IPSC Differentiation into Posterior Primitive Streak and Nephrogenic Intermediate Mesoderm

Comience lavando las células madre pluripotentes inducidas o iPSC en la placa de 6 pocillos recubierta de matriz de membrana con dos mililitros de DPBS. Aspire el DPBS con una pipeta. A continuación, agregue un mililitro de la solución de desprendimiento de celdas disponible en el mercado para separar las iPSC.

A continuación, coloque la célula en una incubadora a 37 grados durante cinco minutos. Ahora pipetee un mililitro de mTeSR en las iPSC, asegurándose de que las células se hayan separado de la superficie de plástico. Centrifugar estas células a 400 g durante tres minutos a temperatura ambiente.

Vuelva a suspender el gránulo de células, luego cuente el número de células con un hemocitómetro. A continuación, siembre un rango de densidades celulares en una placa de 6 pocillos que ha sido recubierta con una matriz de membrana. Cultivarlos con mTeSR suplementado con 10 inhibidores de la Rho-quinasa micromolar.

Cultive las placas durante la noche en una incubadora de dióxido de carbono a 37 grados centígrados. Al día siguiente, aspire el mTeSR y lave las células con dos mililitros de DPBS. A continuación, agregue dos mililitros de medio de etapa 1 a las células.

Luego coloque las células en una incubadora a 37 grados centígrados durante cuatro días. En el cuarto día, retire el medio de la etapa 1 y lave las células con dos mililitros de DPBS. Luego agregue dos mililitros de medio de etapa 2 a las células antes de incubar las células como antes.

Desde el día cero hasta el día cuatro, las iPSC se expandieron rápidamente y adquirieron formas romboidales o triangulares. La confluencia alcanzó entre el 90 y el 100% y se acumuló uniformemente hasta el séptimo día. Tras el cultivo en suspensión, los agregados forman espontáneamente estructuras de nefronas después de disociarse en el séptimo día.