Este protocolo para un sistema de expresión de proteínas libres de células recombinantes, comúnmente conocido como el sistema PURE, utiliza el cultivo celular y la purificación celular para agilizar las purificaciones de proteínas requeridas. Esto minimiza significativamente los requisitos de tiempo y mano de obra. El método OnePot ha demostrado ser no solo rentable, sino también eficiente en el tiempo.
Reduce los tiempos de preparación de varias semanas a tres días hábiles. Esto hace que la plataforma PURE libre de células sea accesible a más laboratorios en todo el mundo y ayuda a implementar esta plataforma realmente poderosa para la biología sintética libre de células. Antes de comenzar, asegúrese de que todas las cepas expresen bien sus respectivas proteínas.
Para comenzar, prepare la columna para la purificación de proteínas OnePot como se describe en el manuscrito de texto usando dos mililitros de resina de Sepharose, y luego cargue la columna con sulfato de níquel. Prepare los cultivos iniciadores combinando 20 mililitros de medios LB con 20 microlitros de ampicilina. Agregue 300 microlitros del medio en 35 pozos de una placa estéril de 96 pozos profundos.
Inocular cada uno de ellos con su respectiva cepa, excepto el factor de elongación termoestable, o EFTU, y sellar la placa con una membrana transpirable. Para el cultivo EFTU, inocule tres mililitros de ampicilina que contengan medios LB en un tubo de cultivo de 14 mililitros con una tapa a presión. Alrededor de tres mililitros de cultivo EFTU son suficientes para una cultura de expresión OnePot.
Incubarlo a 37 grados centígrados mientras tiembla a 260 rotaciones por minuto durante la noche. Al día siguiente, transfiera 500 mililitros de medios LB y 500 microlitros de ampicilina al matraz desconcertado estéril. Inocular el cultivo OnePot PURE con 1,675 microlitros del cultivo EFTU y 55 microlitros de cada uno de los cultivos de la placa del pozo profundo.
Incubar el cultivo durante dos horas a 37 grados centígrados con una sacudida de 260 rotaciones por minuto, o hasta que la densidad óptica del cultivo alcance 0,2 a 0,3. Inducir el cultivo con 500 microlitros de 0,1 milimolares IPTG y crecer durante tres horas adicionales. Cosechar las células por centrifugación a cuatro grados Celsius y 3, 220 veces G durante 10 minutos, y almacenar el pellet celular a menos 80 grados Celsius hasta su uso posterior.
En el tercer día, mida las cantidades de tampones necesarios para su purificación y agregue TCEP a todos ellos como se indica en el texto. Almacene los tampones restantes sin TCEP a cuatro grados Celsius para futuras purificaciones. Equilibre la columna cargada con 30 mililitros de tampón A.Después de que hayan pasado 25 mililitros de búfer A, cierre la columna desde la parte inferior.
Descongele las células y use una pipeta serológica para resuspend el pellet celular en 7,5 mililitros de tampón A.Lyse las células utilizando una sonda de 130 vatios. Si la sonicación es exitosa, la solución se volverá más oscura. Asegúrese de mantener las células en hielo y coloque la sonda lo suficientemente profunda sin tocar el tubo.
Retire los restos celulares por centrifugación a 21, 130 veces G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados y mantenga el lisato en hielo. Agregue el sobrenadante a la columna equilibrada. Cierre la columna desde la parte superior y asegúrese de que no haya fugas.
Incubar la columna durante tres horas a cuatro grados centígrados bajo rotación utilizando un rotador de tubo. Elute los componentes no unidos de la columna y lávelos con 25 mililitros de tampón A.Lave la columna con 25 mililitros de tampón de imidazol de 25 milimolares. Elute las proteínas con cinco mililitros de tampón de imidazol de 450 milimolares y mantenga las proteínas eluidas en hielo en todo momento.
Diluya el eluido con 25 mililitros de tampón HT y mantenga la mezcla en hielo. Agregue 15 mililitros a un filtro centrífugo de 15 mililitros y concéntrese a un volumen de 1,5 mililitros. Agregue los 15 mililitros restantes al filtro con la solución concentrada y concéntrese a 1,5 mililitros una vez más.
Agregue 10 mililitros de tampón HT a la muestra concentrada y concéntrese a un mililitro. Recupere la muestra concentrada y agregue una cantidad igual de tampón B de stock y guárdelo a menos 80 grados centígrados hasta su uso posterior. Durante el intercambio de búfer, restaure la columna como se especifica en el texto.
En el cuarto día, mida la concentración de proteína utilizando el ensayo de Bradford. Concentre la muestra con 0,5 mililitros de filtro centrífugo de corte de tres kilodalton a 20 miligramos por mililitro. Verifique la composición de la proteína OnePot PURE usando la página SDS.
Diluya 2,5 microlitros de la muestra con 7,5 microlitros de agua mezclados con 10 microlitros de dos tampón X Laemmli, y luego cargue cinco microlitros y 2,5 microlitros de las muestras en el gel. Ejecute la página SDS como se especifica en el texto. Complete la concentración y la longitud del ADN en las células amarillas correspondientes en la hoja de cálculo utilizando de dos a 10 nanomolares de ADN para la reacción.
Rellene el volumen de reacción total deseado en microlitros. Retire los reactivos necesarios del congelador y descongelarlos en hielo. Luego, pipetee las cantidades calculadas de agua, ADN y solución de energía a un lado del tubo de PCR o a una esquina de un pozo en la placa de 384 pozos.
Pipetear las cantidades calculadas de proteína y solución de ribosoma al otro lado de un tubo de PCR o a la esquina opuesta de la placa de 384 pozos. Gire durante unos 30 segundos para fusionar los componentes de reacción. Para evitar la evaporación durante los experimentos con lectores de placas, agregue 35 microlitros de cera líquida y selle la placa con un sellador transparente.
Incubar durante un mínimo de tres horas a 37 grados centígrados. Para la lectura en un lector de placas, mida la intensidad de la florescencia en la longitud de onda requerida cada dos minutos. La sobreexpresión exitosa en todas las cepas individuales utilizadas posteriormente para la preparación de la proteína OnePot se muestra aquí.
La composición general de la solución final de proteína OnePot PURE fue analizada por la página SDS. Es notable que EFTU está presente en una concentración más alta en comparación con las otras proteínas, como se esperaba. Los rendimientos de síntesis de la solución de proteína OnePot combinada con los ribosomas marcados o no marcados con His se analizaron mediante el monitoreo de la fluorescencia de eGFP a lo largo del tiempo.
Los niveles de expresión de tres proteínas diferentes etiquetadas utilizando el sistema de etiquetado in vitro de ARNt de lista verde, o tinción de Kumasi, se analizaron en un gel de página SDS. Para un sistema PURE funcional, es absolutamente crítico que todas las cepas expresen bien sus respectivas proteínas. Esta técnica facilita la implementación del sistema PURE a la ingeniería de sistemas biológicos, permitiendo el desarrollo de nuevas redes genéticas, diagnósticos moleculares, terapéuticos y kits educativos.
