El detalle proporcionado en este protocolo, aborda la generación equivalente de la piel humana, que a menudo es técnicamente desafiante. Los elementos equivalentes nuevos del protocolo de la piel humana, tales como vasculatura y proyección de imagen volumétrica se incluyen. La técnica permite la construcción directa de un modelo de piel que se ajusta más al tejido in vivo para el estudio de enfermedades, el envejecimiento y la medicina personalizada.
La parte más desafiante de este protocolo es una transición entre la sumersión y la interfaz aire-líquido. Es probable que se necesitarán algunos ensayos para optimizar el tiempo y los niveles de medios para obtener resultados consistentes. Para comenzar, agregue 516 microlitros de medios a un tubo tapado en frío, e inmediatamente agregue 375 microlitros de colágeno frío usando la pipeta de desplazamiento positivo de 1000 microlitros.
Retire la punta de la pipeta vacía y cambie a la pipeta de desplazamiento positivo de 250 microlitos preparada para mezclar. Mezcle rápidamente, pero suavemente para evitar la formación excesiva de burbujas. Manteniendo la punta en la solución, mezcle uniformemente desde diferentes posiciones del tubo hasta que la solución sea de color homogéneo, lo que típicamente toma unos cinco ciclos de pipeta o 10 segundos.
Dispersa inmediatamente 125 microlitros de colágeno acelular sobre la membrana del inserto de cultivo de 12 pocillos. Para garantizar una cobertura uniforme, incline la placa y use la punta de la pipeta para pintar la membrana extendiendo suavemente el colágeno alrededor. Mueva inmediatamente la placa de 12 pozos a una incubadora de cultivo celular Celsius de 37 grados para dejar que se gelifique durante al menos 20 minutos.
Después del período de gelificación, saque la placa de 12 pocillos de colágeno acelular de la incubadora. Retire el tubo tapado de 1,7 mililitros del hielo húmedo, luego retire el colágeno común de la refrigeración y colóquelo en hielo húmedo con la tapa abierta. Agregue 516 microlitros de suspensión de celda enfriada al tubo tapado en frío.
Use la pipeta de 1000 microlitros para pipetear inmediatamente 375 microlitros de solución fría de colágeno directamente en la solución dentro del tubo tapado. Expulse todo el colágeno de la pipeta en el tubo y deseche la punta de la pipeta de desplazamiento positivo. Cambie inmediatamente a la pipeta de 250 microlitros y mezcle la solución de colágeno Una vez mezclada, transfiera 250 microlitros de solución de colágeno celular a los soportes de colágeno acelular en el inserto de cultivo de 12 pocillos, luego mueva la placa de 12 pocillos a una incubadora de cultivo celular de 37 grados Celsius.
Después del tiempo de gel de 30 minutos, incline suavemente la placa para evaluar la gelificación y asegúrese de que el colágeno se haya solidificado. Agregue 500 microlitros y 1000 microlitros de medios de mezcla a la cámara superior y la cámara inferior del inserto, respectivamente. Asegúrese de que el gel de colágeno esté sumergido, agregando más medios si es necesario.
Coloque la placa del pozo en la incubadora de cultivo celular para la incubación durante la noche. En el séptimo día de inmersión, utilice una pipeta manual para recoger y descartar medios de la cámara inferior y superior de cada pozo de construcción. Para recoger los medios atascados directamente debajo de la membrana permeable, coloque la punta de la pipeta debajo de la membrana, golpeando el inserto fuera de lugar temporalmente.
Agregue un mililitro de equivalente de piel humana o medios HSE complementados con 5% FPS a la cámara inferior de cada pozo y 200 microlitros de suspensión celular a la cámara superior de cada pozo. Sembra los queratinocitos directamente sobre la superficie de construcción dérmica y permitir que se asienten durante dos horas en la incubadora. Dos horas después de sembrar los queratinocitos, agregue cuidadosamente 300 microlitros de medios HSE, complementados con 5% FPS a la cámara superior de cada pozo de construcción.
Después de cargar el medio, vuelva a colocar la construcción en la incubadora. Usando una pipeta manual, levante cada construcción a su interfaz aire-líquido, o ALI, eliminando los desechos de medios de la cámara superior solamente. Trate de acercarse lo más posible a la capa epidérmica sin tocarla ni dañarla.
Incline las placas ligeramente en diferentes ángulos para recoger el medio, luego agregue aproximadamente dos mililitros de agua estéril a los pozos circundantes en la placa para mantener una humedad constante. Revise la placa unas horas más tarde para asegurarse de que los queratinocitos todavía están en la LPA. Retire cualquier medio en la cámara superior, haciendo un seguimiento de la cantidad de medios que se eliminan de cada pozo.
Las capas epidérmicas deben verse hidratadas, no secas, pero no debe haber medios agrupados en la parte superior de la construcción. Para preparar la construcción para la tinción inmunofluorescente, gire un inserto al revés y colócalo sobre su pozo en la placa del pozo. Estabilice el inserto con una mano mientras usa pórceps de punta fina o un cuchillo de precisión para cortar aproximadamente la mitad de la circunferencia de la membrana.
Corte lo más cerca posible de la carcasa de plástico. Usando los pórceps de punta fina, agarre el borde de la aleta de la membrana cortada y desprenda suavemente la membrana porosa del inserto, así como la construcción VHSE. Si la construcción se atasca en el lado de la cámara, use las puntas finas o una pequeña cápula para moverla al pozo.
Una vez que el VHSE esté en el pozo, deseche cualquier pieza restante de la membrana del inserto y mantenga la carcasa del inserto de cultivo en cada pozo para mantener los VHSE en una posición sumergida durante la tinción. Dos días antes de la toma de imágenes, prepare polidimetilsiloxano o PDMS. Coloque cualquier recipiente de mezcla limpio en una balanza de pesaje y tara la báscula.
Agregue la base y, a continuación, agregue el reticulador. Revuelva la solución vigorosamente durante al menos cuatro minutos, creando pequeñas burbujas. Después de mezclar lo suficiente, vierta el PDMS en una placa de Petri de 90 o 100 milímetros.
Desgasificar el PDMS en una cámara de vacío hasta que todas las burbujas desaparezcan y el PDMS esté claro. Suelte el vacío lentamente y retire el PDMS. Coloque el plato en un horno para curar durante la noche a 50 a 60 grados Celsius, asegurándose de que el plato esté sentado plano para que PDMS cure uniformemente.
Un día antes de la toma de imágenes, use un punzón de acero o un cuchillo de precisión de mano para perforar o cortar un pozo circular de la hoja PDMS, aproximadamente del mismo tamaño que la construcción VHSE. Corte un parche cuadrado alrededor del pozo circular para crear un solo pozo PDMS. Usando un resbalón de cubierta de vidrio de un tamaño similar al del PDMS, agregue pegamento de cianocrilato a la superficie inferior del PDMS y unte uniformemente con una punta de pipeta desechable.
Centre el vidrio y presione sobre el PDMS bien mientras deja una ventana de vidrio transparente dentro del círculo perforado. Deje secar el pegamento durante la noche antes de usarlo. La caracterización de la epidermis y de la dermis muestra marcadores inmunofluorescentes apropiados para la piel humana en las construcciones de VHSE.
Cytokeratin 10 es un marcador temprano del keratinocyte de la diferenciación que marca generalmente todas las capas suprabasal en equivalentes de la piel. La involucrina y la filaggrina son marcadores de diferenciación tardía en queratinocitos y marcan las capas superiores más suprabasales en los equivalentes de la piel. La limpieza del VHSE permitió la proyección de imagen directa en un ajuste y eliminó la necesidad de reorientar la construcción para imaginar la dermis y la epidermis por separado.
Las imágenes volumétricas permiten generar representaciones 3D para mapear la vasculatura a lo largo de cada construcción. Las pilas de imágenes se cargaron en software computacional y se utilizó un algoritmo personalizado para la representación y cuantificación 3D. El Skeletonization determinó el centro definitivo de cada recipiente IV-marcado colágeno y los datos resultantes fueron utilizados para calcular diámetro del recipiente así como la fracción vascular.
Después de este procedimiento, los métodos de caracterización tales como análisis de la barrera, microscopia electrónica de la exploración, perfiles del lípido, y otros se pueden realizar para entender cómo la vasculatura afecta específicamente a la maduración y a la estabilidad epidérmicas. Este protocolo permite estudios tejido-relevantes y tipo-específicos de la célula en un modelo vascularizado de la piel. Es particularmente adecuado para la investigación en el envejecimiento y la medicina personalizada.
