Centrifugar las células satélite aisladas en FACS y desechar el sobrenadante. Lavar las células con un mililitro de PBS, centrifugar e incubarlas en un mililitro de tampón de extracción nuclear en frío sobre hielo durante 20 minutos. Agregue 20 microlitros de perlas magnéticas recubiertas de Concanavalina A en un tubo de 1,5 mililitros que contenga 850 microlitros de tampón de unión en frío.
Luego, usando una rejilla magnética, lave las cuentas dos veces con un mililitro de tampón de encuadernación en frío y deje que las perlas se acumulen en el costado del tubo en la rejilla durante cinco minutos antes de volver a suspenderlas suavemente en 300 microlitros de tampón de atado en frío. A continuación, centrifugar los núcleos y resuspenderlos suavemente en 600 microlitros de tampón de extracción nuclear. A continuación, mezcle 600 microlitros de núcleos extraídos con 300 microlitros de lodo de perlas de Concanavalina A e incube a cuatro grados centígrados durante 10 minutos.
Después de eliminar el sobrenadante con una rejilla magnética, vuelva a suspender los núcleos unidos a las perlas con un mililitro de tampón de bloqueo frío. Nuevamente, retire el sobrenadante y lave los núcleos unidos a la perla dos veces con un mililitro de tampón de lavado en frío. Separe el sobrenadante, vuelva a suspender suavemente los complejos de perlas del núcleo con un anticuerpo primario específico e incube a cuatro grados centígrados durante la noche con una agitación suave.
Al día siguiente, retire el sobrenadante y lave los núcleos unidos a las perlas antes de volver a suspenderlo en 100 microlitros de tampón de lavado en frío. Añadir 100 microlitros de proteína A-micrococo nucleasa diluida a los 100 microlitros de núcleos unidos a perlas e incubar a cuatro grados centígrados durante una hora con agitación. Después de la incubación, retire el sobrenadante y lave los núcleos unidos a las perlas dos veces antes de volver a suspenderlos en 150 microlitros de tampón de lavado en frío.
A continuación, agregue tres microlitros de cloruro de calcio de 100 milimolares, mezcle rápidamente agitando e incube en hielo durante 30 minutos. Detenga la reacción agregando 150 microlitros de tampón de parada e incube a 37 grados centígrados durante 20 minutos. Centrifugar las muestras y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga, desechando el gránulo y las perlas.
A continuación, añadir tres microlitros de dodecil sulfato de sodio al 10% y 2,5 microlitros de 20 miligramos por mililitro de proteinasa K.Mezclar por inversión e incubar durante 10 minutos a 70 grados centígrados. Luego agregue 300 microlitros de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico y vórtice antes de transferir a dos tubos de bloqueo de fase de mililitros. Centrifugar y añadir 300 microlitros de cloroformo al mismo tubo.
Vuelva a centrifugar y recoja el sobrenadante en un tubo de 1,5 mililitros. A continuación, agregue un microlitro de glucógeno, luego 750 microlitros de etanol al 100% y deje que el ADN precipite durante la noche a menos 20 grados centígrados. Al día siguiente, granule el ADN por centrifugación, luego lave el gránulo con un mililitro de etanol al 100% y centrifugue dos veces antes de eliminar el etanol residual con una pipeta.
Secar al aire el pellet durante cinco minutos y volver a suspenderlo en 25 microlitros de tampón tris-EDTA. El H3KME2 y el H3K27AC se enriquecieron en torno al SST de PAC7, ITGA7, LAM2, CXCR4 y VCAM1. Sin embargo, H3K4ME2 y H3K27AC no se enriquecieron en los de ITGAM, PTPRC, PECAM, CKM o MHY3.
Casi no se obtuvo ninguna señal con la muestra de IgG. Se muestran los picos de RA y las celdas satélite de HOMER, el análisis de motivos conocidos y el porcentaje de regiones objetivo. El análisis de Seeker reveló casi 500 picos con una puntuación máxima superior a 50, con más de 200 de ellos con una puntuación superior a 100.
