Etiketleme, hibridizasyon ve yıkama protokolleri burada bazı Dr. J. Quackenbush, Genom Araştırma (TIGR), Vanderbilt Mikroarray Paylaşımlı Kaynak (VMSR) Dr. Shawn Levy Enstitüsü&#39;nde ise daha önce geliştirilen bu modifikasyon, ve Dr. Içeren Rob Alba Boyce Thompson Enstitüsü, (BTI) Cornell Üniversitesi sırasında.

(Not 1 - 4 Bölüm Video kanıtlanmış değil) Cy-Etiketli Hedef cDNA hazırlanması Aşağıda biz döllemeler mikroarray önce Loblolly çam toplam RNA ve dolaylı cDNA etiketleme cDNA sentezi için kullanılan bir protokoldür. Olmayan birkaç önemsiz değişiklikler yapılmış olmasına rağmen, aşağıdaki protokol Invitrogen Üst Simge Dolaylı cDNA Etiketleme Kit ile birlikte verilen kullanım kılavuzuna benzer. Bölüm 1: İlk Strand cDNA Sentezi Reaksiyonu <ol><li> Mix ve kullanmadan önce kısaca her kiti bileşeni spin. </li><li> Reaksiyonlar aşağıdaki gibi hazırlayın: <ul><li> Xμl DEPC-H 2 O </li><li> Xμl toplam RNA, 20 mikrogram / reaksiyonu (Ambion Turbo DNaz ile ön işlem) </li><li> 2μl Ankrajlı Oligo (dT) 20 Primer (2.5μg/μl) </li><li> 1μl Rastgele Hexamer Astar </li><li style="list-style:none;"> Toplam Hacim = 18μl </li></ul></li><li> 70 1-2 dakika boyunca buz üzerinde ° C, daha sonra 5 dakika yer ve tüpler inkübe edin. </li><li> Her reaksiyon tüpüne buz üzerinde aşağıdakileri ekleyin: <ul><li> 6μl 5X İlk Strand tampon </li><li> 1.5μl 0.1M DTT </li><li> 1.5μl 10mM dNTP mix </li><li> 1μl RNaseOUT (40U/μl) </li><li> 2μl Üst Simge III RT (400U/μl) </li></ul></li><li> Yavaşça karıştırın ve kısaca döndürün. Gecede tüp inkübe 45 ° C. </li><li> Her reaksiyon tüpüne 1M NaOH 15μl ekleyin ve iyice karıştırın. </li><li> Tüp 70 ° C&#39;de 10 dakika inkübe edin. </li><li> 1M HCl 15μl ekleyin, hafifçe karıştırın. </li><li> 20μl 3M sodyum asetat (pH 5.2) ekleyin; hafifçe karıştırın. </li></ol> Bölüm 2: Arındırıcı İlk Strand cDNA. <ol><li> CDNA (Adım 1.9) Tampon Yükleme 500μl ekleyin ve iyice karıştırın. </li><li> SNAP Arıtma Sütun (Dolaylı Etiketleme kiti ile birlikte) bir toplama tüpüne yerleştirin ve sütun cDNA yük. </li><li> Oda sıcaklığında 1 dakika 14.000 g Spin, flow-through atın. </li><li> SNAP Sütun aynı toplama tüpü üzerine yerleştirin ve Wash Buffer 500μl eklemek. </li><li> Oda sıcaklığında 1 dakika 14.000 g Spin, flow-through atın. </li><li> Toplam üç 500μl yıkar, Adımlar 2.4 ve 2.5 üç kez tekrarlayın. </li><li> 1 dakika saniye boyunca oda sıcaklığında bir kez daha 14.000 g Spin, flow-through atın. </li><li> SNAP Sütun 1.5ml yeni bir boru üzerine yerleştirin. </li><li> SNAP Sütun ve 1 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe sütun sıcak DEPC-su (50 ° C) 50μl ekleyin. 1 dakika 14.000 gr oda sıcaklığında bir spin ile cDNA Zehir. </li><li> DEPC sıcak su 100μl ve Eluent için aynı 1.5ml tüp kullanarak, Adım 2.9 tekrarlayın. </li><li> 20μl 3M sodyum asetat (pH 5.2), 2.9 ve 2.10 adımları Eluent ekleyin. </li><li> Glikojen (20mg/ml) tüp ve karıştırın 3μl ekleyin. </li><li> Buz gibi% 100 EtOH 500μl ekle, iyice karıştırın ve 1 saat için tüp -80 inkübe ° C </li><li> 14.000 g tüp Spin 4 ° C 20 dakika. Süpernatantı dikkatlice çıkartın. </li><li> Buz% 70 EtOH 500μl ekleyin ve 4 g 14.000 tüp spin ° C 5 dakika. Süpernatantı dikkatlice çıkartın. </li><li> 5 dakika boyunca örnek Hava kuru; tüm EtOH kaldırılmış olduğundan emin olun. </li><li> 5 dakika ° 37 ° C 2X Kaplin Tampon Sıcak ve ılık 2X Kaplin Tampon 5μl cDNA örnek yeniden askıya. </li><li> 50 / cDNA Kaplin tampon Isı ° C de 10 dakika ve vorteks için iyi. CDNA pelet tamamen 2X Kaplin Tampon yeniden askıya olduğundan emin olun. </li></ol> Bölüm 3: Floresan Boya Etiketleme Reaksiyon hazırlanırken, boya çözüm ışığa maruz kalma en aza indirmek için dikkatli olun. Ayrıca, DMSO higroskopik ve boya NHS ester ile reaksiyona ve kaplin reaksiyon verimi önemli ölçüde azaltacaktır hava, nem absorbe edecektir . -20 ° C&#39;de bir kehribar vidalı kapaklı flakon kiti verilen DMSO tutun ve yoğuşmayı önlemek için açmadan önce oda sıcaklığına kadar flakon sıcak sağlar. Sadece bu kit ile birlikte verilen DMSO kullanın. <ol><li> Cy-3 veya Cy-5 Boya bir paket açın ve boya flakon doğrudan DMSO, 75μl ekleyin. </li><li> Adım 2.18 tüp DMSO / boya çözüm 5μl ekleyin. </li><li> İyice karıştırın ve tüp, karanlık oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin. </li><li> 3M sodyum asetat (pH 5.2) 20μl boya birleştiğinde cDNA çözüm ekleyin. </li><li> CDNA çözüm Tampon Yükleme 500μl ekle. Vorteks ile iyice karıştırın. </li><li> SNAP Sütun açık bir toplama tüpü üzerine yerleştirin ve cDNA / tampon çözelti yük. </li><li> Oda sıcaklığında 1 dakika 14.000 g Spin, flow-through atın. </li><li> Aynı toplama SNAP Sütun yerleştirin.tüp; Yıkama Tamponu 500μl sütun ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 1 dakika 14.000 g Spin, flow-through atın. </li><li> Tekrar 3 Adımlar. 8-3,9 üç kez, toplam üç 500μl yıkar. </li><li> 1 dakika boyunca oda sıcaklığında bir kez daha 14.000 g Spin, flow-through atın. </li><li> SNAP Sütun yeni bir kehribar toplama tüpü üzerine yerleştirin. </li><li> 1 dakika oda sıcaklığında SNAP Kolon ve inkübe sıcak DEPC-su (50 ° C) 65μl ekleyin. </li><li> 1 dakika 14.000 gr oda sıcaklığında Spin ve flow-through toplamak. Flow-through cDNA boya birleştiğinde saflaştırılmış 60μl içermelidir. </li></ol> Bölüm 4: Etiketleme Usul değerlendirilmesi. <ol><li> Her Cy-cDNA etiketleme değerlendirmek için bir spektrofotometre tahlil gerçekleştirin. Sentezlenen cDNA pmol toplam sayısını hesaplayın: [OD 260 x vol. x 37ng/μl x 10 3 ng / pg / 324,5 pg / pmol. Her etiketleme reaksiyon için toplam dahil Cy-Boya pmol hesaplayın: pmol Cy3 = [OD 550 X vol.] / 0,15; pmol Cy5 = [OD 650 X vol.] / 0,25. Sonra, her bir reaksiyon için pmol / nükleotid boya oranı pmol hesaplar. Optimal reaksiyonlar&gt; oluşturmak 6000pmol cDNA (kisi 60ul)&gt; 200pmol Cy-Boya (60ul başı), &lt;30 nükleotid / boya oranı. </li></ol> Bölüm 5: Slayt Ön Yıkama <ol><li> PtGen2 Array Corning UltraGaps slaytlar (amino-silan kaplı) yazdırılır ve cDNAs UV-çapraz bağlı. Baskı noktalar tampon yüksek tuz içeriği nedeniyle açıkça görülebilir. </li><li> Baskı alanı (isteğe bağlı) üst ve alt alanlar için slayt işaretlemek için bir elmas uçlu kalem kullanın. </li><li> Koyun yaklaşık 250 ml 43 önceden ısıtılmış ° C mikroskop lamı yıkama çanak (3 &quot;x 4&quot;) içine% 0.2 SDS çözüm. </li><li> Yeri slaytlar slayt slaytlar tuzları kaldırmak için 15-20 kez çok şiddetle SDS çözümü içine raf ve dalma-melezleşmiştir. </li><li> Forseps kullanarak dikkatli bir şekilde rafa slaytları çıkarın ve 43 ° C önceden ısıtılmış hibridizasyon Ön Tampon (5X SSC,% 0,1 SDS,% 1 BSA) içeren bir Coplin kavanoza koyun En az bir saat için 43 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol> Bölüm 6: Pre-Hibridizasyon <ol><li> Beş slayt yıkama yemekleri, her biri millipure dH 2 O dolu ve moleküler sınıf izopropanol ile dolu bir Coplin kavanoz ayarlayın . Slaytları slayt rafa yerleştirin ve her biri 20 kez dunking beş yemekleri sıralı süreci. </li><li> Kaldır beşinci slayt mikrofuge&#39;de (Chipmate masa üstü, 2 pozisyon) içine slaytlar izopropanol ve hemen su ile yıkayınız ve daldırma 5-6 kez bir seferde iki slaytlar ve kuruması için 1 dakika döndürün. </li><li> Temizlik slaytlar sıkıştırılmış hava ile 0.22 mcM filtre kartuşu süzülür ve Genomik Çözümler Hibridizasyon Odası yukarı bakacak şekilde barkod koyun. </li><li> Temiz LifterSlips ™ filtreli hava ve aşağı bakacak şekilde beyaz şeritler ile slaytları pozisyon. Sarı bir pipetlemeyin ucu hafifçe slayt kaldırıcı kayma hizalamak için kullanın (% 70 etanol ™ ilk LifterSlips Yıkama isteğe bağlıdır. Gereksiz bulduk.) </li></ol> Bölüm 7: Hibridizasyon Karanlık veya düşük ışık yapılmalıdır. <ol><li> Melezleşmiştir her slayt için, Cy-5 miktarını hesaplamak ve CY-3, her bir hedef 50-75pmol vermek için cDNA etiketli. 37-45 tek bir tüp içine bu miktarda ısı ayarı ile birleştirin ve bir vakum desikatörde kuru ° C Tamamen kuruyan kaçının! </li><li> Kurutulmuş 60ml hibridizasyon tamponu sondalar (o gün taze yapılmış) ve vorteks kısaca tekrar </li><li> 5 dakika 30 saniye süreyle 95 ° C banyo ve daha sonra hızlı mikrofuge&#39;de yeniden süspanse cDNAs inkübe edin. </li><li> Yavaş yavaş slayt altındaki slayt LifterSlip ™ kavşağı (barkod sonu) pipetleme tamamını yeniden süspanse prob hacmi yükleyin. Slayt kapiler eylem yoluyla yük olacaktır. (Bazı slayt pipet ve yavaşça LifterSlip bindirme ™ bu kabarcıkları alırsanız LifterSlip ™ bulaşması eserler noktaya yol açabilir yerleştirildikten sonra hareket etmez, çünkü bir çekim yöntemi tercih edin) </li><li> Her nem 100 mM DTT Yeri 20uL odasının ucunda yer almaktadır. </li><li> Odanın en üst yerleştirin ve cam vidalarını sıkın. Kapak alüminyum folyo ve yavaşça sallanarak rpm&#39;de 50-60 ile 12-18 saat 48 ° C su banyosu içine batırmayın odası. </li></ol> Bölüm 8: Post-Hibridizasyon yıkar Tüm yıkar, karanlık veya düşük ışık yapılmalıdır . Slaytlar son adıma kadar kuruması için asla izin verilmemeli. <ol><li> 1) W: Yıkama Çözüm # 1 @ 53 ° C Aşağıdaki her 250 ml ile dolu ve dört slayt yıkama yemekleri ile dolu bir Coplin kavanozkül Çözüm # 1 @ 53 ° C, 2) Yıkama Çözüm # 2 @ oda sıcaklığında, 3 ve 4) Yıkama Çözüm # 3 @ oda sıcaklığında içeren iki çanak. </li><li> Dikkatle hibridizasyon odalarından slaytlar kaldırmak ve onları iki sırayı Coplin kavanoza bir seferde. 30 saniye boyunca bırakın, sonra yavaş yavaş slayt asansör ve kaldırıcı kayma kavanoz kalacaktır. Slaytlar slayt raf ve hemen Yıkama Çözeltisi # 1 (1X SSC,% 0.2 SDS, ön ısıtma 43 ° C) içine batırmayın. Tüm LifterSlips kaldırılır ve yıkanabilir tüm slaytlar Yıkama Çözeltisi # 1 tabak kadar tekrarlayın. Gayretle 10 kat kadar rafa batırın ve aşağı. </li><li> Yeri çanak 53 ° C de 10 dakika 50-100 rpm çalkalama hava çalkalayıcı. </li><li> Transferi, 10 dakika boyunca oda sıcaklığında Çözüm # 2 (0.1x SSC,% 0.2 SDS), 10 kez dalma ve inkübe Wash raf sallayarak yavaş. </li><li> Dip raf ilk Yıkama Çözüm # 3 (0.1x SSC) içine 15 kez kaldırmak için herhangi bir kalıntı SDS Yıkama Çözüm # 2 üzerinde taşır. Ikinci Yıkama Çözüm Yeri raf # 3 çanak, dalma 10 kez ve daha sonra 10 dakika boyunca sallayarak yavaş. </li><li> Santrifüj 50ml Falcon kapaklı tüpler ve spin @ 1,500 rpm Yeri slaytlar sallanan bir kova rotor ile donatılmıştır. Yalıtımlı konteyner ışık slaytlar çıkarın (ozon seviyeleri yüksek olduğunda bu yaz özellikle Cy boyalar, Cy-5 oksidasyonu azaltır sıkıca alüminyum folyo kaplı başka Falcon tüp ve azot gazı tüpünden tasfiye hava, şapka kullanın .) Slaytlar, bir kaç saat önce azot tasfiye tüpler tarama süreyle saklanabilir; Ancak, hemen yıkandıktan sonra tarama bittiğinde iyi sinyal sonuçlar elde edilmektedir. </li></ol> Bölüm 9: Veri Toplama ve İstatistiksel Analiz <ol><li> Tarama görüntü verilerini Perkin Elmer ScanArray toplanır. Biz 10 mikron tarama ayarı ve dengesi Cy3 ve üreticinin talimatlarına göre satır ayarlama yöntemi kullanılarak Cy5 sinyalleri kullanırlar. </li><li> TIF dosyalarını ızgara ve ham sinyal veri ImaGene Sürüm 7.5 (BioDiscovery A.Ş., El Segundo, CA) ile toplanır ve süzülür. </li><li> Veri normalleşme ve istatistiksel olarak geçerli farklı ifade türlerin belirlemek için değerlendirme BRB Dizi araçları Ver ile yapılır. 3.7. </li><li> Gen İfadesi Örüntü Analizi Yazılımı (GEPAS) Ver koordineli olarak ifade edilen genlerin belirlenmesi kolaylaştırmak için desen analizi yapılır. 3.1. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1182/Figure1_WWLorenz-1.png" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 PtGen2 dizi bu protoco l. kullanarak işleme örneği <img src="/files/ftp_upload/1182/Figure2_WWLorenz.png" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 standart hibridizasyon ve yıkama protokolleri kullanarak işlenmiş PtGen2 dizi örneği.

<ol>
	<li>Lorenz, W. W., Sun, F., Liang, C., Kolychev, D., Wang, H., Zhao, X., Cordonnier-Pratt, M. M., Pratt, L. H., Dean, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+stress-responsive+genes+in+loblolly+pine+(Pinus+taeda)+roots+identified+by+analyses+of+expressed+sequence+tag+libraries.">Water stress-responsive genes in loblolly pine (Pinus taeda) roots identified by analyses of expressed sequence tag libraries.</a> Tree Physiol. 26, 1-16 (2006).</li><li>Lorenz, W. W., Dean, J. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> unpublished data. , .</li><li>Hegde, P., Qi, R., Abernathy, K., Gay, C., Dharap, S., Gaspard, R., Hughes, J. E., Snesrud, E., Lee, N., Quackenbush, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+concise+guide+to+cDNA+microarray+analysis.">A concise guide to cDNA microarray analysis.</a> Biotechniques. 29, 548-562 (2000).</li><li>Alba, R., Fei, Z., Payton, P., Liu, Y., Moore, S. L., Debbie, P., Cohn, J., D'Ascenzo, M., Gordon, J. S., Rose, J. K. C., Martin, G., Tanksley, S. D., Bouzayen, M., Molly, M., Jahn, M. M., Giovannoni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESTs,+cDNA+microarrays,+and+gene+expression+profiling:+tools+for+dissecting+plant+physiology+and+development.">ESTs, cDNA microarrays, and gene expression profiling: tools for dissecting plant physiology and development.</a> The Plant Journal. 39, 697-714 (2004).</li><li>Lorenz, W. W., Simões, M., Miguel, C., Dean, J. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Gene+Expression+changes+in+Pinus+species+using+a+Loblolly+pine+cDNA+microarray.">Analysis of Gene Expression changes in Pinus species using a Loblolly pine cDNA microarray.</a> IUFRO-CTIA 2008 Joint Conference. , (2008).</li><li>Simões, M., Lorenz, W. W., Alba, A., Gonçalves, S., Dean, J., Miguel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+gene+expression+analysis+during+P.+pinaster+embryo+development.">Global gene expression analysis during P. pinaster embryo development.</a> 7th Plant Genomics European Meeting. , (2008).</li></ol>

PtGen2 öncelikle Loblolly çam araştırma topluluğu tarafından kullanılmak üzere tasarlanmış kısa bir süre önce geliştirilen, özel cDNA mikroarray. Üretilen ön sonuçları, bu nedenle çok değerli bir araç transkripsiyonel kuraklık stresine yanıt olarak ortaya çıkan olayların yanı sıra, deniz, çam, Pinus pinaster Şu anda 5,6 embriyo gelişimi sırasında meydana gelen değişiklikleri izleme gibi değerlendirilmesi için dizi göstermiştir yakın zamanda 5 PtGen2...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Pre-hybridization Buffer</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5X SSC, 0.1% SDS, 1% BSA</td>
</tr>
<tr>
<td>Hybridization Buffer</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>30% formamide, 5X SSC, 5X Denhardt&#x2019;s, 1% PolyA RNA (Invitrogen, POLYA.GF), 0.1% SDS</td>
</tr>
<tr>
<td>Wash Solution #1</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1X SSC, 0.2% SDS, preheat to 43&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Wash Solution #2</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>0.1X SSC, 0.2% SDS</td>
</tr>
<tr>
<td>Wash Solution #3</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>0.1X SSC</td>
</tr>
<tr>
<td>Isopropyl Alcohol</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>34959-2.5L</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50mL Conical Tubes</td>
<td>Other</td>
<td>Falcon&#x2122;</td>
<td>352070</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15mL Conical Tubes</td>
<td>Other</td>
<td>Falcon&#x2122;</td>
<td>352196</td>
<td>Use this or a similar cap placed at the bottom of each 50mL conical tube during centrifugation</td>
</tr>
<tr>
<td>Coplin Jar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Wheaton&#x2122;</td>
<td>900520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Staining Dish & Rack </td>
<td>Other</td>
<td>Wheaton&#x2122;</td>
<td>900200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Albumin from bovine serum (BSA)</td>
<td>Other</td>
<td>Sigma&#x2122;</td>
<td>A-9418</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PolyA RNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen&#x2122;</td>
<td>POLYA.GF</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SuperScriptTM Indirect cDNA Labeling </td>
<td>Kit</td>
<td>Invitrogen&#x2122;</td>
<td>L1014-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Turbo DNase</td>
<td>Kit</td>
<td>Ambion</td>
<td>AM1907</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy-5 Dye</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE&#x2122;</td>
<td>PA25001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy-3 Dye</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE&#x2122;</td>
<td>PA23001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LifterSlips&trade;</td>
<td>Other</td>
<td>Erie Scientific Company&#x2122; </td>
<td>25X601</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HybChambers</td>
<td>Equipment</td>
<td>GeneMachines</td>
<td>JHYB200003</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

processing the loblolly pine ptgen2 cdna microarray

PtGen2 amplifiye Loblolly çam EST&#39;ler içeren 26.496 özelliği cDNA mikroarray. Dizi, çam ve diğer kozalaklı türlerin gen ekspresyonu eğitim araştırmacılar tarafından kullanılmak üzere laboratuvarda üretilir. PtGen2 Loblolly çam gen bulma çabalarının bir sonucu olarak geliştirilen ve öncelikle kök dokuları tespit dizileri oluşur, ama aynı zamanda iğne ve kök 1,2 PtGen2 farklı etiketli Cy-boya kozalaklı hedef cDNAs literatürde tarafından test edilmiştir amplifiye ve amplifikatör içermeyen dolaylı etiketleme yöntemleri ve hibridizasyon ve yıkama koşulları bir dizi test. Bu video bazı değişiklikler önceden geliştirilmiş yöntemler kullanılarak, hem de melezleme sonra, ön hibridizasyon öncesi ve sonrası slayt taşıma ve işleme üzerine odaklanmaktadır. 3,4 Ayrıca dahil olanlar, sadece metin biçiminde, üretim için kullanılan protokoller, etiketleme ve hedef cDNA s kadar temiz yanı sıra yazılım hakkında bilgi downstream veri işleme için kullanılır. PtGen2 tamamen kaldırmak için zor olabilir yüksek konsantrasyonlarda tuz içeren özel bir baskı tamponu ile yazdırılır. Slaytlar ön hibridizasyon için önce sıcak bir SDS çözümü ilk olarak yıkanır. Ön hibridizasyon sonra, slaytlar kalan tuzları kaldırma işleminin tamamlanması için çeşitli değişikliklere su kuvvetlice yıkanır. LifterSlips ™ sonra temizlenmiş ve slaytlar üzerinde konumlandırılmış ve cDNA etiketli dikkatle slaytta örnek eşit dağılımını sağlayan kılcal eylem yoluyla mikroarray üzerine yüklenen ve kabarcık esas şansını azaltır. Dizi hedefleri Hibridizasyon 48 ° C&#39;de yüksek nem koşullarında yapılır. Hibridizasyon sonra, bir dizi standart yıkar 53 yapılır ° C ve oda sıcaklığında uzun zamanlar için. İşleme PtGen2 slaytlar bu tekniği kullanarak tuz azaltır ve SDS-elde edilen eserler genellikle dizi daha titiz bir şekilde işlenir. Birkaç farklı kozalaklı RNA kaynaklardan elde edilen hedeflere literatürde, bu işlem protokolü, daha az eser, azaltılmış arka plan verdi ve dizilerin farklı deneysel gruplar arasında daha tutarlı.

Watch this Scientific Journal Video about Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray at JoVE.com

Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

CDNA mikroarray PtGen2 Loblolly çam gen ekspresyon çalışmaları için geliştirilmiştir<em&gt; S. taeda</em&gt; Ve diğer kozalaklı türler. Burada, öncesi ve sonrası hibridizasyon teknikleri, daha iyi bir tutarlılık, eserler, ve alt arka planlar verim için bu dizi ile birlikte kullanılabilir taşıma ve yıkama.

İşleme Loblolly Çam PtGen2 cDNA Mikroarray

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs.  The array is produced in our laboratory for use by researchers ...

processing-the-loblolly-pine-ptgen2-cdna-microarray

Research

JoVE Journal

Biology

7.3K Görüntüleme.  University of Georgia (UGA). CDNA mikroarray PtGen2 Loblolly çam gen ekspresyon çalışmaları için geliştirilmiştir S. taeda Ve diğer kozalaklı türler. Burada, öncesi ve sonrası hibridizasyon teknikleri, daha iyi bir tutarlılık, eserler, ve alt arka planlar verim için bu dizi ile birlikte kullanılabilir taşıma ve yıkama.

Video: Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

Gibberella zeae Ascospore Production and Collection for Microarray Experiments.

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) is a plant pathogen causing scab disease on wheat and barley that reduces crop yield and grain quality. F. graminearum also causes stalk and ear rots of maize and is a producer of mycotoxins such as the trichothecenes that contaminate grain and are harmful to humans and livestock (Goswami and Kistler, 2004).

The fungus produces two types of spores. Ascospores, the propagules resulting from sexual reproduction, are the main source of primary infection.  These spores are forcibly discharged from mature perithecia and dispersed by wind (Francl et al 1999). Secondary infections are mainly caused by macroconidia which are produced by asexual means on the plant surface. To study the developmental processes of ascospores in this fungus, a procedure for their collection in large quantity under sterile conditions was required. Our protocol was filmed in order to generate the highest level of information for understanding and reproducibility; crucial aspects when full genome gene expression profiles are generated and interpreted. In particular, the variability of ascospore germination and biological activity are dependent on the prior manipulation of the material. The use of video for documenting every step in ascospore production is proposed in order to increase standardization, complying with the increasingly stringent requirements for microarray analysis. The procedure requires only standard laboratory equipment. Steps are shown to prevent contamination and favor time synchronization of ascospores.

To study the developmental processes of ascospores in Gibberella zeae, a procedure for collection under sterile conditions is filmed in order to generate the highest level of information for protocol description. This should facilitate the reproducibility of the experiment, a crucial aspect when full genome expression profile tests are implemented.

Gibberella zeae Ascospore Üretim ve Tahsilat Mikroarray deneyler için.

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) is a plant pathogen causing scab disease on wheat and barley that reduces crop yield and grain ...

Biyoloji

The Microfluidic Probe: Operation and Use for Localized Surface Processing

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. Microfluidics is commonly associated with closed microchannels which limit their use to samples that can be introduced, and cultured in the case of cells, within a confined volume. On the other hand, micropipetting system have been used to locally perfuse cells and surfaces, notably using push-pull setups where one pipette acts as source and the other one as sink, but the confinement of the flow is difficult in three dimensions. Furthermore, pipettes are fragile and difficult to position and hence are used in static configuration only. 
The microfluidic probe (MFP) circumvents the constraints imposed by the construction of closed microfluidic channels and instead of enclosing the sample into the microfluidic system, the microfluidic flow can be directly delivered onto the sample, and scanned across the sample, using the MFP. . The injection and aspiration openings are located within a few tens of micrometers of one another so that a microjet injected into the gap is confined by the hydrodynamic forces of the surrounding liquid and entirely aspirated back into the other opening. The microjet can be flushed across the substrate surface and provides a precise tool for localized deposition/delivery of reagents which can be used over large areas by scanning the probe across the surface. 
In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer.

In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer solution.

Mikroakışkan Probe: Çalışma ve Yerelleştirilmiş Yüzey İşleme için kullanın

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. ...

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

Gen İfadesi Analizi Embriyonik Zebra balığı ve cDNA Sentezi RNA İzolasyon

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

Zebra balığı Oligonükleotid Mikroarray Platformu kullanarak Global Gen İfadesi Analizi

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine (P. taeda L.) and Other Conifer Species

Tissues isolated from conifer species, particularly those belonging to the Pinaceae family, such as loblolly pine (Pinus taeda L.), contain high concentrations of phenolic compounds and polysaccharides that interfere with RNA purification. Isolation of high-quality RNA from these species requires rigorous tissue collection procedures in the field and the employment of an RNA isolation protocol comprised of multiple organic extraction steps in order to isolate RNA of sufficient quality for microarray and other genomic analyses. The isolation of high-quality RNA from field-collected loblolly pine samples can be challenging, but several modifications to standard tissue and RNA isolation procedures greatly improve results. The extent of general RNA degradation increases if samples are not properly collected and transported from the field, especially during large-scale harvests. Total RNA yields can be increased significantly by pulverizing samples in a liquid nitrogen freezer mill prior to RNA isolation, especially when samples come from woody tissues. This is primarily due to the presence of oxidizing agents, such as phenolic compounds, and polysaccharides that are both present at high levels in extracts from the woody tissues of most conifer species. If not removed, these contaminants can carry over leading to problems, such as RNA degradation, that result in low yields and a poor quality RNA sample. Carryover of phenolic compounds, as well as polysaccharides, can also reduce or even completely eliminate the activity of reverse transcriptase or other polymerases commonly used for cDNA synthesis. In particular, RNA destined to be used as template for double-stranded cDNA synthesis in the generation of cDNA libraries, single-stranded cDNA synthesis for PCR or qPCR's, or for the synthesis of microarray target materials must be of the highest quality if researchers expect to obtain optimal results. RNA isolation techniques commonly employed for many other plant species are often insufficient in their ability to remove these contaminants from conifer samples and thus do not yield total RNA samples suitable for downstream manipulations. In this video we demonstrate methods for field collection of conifer tissues, beginning with the felling of a forty year-old tree, to the harvesting of phloem, secondary xylem, and reaction wood xylem. We also demonstrate an RNA isolation protocol that has consistently yielded high-quality RNA for subsequent enzymatic manipulations.

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine P. taeda L. and Other Conifer Species

Many plant tissues, including phloem and xylem from loblolly pine (Pinus taeda L.), contain high levels of phenolics and polysaccharides that interfere with RNA purification. This presentation discusses techniques for the harvest of field-grown tissues and isolation of RNA of sufficient quality for microarrays and other genomic analyses.

RNA İzolasyonu Loblolly Çam Daha İyi Bir Yöntem ( S. taeda L.) ve Diğer Conifer Türler

Tissues isolated from conifer species, particularly those belonging to the Pinaceae family, such as loblolly pine (Pinus taeda L.), contain high ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Mikroarray Analizi için Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Performing Custom MicroRNA Microarray Experiments

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1. Complex genomes encode at least hundreds of miRNAs, which primarily inhibit the expression of a vast number of target genes post-transcriptionally 2, 3. miRNAs control a broad range of biological processes 1. In addition, altered miRNA expression has been associated with human diseases such as cancers, and miRNAs may serve as biomarkers for diseases and prognosis 4, 5. It is important, therefore, to understand the expression and functions of miRNAs under many different conditions.
Three major approaches have been employed to profile miRNA expression: real-time PCR, microarray, and deep sequencing. The technique of miRNA microarray has the advantage of being high-throughput, generally less expensive, and most of the experimental and analysis steps can be carried out in a molecular biology laboratory at most universities, medical schools and associated hospitals. Here, we describe a method for performing custom miRNA microarray experiments. A miRNA probe set will be printed on glass slides to produce miRNA microarrays. RNA is isolated using a method or reagent that preserves small RNA species, and then labeled with a fluorescence dye. As a control, reference DNA oligonucleotides corresponding to a subset of miRNAs are also labeled with a different fluorescence dye. The reference DNA will serve to demonstrate the quality of the slide and hybridization and will also be used for data normalization. The RNA and DNA are mixed and hybridized to a microarray slide containing probes for most of the miRNAs in the database. After washing, the slide is scanned to obtain images, and intensities of the individual spots quantified. These raw signals will be further processed and analyzed as the expression data of the corresponding miRNAs. Microarray slides can be stripped and regenerated to reduce the cost of microarrays and to enhance the consistency of microarray experiments. The same principles and procedures are applicable to other types of custom microarray experiments.

A simple procedure of performing custom microRNA microarray experiments is described. The steps include isolating RNA, labeling RNA and reference DNA, hybridizing the samples to microarrays, scanning the microarrays, quantifying and analyzing hybridization signals.

Özel MicroRNA Mikroarray deneyler gerçekleştirme

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1.  Complex genomes encode ...

A Sectioning, Coring, and Image Processing Guide for High-Throughput Cortical Bone Sample Procurement and Analysis for Synchrotron Micro-CT

Bone is a dynamic and mechanically active tissue that changes in structure over the human lifespan. The products of the bone remodeling process have been studied substantially using traditional two-dimensional techniques. Recent advancements in X-ray imaging technology via desktop micro-computed tomography (&#181;CT) and synchrotron radiation micro-computed tomography (SR&#181;CT) have allowed for the acquisition of high-resolution three-dimensional (3D) scans of a larger field of view (FOV) than other 3D imaging techniques (e.g., SEM) providing a more complete picture of microscopic structures within human cortical bone. The specimen should be accurately centered within the FOV, however, to limit the appearance of streak artifacts known to impact data analysis. Previous studies have reported procurement of irregularly shaped rectilinear bone blocks that result in imaging artifacts due to uneven edges or image truncation. We have applied a geological sampling protocol (coring) to procure consistently sized cortical bone core specimens for SR&#181;CT experiments from the anterior aspect of human femora. This coring method is efficient and minimally destructive to tissue. It creates uniform cylindrical samples that decrease imaging artifacts by nature of being isometric during rotation and providing a uniform path length for X-ray beams throughout scanning. Image processing of X-ray tomographic data of cored and irregularly shaped samples confirms the potential of the technique to improve visualization and analysis of cortical bone microarchitecture. A goal of this protocol is to deliver a reliable and repeatable method for the extraction of cortical bone cores that is adaptable for various types of high-resolution bone imaging experiments. An overarching goal of the work is to create a standardized cortical bone procurement for SR&#181;CT that is affordable, consistent, and straightforward. This procedure may further be adapted by researchers in related fields who commonly evaluate hard composite materials such as in biological anthropology, geosciences, or material sciences.

We employed a geological (coring) sampling protocol to procure cortical bone specimens of uniform size for SR&#181;CT experiments from the anterior aspect of human femora. This method is minimally destructive, efficient, results in cylindrical specimens that minimize imaging artifacts from irregular sample shapes and improves microarchitectural visualization and analysis.

Synchrotron Micro-CT için Yüksek Verimli Kortikal Kemik Örneği Alımı ve Analizi için Kesitleme, Coring ve Görüntü İşleme Kılavuzu

Bone is a dynamic and mechanically active tissue that changes in structure over the human lifespan. The products of the bone remodeling process have been ...

Mikroarray Polimer Profilleme Kullanılarak Glikan Yapısının ve Oluşumunun Açıklanması

Microarray Polymer Profiling (MAPP) for High-Throughput Glycan Analysis

Microarray polymer profiling (MAPP) is a robust and reproducible approach to systematically determine the composition and relative abundance of glycans and glycoconjugates within a variety of biological samples, including plant and algal tissues, food materials, and human, animal, and microbial samples. Microarray technology underpins the efficacy of this method by providing a miniaturized, high-throughput screening platform, allowing thousands of interactions between glycans and highly specific glycan-directed molecular probes to be characterized concomitantly, using only small amounts of analytes. Constituent glycans are chemically and enzymatically fractionated, before being sequentially extracted from the sample and directly immobilized onto nitrocellulose membranes. The glycan composition is determined by the attachment of specific glycan-recognizing molecular probes to the extorted and printed molecules. MAPP is complementary to conventional glycan analysis techniques, such as monosaccharide and linkage analysis and mass spectrometry. However, glycan-recognizing molecular probes provide insight into the structural configurations of glycans, which can aid in elucidating biological interactions and functional roles.

Yazar Spotlight: MAPP Protokolü – Glikan Analizini Geliştirme 

Microarray polymer profiling (MAPP) is a high-throughput technique for compositional analysis of glycans in biological samples.

Yüksek Verimli Glikan Analizi için Mikroarray Polimer Profilleme (MAPP)

Microarray polymer profiling (MAPP) is a robust and reproducible approach to systematically determine the composition and relative abundance of glycans ...