Para medir la intensidad de fluorescencia de las células HeLa transfectadas en el software ImageJ, haga clic en archivo y seleccione abrir. En el cuadro de diálogo, seleccione los archivos de imágenes para el experimento y haga clic en Aceptar. Una vez que aparezca la ventana de opciones de importación de bioformatos, seleccione dividir canales y haga clic en Aceptar.
En experimentos de tetrametilrodamina, éster etílico, perclorato o TMRE, YFP es el primer canal, MitoTracker es el segundo canal y TMRE es el tercer canal. Ajuste el brillo seleccionando la imagen, luego ajuste y luego el brillo. A continuación, cargue la región de interés o ROI guardada haciendo clic en analizar, luego en herramientas y luego en el administrador de ROI.
En el administrador de ROI, haga clic en más, luego abra en la lista y seleccione el ROI guardado. Luego mida la intensidad fluorescente de cinco regiones aleatorias en una sola celda seleccionando el ROI guardado del administrador de ROI y moviendo el ROI a una ubicación aleatoria dentro de una celda. Para medir la intensidad de la fluorescencia, presione M en el teclado y repita esto con cuatro regiones adicionales no superpuestas.
Cuando aparezca un cuadro de diálogo con el área y los valores grises medios, copie y pegue los valores en una hoja de cálculo para su análisis. Los resultados para las intensidades de fluorescencia TMRE y MitoSOX mostraron que su tratamiento con el agente de desacoplamiento conocido CCCP disminuyó la intensidad de fluorescencia TMRE en comparación con las condiciones de control. Además, el tratamiento con CCCP de 20 micromoles indujo la producción de superóxido y aumentó la intensidad de fluorescencia de MitoSOX.
En condiciones de estrés CCCP leve o de cinco micromolares, la expresión de Parkin de tipo salvaje y Parkin T240R resultó en una mayor intensidad de TMRE en comparación con el vector de control YFP vacío. La intensidad de MitoSOX fue menor en las células que expresan Parkin tipo salvaje y Parkin T240R en comparación con las células que expresan el vector de control YFP, lo que sugiere que la expresión de Parking ayuda a mantener la salud de la red mitocondrial al preservar potenciales de membrana mitocondrial más altos y bajos niveles de superóxido.
