Comience retirando el medio de la etapa II de la suspensión celular iPSC en el séptimo día de cultivo. Ahora lave las células con dos mililitros de DPBS. Pipetear un mililitro de solución de desprendimiento celular en cada pocillo.
Luego coloque la placa en una incubadora a 37 grados durante cinco minutos. Después de la incubación, agregue un mililitro de medio de etapa II a las células y mezcle bien hasta que las células se hayan desprendido de la superficie. Recoja la suspensión celular en un tubo de 15 mililitros, luego centrifugue a 400 g durante tres minutos a temperatura ambiente.
Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo celular en dos mililitros de medio de etapa III. Mezcle la solución suavemente. Ahora siembre la suspensión en una placa de baja adherencia de seis pocillos en una proporción de uno a tres.
Coloque la placa en un agitador orbital en una incubadora a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. Para eliminar el medio en el cultivo en suspensión, primero corte la punta de una pipeta de un mililitro con unas tijeras asépticas. Luego agite suavemente la placa de seis pocillos para centrar los organoides.
A continuación, aspira los organoides con las pipetas preparadas y colócalos en un tubo de 15 mililitros, dejándolos reposar durante cinco minutos. Aspire el sobrenadante, asegurándose de que los organoides permanezcan en la base del tubo. A continuación, pipetee el medio de la etapa III en la placa.
Pipetear la mezcla para resuspender los organoides. Vuelva a colocar los organoides en una placa de seis pocillos de baja adherencia. Continúe agitando la placa de baja adherencia a 60 rotaciones por minuto en la incubadora.
En el día 12, reemplace el medio con el medio de etapa IV. Los organoides renales muestran estructuras tubulares y se observan fácilmente en imágenes de campo claro después de 18 días de agregación. Se indujeron células endoteliales CD31.
El dextrano se introdujo en los túbulos proximales de los organoides renales.
