1 Para comenzar, obtenga células de tinción de ligando2 que expresen proteína de interés marcada con halo y halo H2B. 3 Después de encender el sistema de microscopio, 4 configure los parámetros de incubación de células vivas 5 y deje que el sistema se equilibre. 6 Ponga una gota de aceite en 7 un objetivo TIRF de 100x en el microscopio 8 y cargue la muestra de células en la platina del microscopio.
9 Para identificar una célula morfológicamente sana, 10 ajuste la posición Z 11 y obtenga una imagen de la muestra de célula bajo iluminación de campo claro. 12 Recorta el campo de visión para capturar el núcleo de la célula objetivo. 13 Usando iluminación láser, ajuste el ángulo TIRF 14 para lograr la iluminación de hilo con una relación señal/ruido óptima de 15 de una sola molécula.
16 A continuación, ajuste el tiempo de exposición a 500 milisegundos. 17 Durante el tiempo muerto entre fotogramas, 18 fotoactiva las moléculas 19 con un haz de 111 microvatios y 405 nanómetros, 20 y durante cada exposición, excita las moléculas de halo de H2B 21 con un haz de 9,1 milivatios y 640 nanómetros. 22 Inicie la captura de imágenes para 2000 fotogramas de forma continua 23 y aumente gradualmente la potencia del haz de 405 nanómetros 24 al reducir las moléculas fotoactivadas.
25 Para una proteína de interés marcada con halo, 26 dividió las longitudes de onda de emisión entre dos cámaras 27 utilizando un espejo dicroico de paso largo. 28 A los mismos parámetros de adquisición demostrados anteriormente, 29 agregue el canal JFX549 para adquirir un fotograma cada 10 segundos 30 y capturar 2000 fotogramas de forma continua.
