulations of gene expression result in cell growth/proliferation defects or unwanted cell differentiation. Therefore, researchers have adapted the Tetracycline repressor protein (TetR), taken from the E. coli tetracycline resistance operon1, to generate very efficient and tight regulatory systems to express cDNAs in mammalian cells2,3. In short, TetR has been modified to either (1) block initiation of transcription by binding to the Tet-operator (TO) in the promoter region upon addition of tetracycline (termed Tet-off system) or (2) bind to the TO in the absence of tetracycline (termed Tet-on system) (Figure 1). Given the inconvenience that the Tet-off system requires the continuous presence of tetracycline (which has a half-life of about 24 hr in tissue cell culture medium) the Tet-on system has been more extensively optimized, resulting in the development of very tight and efficient vector systems for cDNA expression as used here.
Shortly after establishment of RNA interference (RNAi) for gene knockdown in mammalian cells4, vectors expressing short-hairpin RNAs (shRNAs) were described that function very similar to siRNAs5-11. However, these shRNA-mediated knockdown approaches have the same limitation as conventional knockout strategies, since stable depletion is not feasible when gene targets are essential for cellular survival. To overcome this limitation, van de Wetering et al.12 modified the shRNA expression vector pSUPER5 by inserting a TO in the promoter region, which enabled them to generate stable cell lines with tetracycline-inducible depletion of their target genes of interest.
Here, we describe a method to efficiently generate stable human Tet-on cell lines that reliably drive either inducible overexpression or depletion of the gene of interest. Using this method, we have successfully generated Tet-on cell lines which significantly facilitated the analysis of the MST/hMOB/NDR cascade in centrosome13,14 and apoptosis signaling15,16. In this report, we describe our vectors of choice, in addition to describing the two consecutive manipulation steps that are necessary to efficiently generate human Tet-on cell lines (Figure 2). Moreover, besides outlining a protocol for the generation of human Tet-on cell lines, we will discuss critical aspects regarding the technical procedures and the characterization of Tet-on cells.

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible Tet-on shRNA or cDNA Expression

A rapid and simple way to generate human cell lines with inducible and reversible cDNA overexpression or shRNA-mediated knock-down of the gene of interest. This method enables researchers to reliably and highly reproducibly manipulate cell lines that are difficult to alter by transient transfection methods or conventional knockdown/knockout strategies.

테트라싸이클린-inducible (Tet-에서) shRNA 또는 cDNA 표현과 안정적인 인간 세포 라인의 생성

A major approach in  the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of  genes of interest in selected cell lines, with the aim ...

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes precursor mRNA beyond the end of mature RNAs, and an active process of endonuclease activity is required at a specific site. Cleavage of the precursor RNA normally occurs 10-30 nt downstream from the consensus polyA site (AAUAAA) after the CA dinucleotides. Proteins from the cleavage complex, a multifactorial protein complex of approximately 800 kDa, accomplish this specific nuclease activity. Specific RNA sequences upstream and downstream of the polyA site control the recruitment of the cleavage complex. Immediately after cleavage, pre-mRNAs are polyadenylated by the polyA polymerase (PAP) to produce mature stable RNA messages.
Processing of the 3&#8217; end of an RNA transcript may be studied using cellular nuclear extracts with specific radiolabeled RNA substrates. In sum, a long 32P-labeled uncleaved precursor RNA is incubated with nuclear extracts in vitro, and cleavage is assessed by gel electrophoresis and autoradiography. When proper cleavage occurs, a shorter 5&#8217; cleaved product is detected and quantified. Here, we describe the cleavage assay in detail using, as an example, the 3&#8217; end processing of HIV-1 mRNAs.

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

RNA polymerase II synthesizes a precursor RNA that extends beyond the 3' end of the mature mRNA. The end of the mature RNA is generated cotranscriptionally, at a site dictated by RNA sequences, via the endonuclease activity of the cleavage complex. Here, we detail the method to study cleavage reactions in vitro.