Para comenzar, rocíe bien el ratón macho C57 negro 6J de 10 semanas de edad sacrificado con etanol al 70%. Con unas pinzas, retire la piel de la extremidad posterior y diseccione todos los músculos de la extremidad que rodean el fémur, la tibia y el peroné. Coloque los músculos de las extremidades extraídos en un tubo de dos mililitros que contenga un mililitro de tampón de aislamiento muscular.
Y con unas tijeras, pica los músculos cosechados. Transfiera la suspensión muscular picada a un tubo de 50 mililitros que contenga 18 mililitros de tampón de aislamiento muscular. Cierre el tubo herméticamente, séllelo con una película de laboratorio y colóquelo horizontalmente en un baño de agua agitado.
Después de 30 minutos, agregue cinco miligramos de colagenasa tipo I y mantenga el tubo durante otros 30 minutos. Después de pipetear la suspensión muscular hacia arriba y hacia abajo 10 veces, centrifugar y desechar el sobrenadante, dejando cinco mililitros del medio en el tubo. Pipetear la suspensión en los filtros celulares sucesivos y recoger el flujo en el tubo de 50 mililitros.
Centrifugar la suspensión y desechar el sobrenadante hasta que solo queden de 100 a 200 microlitros en el tubo. Vuelva a suspender el gránulo en dos mililitros de tampón de lisis de glóbulos rojos e incube en hielo durante tres minutos. Vuelva a centrifugar y retire el sobrenadante del tubo con una pipeta de 20 a 200 microlitros.
Vuelva a suspender el gránulo en 100 microlitros de tampón FACS frío y coloque el tubo en hielo. Después de retirar 10 microlitros de suspensión celular para el control negativo, centrifugar los 90 microlitros restantes y desechar el sobrenadante antes de incubar las células con 400 microlitros de tinción de viabilidad fijable diluida en DMEM sin suero durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, agregue 100 microlitros de tampón FACS e invierta suavemente el tubo tres veces.
Centrifugar nuevamente y agregar 100 microlitros de mezcla de anticuerpos primarios en el tubo. Después de 30 minutos de incubación en la oscuridad, centrifugar y desechar el sobrenadante. Luego agregue 500 microlitros de PBS para lavar las células.
Centrifugar de nuevo y retirar el sobrenadante antes de volver a suspender el gránulo en 500 microlitros de tampón FACS. Transfiere la suspensión a un tubo de cinco mililitros. Realice un vórtice breve de la suspensión celular antes de procesarla en un citómetro de flujo.
Recoja las células seleccionadas en el tubo recubierto de cinco mililitros que contiene el tampón FACS. El 75% de las células mononucleadas identificadas en función de su tamaño y granularidad fueron negativas para el marcador de tinción de viabilidad fijable, lo que dio lugar a una media del 34,3% de células vivas. Alrededor del 3% de las células vivas individuales fueron negativas para marcadores específicos de monocitos, endotelios, leucocitos y eritroides.
A continuación, se seleccionaron estas células negativas en función de su expresión de los marcadores CD34 e ITGA7. Se realizó una compuerta final para CXCR4 para seleccionar células satélite putativas. Y de las células positivas para CD34 ITGA7, se encontró que el 80% eran positivas para CXCR4.
