Para comenzar a utilizar una pipeta serológica, retire el medio de cultivo del matraz T75 que contiene un 70 % de cultivo de MDA-MB-231 confluente. Añadir tres mililitros de tripsina al matraz e incubar a 37 grados con un 5% de dióxido de carbono durante tres a cinco minutos para separar las células del matraz. Luego, para neutralizar la tripsina, agregue tres mililitros de DMEM en el matraz.
Recoja la suspensión celular en un tubo de centrífuga y centrifuga a 400 G durante cuatro minutos. Deseche el sobrenadante con una pipeta y vuelva a suspender el gránulo en dos mililitros de PBS. Usando un contador de células, determine la concentración de células.
Transfiera ocho veces 10 a la quinta celda en un tubo de 15 mililitros y agregue PBS para aumentar el volumen a un mililitro. A continuación, añada dos microlitros de CFSE en el tubo y mezcle bien la suspensión celular con una pipeta de un mililitro. Coloque el tubo a 37 grados centígrados y la incubadora de dióxido de carbono al 5% durante 20 minutos.
A continuación, agregue cinco mililitros de DMEM al tubo y centrifugue para granular las celdas marcadas con CFSE. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de DMEM. Después de reevaluar la concentración celular, transfiera cuatro veces 10 a la quinta celda a un depósito de reactivo de 25 mililitros.
Añadir DMEM para que el volumen sea de ocho mililitros y mezclar la suspensión celular con una pipeta serológica de cinco mililitros. Con una pipeta multicanal, transfiera 100 microlitros de suspensión celular a cada fila en la mitad izquierda de una placa negra de 96 pocillos. Del mismo modo, agregue la suspensión de celda knockout EGFR en la mitad derecha de la placa.
Para garantizar una distribución uniforme de las células, mueva la placa hacia adelante y hacia atrás y de lado a lado en la plataforma. Incubar la placa durante cuatro horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono para que las células tumorales se adhieran. Sobre la base de los recuentos de células Jurkat no transducidas y que expresan CAR, transfiera cuatro veces 10 a las quintas células CAR-J en un depósito de 25 mililitros.
Agregue DMEM al depósito hasta un volumen final de dos mililitros. Para obtener una proporción efectora/tumoral de 4:1, agregue dos veces 10 a la cuarta célula CAR-J por pocillo en 100 microlitros de medio a lo largo del costado del pocillo sin alterar las células tumorales adheridas. Luego agregue 100 microlitros de DMEM al lado de los pocillos que contienen células tumorales y Jurkat para obtener 300 microlitros de volumen por pocillo.
Mueva la placa como se ha demostrado para asegurar una distribución uniforme de las células Jurkat en las células tumorales. Permitir que el cocultivo se establezca a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante 48 horas.
