Comienza por disociar el tejido. Use dos pares de pinzas para extraer el tejido adiposo del tejido mamario. Asegúrese de que el tejido mamario restante pese aproximadamente un gramo.
Enjuague el tejido mamario en cinco mililitros de solución de etanol al 75% durante cinco segundos. Luego, lave con 20 mililitros de solución de lavado dos veces durante cinco minutos cada una. Luego, use dos cuchillas quirúrgicas para cortar el tejido mamario en fragmentos más pequeños.
De forma continua durante 15 minutos para obtener un tejido homogeneizado, transfiera el tejido triturado a un tubo centrífugo de 50 mililitros. Agregue 10 mililitros de solución de dispasa y colagenasa, tres mililitros de tripsina al 0,25% y siete mililitros de PBS para un total de 20 mililitros de solución de digestión. Coloque el tubo en un baño de agua a 37 grados centígrados e incube durante 1 1/2 horas, agitando el tubo cada 20 minutos.
Para detener el proceso de digestión, agregue 20 mililitros de solución neutralizante. A continuación, pipetee el contenido aproximadamente 15 veces para asegurar una mezcla completa. Filtra la mezcla a través de un filtro de malla de 100 micras.
Después de eso, centrifugar a 156G durante cinco minutos. A continuación, retira el sobrenadante. Repita la incubación del pellet con 20 mililitros de solución neutralizante, luego mezcle mediante pipeteo.
Vuelva a centrifugar durante cinco minutos. Retire con cuidado el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular con 10 mililitros de medio de cultivo inicial. Coloque la suspensión celular en una placa de cultivo celular de 100 milímetros.
Cultive las células en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados. Reemplace el medio de cultivo original con medio de células epiteliales frescas cada tres días. Revise las celdas y actualice el medio cada dos días.
Utilizando este protocolo, se aislaron células epiteliales mamarias humanas de tejido mamario. El análisis posterior al aislamiento mostró que las células tratadas con el inhibidor de ROCK Y-27632 mostraron un crecimiento pronunciado en comparación con el grupo de control. El ensayo CCK-8 reveló que las células en el medio que contenía Y-27632 proliferaron a una tasa significativamente mayor que las del medio de control.
Los ensayos de inmunofluorescencia confirmaron que la mayoría de las células expresaban marcadores de células epiteliales mamarias, CK7 y GATA3, con una presencia insignificante de otros tipos de células en los pasajes posteriores. Además, los estudios de qRT-PCR mostraron niveles de expresión consistentes de CK7 y GATA3 en varios pasajes, lo que indica un fenotipo consistente o capacidad de diferenciación.
