עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מתוכנית המדע והטכנולוגיה TCM של מחוז ג'ג'יאנג, סין (2017ZA055; 2018ZA036), ופרויקט המדע והטכנולוגיה של Zunyi, מחוז Guizhou, סין (Zunyi City Kehe Support NS (2020) No. 18) ל- X. Xu. המחברים מודים למעבדה לביולוגיה מולקולרית של חברת הטכנולוגיה הביו-רפואית Youjia (Hangzhou) על מתן הכשרה בתרביות תאים.

רקמות חלב נורמליות טריות המשמשות בפרוטוקול זה נאספות מניתוח סביב הנגע של דלקת שד לובולרית גרנולומטית עקשנית בבית החולים המסונף הראשון של האוניברסיטה הרפואית הסינית ג'ג'יאנג על פי הנחיות ועדת האתיקה הרפואית של בית החולים המסונף הראשון של האוניברסיטה הרפואית הסינית ג'ג'יאנג (פרוטוקול מס '. ChiMCTR2100005281, תאריך: 2017-07-17).
1. רכישת רקמות
<ol><li>איסוף רקמות חלב טריות מדגימות כירורגיות שנלקחו מנשים בוגרות לתוך צינורות סטריליים המכילים 10 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) עם 3% פניצילין/סטרפטומיצין (P/S). הערה: יש לטפל ברקמות החלב על פי הפרטים הבאים תוך 24 שעות לאחר האיסוף מהניתוח.</li>
</ol>2. טיפול מקדים ברקמה
<ol><li>הסר את רקמת השומן מרקמת החלב עם שני זוגות של מלקחיים, להבטיח כי רקמת החלב הנותרת היא ~ 1 גרם במשקל.</li>
	<li>שטפו את רקמת החלב בתמיסת אתנול 75% (5 מ"ל) במשך 5 שניות ולאחר מכן שטפו עם 20 מ"ל של תמיסת כביסה (טבלה 1) במשך 2 x 5 דקות.</li>
</ol>3. עיכול של רקמות
<ol><li>פורסים את רקמת החלב לשברים קטנים יותר, גורסים את הרקמה באמצעות שני להבים כירורגיים למשך 15 דקות כדי לקבל את הרקמה הומוגנית. מעבירים את חתיכות הרקמה לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל.</li>
	<li>הוסף 10 מ"ל של 5.0 מ"ג / מ"ל dispase + 5.0 מ"ג / מ"ל תמיסת collagenase, 3 מ"ל של 0.25% טריפסין, ו 7 מ"ל של PBS לסך של 20 מ"ל של תמיסת עיכול בצינור צנטריפוגה 50 מ"ל המכיל את שברי רקמת החלב. מניחים את הצינור באמבט מים ב 37 °C (77 °F) ולדגור במשך 1.5 שעות; נערו את הצינור כל 20 דקות.</li>
	<li>עצור את תהליך העיכול על ידי הזרקת 20 מ"ל של תמיסה מנטרלת. מערבבים את התוכן על ידי pipetting ~ 15x.</li>
	<li>סננו את התערובת דרך מסנן רשת שינוי בגודל 100 מיקרומטר. צנטריפוגה ב 156 × גרם במשך 5 דקות.</li>
	<li>מוציאים את הסופרנאטנט וחוזרים על הדגירה של הגלולה עם 20 מ"ל של תמיסה מנטרלת. מערבבים את התכולה על ידי פיפטינג 15x וצנטריפוגה ב 156 × גרם במשך 5 דקות.</li>
	<li>הסר את supernatant בזהירות להשעות מחדש את גלולת התא עם 10 מ"ל של מדיום תרבית ראשונית. לוחים את תרחיף התא בצלחת תרבית תאים בקוטר 100 מ"מ.</li>
	<li>לטפח את התאים באינקובטור 5% CO2 ב 37 ° C. החליפו את מדיום התרבית המקורי בתווך תאי אפיתל טריים כל שלושה ימים. בדוק את התאים ורענן את המדיום כל יומיים.</li>
</ol>4. מעבר תאים
<ol><li>הסר את צלחת 100 מ"מ מן האינקובטור כאשר התאים מגיעים 80%-90% מפגש, להשליך את המדיום משומש, ולשטוף את צלחת 2x עם 2 מ"ל של PBS. הסר PBS ולאחר מכן הוסף 2 מ"ל של 0.05% טריפסין לכל צלחת 100 מ"מ. הערה: מערבלים את התבשיל כדי לוודא שתמיסת הטריפסין באה במגע מספיק עם תחתית המנה.</li>
	<li>מניחים את צלחת 100 מ"מ באינקובטור 37 מעלות צלזיוס למשך ~7 דקות לתהליך העיכול.</li>
	<li>בחנו את התאים במיקרוסקופ באמצעות מטרה של פי 40 כדי לוודא שרוב התאים נותקו מתחתית הצלחת.</li>
	<li>עצור את תהליך העיכול על ידי הוספת 8 מ"ל של תמיסה מנטרלת ולהעביר את התאים לצינור 15 מ"ל. מערבבים את התאים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 10-15x. צנטריפוגה את התאים ב 156 × גרם במשך 5 דקות.</li>
	<li>הסר את supernatant בזהירות, resuspend את התאים עם 10 מ"ל של תווך תא אפיתל, ולספור את מספר התאים.</li>
	<li>הוסף 1 × 106 תאים ב 10 מ"ל של תא אפיתל בינוני בצלחת 100 מ"מ.</li>
	<li>רענן את תווך תא האפיתל והתבונן בתאים כל יומיים.</li>
</ol>5. שימור תאים בהקפאה
<ol><li>חזור על שלבים 4.1-4.4.</li>
	<li>הסר את supernatant בזהירות להשעות מחדש את התאים ב 2 מ"ל של תמיסת שימור הקפאה התא.</li>
	<li>העבירו 1 מ"ל של תמיסת ההקפאה המכילה את התאים לכל בקבוקון קריוגני.</li>
	<li>רשום את שמות התאים השמורים, את מספרי המעבר ואת התאריכים.</li>
	<li>הניחו את הבקבוקונים במיכל הקפאה בקצב מבוקר בטמפרטורה של -80°C למשך הלילה.</li>
	<li>הוציאו את הבקבוקונים הקריוגניים מהמקפיא בטמפרטורה של -80°C והעבירו אותם במהירות לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.</li>
</ol>

פרוטוקול לבידוד תאי אפיתל חלב מרקמה אנושית

<ol>
	<li>Smolarz, B., Nowak, A. Z., Romanowicz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer-epidemiology,+classification,+pathogenesis+and+treatment+(review+of+literature).">Breast cancer-epidemiology, classification, pathogenesis and treatment (review of literature).</a> Cancers (Basel). 14 (10), 2569 (2022).</li><li>Gudjonsson, T., Adriance, M. C., Sternlicht, M. D., Petersen, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myoepithelial+cells:+Their+origin+and+function+in+breast+morphogenesis+and+neoplasia.">Myoepithelial cells: Their origin and function in breast morphogenesis and neoplasia.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10 (3), 261-272 (2005).</li><li>Faridi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+the+primary+epithelial+breast+cancer+cells+and+the+adjacent+normal+epithelial+cells+from+iranian+women's+breast+cancer+tumors.">Isolation and characterization of the primary epithelial breast cancer cells and the adjacent normal epithelial cells from iranian women's breast cancer tumors.</a> Cytotechnology. 70 (2), 625-639 (2018).</li><li>Tovar, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+rat+mammary+gland:+Isolation,+characterization,+and+culture+of+purified+mammary+epithelial+cells+and+fibroblasts.">Dissecting the rat mammary gland: Isolation, characterization, and culture of purified mammary epithelial cells and fibroblasts.</a> Bio Protoc. 10 (22), e3818 (2020).</li><li>Jiang, X., Yang, H., Jing, Q., He, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+&amp;#34;selective+secondary+tissue+attachment&amp;#34;+method+for+isolation+and+purification+of+mammary+epithelial+cells.">A &amp;#34;selective secondary tissue attachment&amp;#34; method for isolation and purification of mammary epithelial cells.</a> Acta Histochem. 124 (8), 151972 (2022).</li><li>Bernardini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+pig+mammary+epithelial+cell+culture+model+as+a+non-clinical+tool+for+studying+epithelial+barrier-a+contribution+from+the+imi-conception+project.">Development of a pig mammary epithelial cell culture model as a non-clinical tool for studying epithelial barrier-a contribution from the imi-conception project.</a> Animals (Basel). 11 (7), 2012 (2021).</li><li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transdifferentiation+of+goat+ear+fibroblasts+into+lactating+mammary+epithelial+cells+induced+by+small+molecule+compounds.">Transdifferentiation of goat ear fibroblasts into lactating mammary epithelial cells induced by small molecule compounds.</a> Biochem Biophys Res Commun. 573, 55-61 (2021).</li><li>Hammond, S. L., Ham, R. G., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+growth+of+human+mammary+epithelial+cells:+Rapid+clonal+growth+in+defined+medium+and+extended+serial+passage+with+pituitary+extract.">Serum-free growth of human mammary epithelial cells: Rapid clonal growth in defined medium and extended serial passage with pituitary extract.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (17), 5435-5439 (1984).</li><li>Zubeldia-Plazaola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+methods+for+the+isolation+of+human+breast+epithelial+and+myoepithelial+cells.">Comparison of methods for the isolation of human breast epithelial and myoepithelial cells.</a> Front Cell Dev Biol. 3, 32 (2015).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+and+efficient+method+to+isolate+primary+human+keratinocytes+from+adult+skin+tissue.">A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue.</a> J Vis Exp. (138), e57784 (2018).</li><li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+human+gingival+epithelial+cells+using+y-27632.">Isolation and culture of primary human gingival epithelial cells using y-27632.</a> J Vis Exp. (177), e62978 (2021).</li><li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+primary+human+mammary+epithelial+cells+isolated+and+propagated+by+conditional+reprogrammed+cell+culture.">Characterization of primary human mammary epithelial cells isolated and propagated by conditional reprogrammed cell culture.</a> Oncotarget. 9 (14), 11503-11514 (2018).</li><li>B&#246;cker, W., Hungermann, D., Decker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+breast.">Anatomy of the breast.</a> Pathologe. 30 (1), 6-12 (2009).</li><li>Kouros-Mehr, H., Slorach, E. M., Sternlicht, M. D., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gata-3+maintains+the+differentiation+of+the+luminal+cell+fate+in+the+mammary+gland.">Gata-3 maintains the differentiation of the luminal cell fate in the mammary gland.</a> Cell. 127 (5), 1041-1055 (2006).</li><li>Wang, X., Reagan, M. R., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+adipose+tissue+models+for+studying+mammary+gland+development+and+breast+tissue+engineering.">Synthetic adipose tissue models for studying mammary gland development and breast tissue engineering.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 15 (3), 365-376 (2010).</li><li>Ethier, S. P., Mahacek, M. L., Gullick, W. J., Frank, T. S., Weber, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+isolation+of+normal+luminal+mammary+epithelial+cells+and+breast+cancer+cells+from+primary+and+metastatic+sites+using+selective+media.">Differential isolation of normal luminal mammary epithelial cells and breast cancer cells from primary and metastatic sites using selective media.</a> Cancer Res. 53 (3), 627-635 (1993).</li><li>Band, V., Sager, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctive+traits+of+normal+and+tumor-derived+human+mammary+epithelial+cells+expressed+in+a+medium+that+supports+long-term+growth+of+both+cell+types.">Distinctive traits of normal and tumor-derived human mammary epithelial cells expressed in a medium that supports long-term growth of both cell types.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (4), 1249-1253 (1989).</li><li>Taylor-Papadimitriou, J., Shearer, M., Tilly, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+properties+of+cells+cultured+from+early-lactation+human+milk.">Some properties of cells cultured from early-lactation human milk.</a> J Natl Cancer Inst. 58 (6), 1563-1571 (1977).</li><li>Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Y-27632+simplifies+the+isolation+procedure+of+human+primary+epidermal+cells+by+selectively+blocking+focal+adhesion+of+dermal+cells.">Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells.</a> J Tissue Eng Regen Med. 12 (2), e1251-e1255 (2018).</li><li>Yin, J., Yu, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+kinases+regulate+corneal+epithelial+wound+healing.">Rho kinases regulate corneal epithelial wound healing.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 295 (2), C378-C387 (2008).</li><li>Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., Mcbride, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+keratinocytes+are+efficiently+immortalized+by+a+rho+kinase+inhibitor.">Human keratinocytes are efficiently immortalized by a rho kinase inhibitor.</a> J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).</li><li>&#346;cie&#380;y&#324;ska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+human+primary+keratinocytes-a+methods+review.">Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review.</a> Exp Dermatol. 28 (2), 107-112 (2019).</li><li>Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispase,+a+neutral+protease+from+bacillus+polymyxa,+is+a+powerful+fibronectinase+and+type+IV+collagenase.">Dispase, a neutral protease from bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase.</a> J Invest Dermatol. 93 (2), 287-290 (1989).</li><li>Ren, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cultures+of+mouse+small+intestinal+epithelial+cells+using+the+dissociating+enzyme+type+I+collagenase+and+hyaluronidase.">Primary cultures of mouse small intestinal epithelial cells using the dissociating enzyme type I collagenase and hyaluronidase.</a> Braz J Med Biol Res. 50 (5), e5831 (2017).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים בנוגע לפרסום מאמר זה.

HMECs חיוניים לשמירה על השלמות האנטומית והתפקודית של רקמת החלב והם שימושיים בחקירות מדעיות, יישומים קליניים ותחומים קשורים15. תאי אפיתל ראשוניים הם סוג של תאים מיוחדים בעלי מעברים מוגבלים ותוחלת חיים קצרה יותר. עם זאת, הצמיחה של HMECs עוכבה על ידי אילוצים טכניים, אשר כתוצאה מכך עיכ?...

סרטן השד הוא סוג הסרטן העיקרי המאובחן אצל נשים ברחבי העולם והוא הגורם העיקרי למוות מסרטן1. הפתוגנזה של סרטן השד היא מורכבת, וכוללת גורמים רבים כגון גנטיקה, סביבה ואורח חיים. HMECs, תאים פעילים מייצרי חלב, הם אחד המרכיבים החשובים ביותר של רקמת החלב וככל הנראה הם התאים המקוריים המעורבים בקרצינוגנזה של סרטן השד. לכן, HMECs קיבלו את מירב תשומת הלב מהחוקרים לחקר סרטן השד2. יתר על כן, לתאים ראשוניים יש את היכולת לספק אפיון רלוונטי ביולוגית של תהליכים תאיים מורכבים בשל אגירתם של יציבות גנטית, מורפולוגיה נורמלית, ומערך שלם יותר של תפקודים תאיים בסיסיים שלא ניתן להשיג עם קווי תאים אימורטליים3. לפיכך, הבידוד והתרבות של קופות חולים ראשוניות הוא צעד חיוני לחקר רוב המחלות הקשורות לשד כגון סרטן השד ומחלות דלקתיות בשד.
כיום, מערכת יציבה וניתנת לשחזור לבידוד, תרבית וזיהוי של תאי אפיתל חלב מחולדות, פרות, חזירים ועזים הוקמה 4,5,6,7. עם זאת, הבידוד והתרבית של HMECs ראשוניים הם מאתגרים בשל המיקרו-סביבה המורכבת והתנובה הנמוכה של תאים. במשך עשרות שנים, מדענים חיפשו את השיטה היעילה ביותר לבודד ולטפח HMECs למרות מערכת תרבות עבור HMECs הוקמה לפני כמעט 20 שנה. לדוגמה, האמונד ועמיתיו פיתחו מדיום תרבית ללא סרום שבו HMECs גדלו ביעילות8. לאחרונה, Zubeldia-Plazaola et al. בדקו ארבע שיטות בידוד שונות באמצעות הליכי עיכול אנזימים מהירים/איטיים בשילוב עם סינון רציף או שלבי צנטריפוגה דיפרנציאליים כדי להשיג HMECs9. הם מצאו כי שיטת העיכול האיטי יחד עם צנטריפוגה דיפרנציאלית היא השיטה היעילה ביותר לבודד HMECs מרקמת שד טרייה. עם זאת, שיטת בידוד זו דורשת חתיכות גדולות של רקמה (40-75 גרם) ומשתמשת בכמויות גדולות יותר של אנזימי עיכול. ההליך שלהם מסובך (לפחות שלוש צנטריפוגות שונות כדי להשיג שברי תאים שונים), כמו גם זמן רב. לכן, עדיין נדרשת שיטה פשוטה ומהירה כדי להשיג ביעילות אוכלוסיות של HMECs מכמויות קטנות של רקמת חלב למחקר וליישומים קליניים9.
המחקרים הקודמים שלנו הראו כי הוספת מעכב קינאז הקשור ל-Rho (ROCK) Y-27632 למדיום התרבית הראשוני יכולה לפשט את תהליך בידוד תאי האפידרמיס של העור האנושי10, אשר שימש בהצלחה גם לבידוד תאי אפיתל חניכיים11. בנוסף, מחקר קודם שנערך על ידי הקבוצה של Zubeldia-Plazaola והקבוצה של ג'ין הצביע על כך של- Y-27632 יש את היכולת לעורר צמיחה מהירה ובלתי מוגבלת במבחנה של תאי אפיתל ראשוניים שמקורם ברקמת החלב 9,12. המחקר הנוכחי נועד לבדוק אם שימוש ב-Y-27632 יפשט את הבידוד והתרבות של HMECs והצלחנו לבסס שיטה פשוטה וקלה לביצוע לבידוד HMECs מחתיכות קטנות (1 גרם) של רקמת החלב.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin</td>
			<td>Basalmedia</td>
			<td>K431010</td>
			<td>For HMECs&#160; dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge Tubes</td>
			<td>NEST</td>
			<td>081722CK01</td>
			<td>For cell digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m mesh filter</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>431752</td>
			<td>For HMECs filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Cell Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>solarbio</td>
			<td>P1110-100ml</td>
			<td>For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td>For cell centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>431752</td>
			<td>Cell filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5404HN133048</td>
			<td>Cell centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>42820906</td>
			<td>For cell incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type I</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SKU:SCR103</td>
			<td>For HMECs isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase&#160;</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>CAS:42613-33-2</td>
			<td>For HMECs isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>8122622</td>
			<td>Component of neutralization medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2556132P</td>
			<td>Component of neutralization medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered solution</td>
			<td>Tecono</td>
			<td>20201033</td>
			<td>Washing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti CK7</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab68459</td>
			<td>For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti GATA3</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab199428</td>
			<td>For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>IY0040</td>
			<td>ROCK inhibitor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of primary human mammary epithelial cells

בלוטת החלב היא מבנה בסיסי של השד וממלאת תפקיד חיוני ברבייה. תאי אפיתל חלב אנושיים (HMECs), שהם תאי המקור של סרטן השד ומחלות דלקתיות אחרות הקשורות לשד, זכו לתשומת לב רבה. עם זאת, בידוד וטיפוח של HMECs ראשוניים במבחנה למטרות מחקר היה מאתגר בשל אופיים המובחן והקרטיני ותוחלת החיים הקצרה שלהם. לכן, פיתוח שיטה פשוטה ויעילה לבידוד ותרבית של קופות חולים הוא בעל ערך מדעי רב לחקר ביולוגיה של השד ומחלות הקשורות לשד. במחקר זה, בודדנו בהצלחה HMECs ראשוניים מכמויות קטנות של רקמת חלב על ידי עיכול עם תערובת של אנזימים בשילוב עם תרבית ראשונית בסרום בקר עוברי 5% DMEM המכיל מעכב קינאז הקשור לרו (ROCK) Y-27632, ולאחר מכן הרחבת תרבית בתווך קרטינוציטים ללא סרום. גישה זו מקדמת באופן סלקטיבי את הצמיחה של תאי אפיתל, וכתוצאה מכך תפוקת תאים אופטימלית. הפשטות והנוחות של שיטה זו הופכות אותה למתאימה הן למחקר מעבדה והן למחקר קליני, אשר אמור לספק תובנות חשובות בתחומי מחקר חשובים אלה.

Breast cancer is the primary type of cancer diagnosed in women globally and is the primary cause of death from cancer1. The pathogenesis of breast cancer is complex, involving multiple factors such as genetics, environment, and lifestyle. HMECs, active milk-producing cells, are one of the most important components of mammary tissue and likely are the original cells involved in breast cancer carcinogenesis. Therefore, HMECs have received the most attention from researchers for the study of breast cancer2. Furthermore, primary cells have the ability to provide a biologically relevant characterization of complex cellular processes due to their retention of genetic stability, normal morphology, and a more complete set of basic cellular functions that cannot be achieved with immortalized cell lines3. Hence, the isolation and culture of primary HMECs is an essential step for the study of most breast-related diseases such as breast cancer and breast inflammatory diseases.
At present, a stable and reproducible system for the isolation, culture, and identification of mammary epithelial cells from rats, cows, pigs, and goats has been established4,5,6,7. However, the isolation and culture of primary HMECs are challenging due to the complex microenvironment and the low yield of cells. For decades, scientists have been searching for the most effective method to isolate and cultivate HMECs although a culture system for HMECs was established nearly 20 years ago. For example, Hammond et al. developed a serum-free culture medium in which HMECs grew efficiently8. Recently, Zubeldia-Plazaola et al. tested four different isolation methods using fast/slow enzyme digestion procedures combined with sequential filtration or differential centrifugation steps to obtain HMECs9. They found that the slow digestion method together with differential centrifugation is the most efficient method to isolate HMECs from fresh breast tissue. However, that isolation method requires large pieces of tissue (40-75 g) and uses larger amounts of digestion enzymes. Their procedure is complicated (at least three different centrifugations to obtain different cell fractions), as well as time-consuming. Therefore, a simple and quick method is still needed to efficiently obtain populations of HMECs from small amounts of mammary tissue for research and clinical applications9.
Our previous studies showed that adding the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632 into the initial culture medium can simplify the process of isolating human skin epidermal cells10, which has also been successfully used for the isolation of gingival epithelial cells11. Additionally, earlier research conducted by Zubeldia-Plazaola&#39;s group and Jin&#39;s group has indicated that Y-27632 has the ability to stimulate quick and unlimited in vitro growth of primary epithelial cells derived from mammary tissue9,12. The present study aimed to test whether using Y-27632 would simplify the isolation and culture of HMECs and we successfully established a simple and easily performed method to isolate HMECs from small pieces (1 g) of mammary tissue.

מחבר זרקור: שילוב רפואה מזרחית ומערבית לטיפול בדלקת שד גרנולומטית

בידוד ותרבית של תאי אפיתל ראשוניים של חלב אנושי

Our research focus on elucidating the treatment avenues for refractory granulomatous mastitis. Leveraging an integrative approach that combines traditional Chinese and Western medicinal methodologies simultaneously will expose the complex pathogenic mechanisms driving the disease and its complications, with a focus to endeavor to alleviate these issues and improve patient prognostication. Our research reports an easier, time-saving, and the economical protocol for efficiently isolating and growing primary human mammary epithelial cells, or HMECs, from a small amount of mammary tissue.This protocol is suitable for quickly producing primary HMECs for lab and clinical applications. Building upon this study, we aim to develop a granulomatous mastitis mammary epithelial cell model to deepen our understanding of etiology and validated treatment strategies.

איור 1 מציג סכמה של ההליך. הפרוטוקול כולל שימוש בשילוב של אנזימים, כלומר דיספאז, קולגנאז וטריפסין. שילוב זה מנוצל לצורך ניתוק יריעת האפיתל משכבת הפיברובלסטים שמתחתיה ולאחר מכן שימוש בטריפסין לניתוק תאי אפיתל החלב לתרחיף. בנוסף, הצמיחה של תאי אפיתל קודמה ביעילות על ידי הוספ?...

Read this Scientific Article Protocol about Isolation and Culture of Primary Human Mammary Epithelial Cells at JoVE.com

המחקר הנוכחי מדווח על פרוטוקול קל יותר, חוסך זמן וחסכוני לבידוד וגידול יעיל של תאי אפיתל חלב אנושיים ראשוניים (HMECs) מכמויות קטנות של רקמת חלב. פרוטוקול זה מתאים לייצור מהיר של HMECs ראשוניים הן ליישומים מעבדתיים והן ליישומים קליניים.

The mammary gland is a fundamental structure of the breast and plays an essential role in reproduction. Human mammary epithelial cells (HMECs), which are ...

המחקר שלנו מתמקד בהבהרת דרכי הטיפול בדלקת שד גרנולומטית עקשנית. מינוף גישה אינטגרטיבית המשלבת במקביל מתודולוגיות רפואיות סיניות מסורתיות ומערביות יחשוף את המנגנונים הפתוגניים המורכבים המניעים את המחלה וסיבוכיה, תוך התמקדות במאמץ להקל על בעיות אלה ולשפר את הפרוגנוסטיקה של המטופלים. המחקר שלנו מדווח על פרוטוקול קל יותר, חוסך זמן וחסכוני לבידוד וגידול יעיל של תאי אפיתל ראשוניים של חלב אנושי, או HMECs, מכמות קטנה של רקמת חלב.פרוטוקול זה מתאים לייצור מהיר של HMECs ראשוניים עבור יישומי מעבדה ויישומים קליניים. בהתבסס על מחקר זה, אנו שואפים לפתח מודל תאי אפיתל גרנולומטיים של דלקת השד כדי להעמיק את ההבנה שלנו של אטיולוגיה ואסטרטגיות טיפול מתוקפות.

isolation-and-culture-of-primary-human-mammary-epithelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Primary Human Mammary Epithelial Cells

591 Views.  The First Clinical Medical College of Zhejiang Chinese Medical University. המחקר שלנו מתמקד בהבהרת דרכי הטיפול בדלקת שד גרנולומטית עקשנית. מינוף גישה אינטגרטיבית המשלבת במקביל מתודולוגיות רפואיות סיניות מסורתיות ומערביות יחשוף את המנגנונים הפתוגניים המורכבים המניעים את המחלה וסיבוכיה, תוך התמקדות במאמץ להקל על בעיות אלה ולשפר את הפרוגנוסטיקה ...

Video: מחבר זרקור: שילוב רפואה מזרחית ומערבית לטיפול בדלקת שד גרנולומטית

The mammary gland is a fundamental structure of the breast and plays an essential role in reproduction. Human mammary epithelial cells (HMECs), which are the origin cells of breast cancer and other breast-related inflammatory diseases, have garnered considerable attention. However, isolating and culturing primary HMECs in vitro for research purposes has been challenging due to their highly differentiated, keratinized nature and their short lifespan. Therefore, developing a simple and efficient method to isolate and culture HMECs is of great scientific value for the study of breast biology and breast-related diseases. In this study, we successfully isolated primary HMECs from small amounts of mammary tissue by digestion with a mixture of enzymes combined with an initial culture in 5% fetal bovine serum-DMEM containing the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632, followed by culture expansion in serum-free keratinocyte medium. This approach selectively promotes the growth of epithelial cells, resulting in an optimized cell yield. The simplicity and convenience of this method make it suitable for both laboratory and clinical research, which should provide valuable insights into these important areas of study.

The present study reports an easier, time-saving, and economical protocol to efficiently isolate and grow primary human mammary epithelial cells (HMECs) from small amounts of mammary tissue. This protocol is suitable for quickly producing primary HMECs both for laboratory and clinical applications.

Digestion of Mammary Tissue for Isolating Human Mammary Epithelial Cells

Begin by dissociating the tissue. Use two pairs of forceps to remove the adipose tissue from the mammary tissue. Ensure that the remaining mammary tissue weighs approximately one gram.Rinse the mammary tissue in five milliliters of 75%ethanol solution for five seconds. Then, wash with 20 milliliters of washing solution two times for five minutes each. Then, use two surgical blades to slice the mammary tissue into smaller fragments.Continuously for 15 minutes to obtain a tissue homogenate, transfer the shredded tissue to a 50 milliliter centrifuge tube. Add 10 milliliters of dispase and collagenase solution, three milliliters of 0.25%trypsin, and seven milliliters of PBS for a total of 20 milliliters of digestion solution. Place the tube in a water bath at 37 degrees Celsius and incubate for 1 1/2 hours, shaking the tube every 20 minutes.To stop the digestion process, add 20 milliliters of neutralizing solution. Then, pipette the contents approximately 15 times to ensure thorough mixing. Filter the mixture through a 100 micron mesh filter.After that, centrifuge at 156G for five minutes. Then, remove the supernatant. Repeat incubation of the pellet with 20 milliliters of neutralizing solution, then mix by pipetting.Centrifuge again for five minutes. Carefully remove the supernatant and resuspend the cell pellet with 10 milliliters of initial culture medium. Plate the cell suspension in a 100 millimeter cell culture dish.Cultivate the cells in a 5%carbon dioxide incubator at 37 degrees Celsius. Replace the original culture medium with fresh epithelial cell medium every third day. Check the cells and refresh the medium every two days.Using this protocol, human mammary epithelial cells were isolated from mammary tissue. Post isolation analysis showed that cells treated with ROCK inhibitor Y-27632 exhibited pronounced growth compared to the control group. CCK-8 assay revealed that cells in the medium containing Y-27632 proliferated at a significantly higher rate than those in the control medium.Immunofluorescence assays confirmed that the majority of cells expressed mammary epithelial cell markers, CK7 and GATA3, with negligible presence of other cell types in subsequent passages. Further, qRT-PCR studies showed consistent expression levels of CK7 and GATA3 over several passages indicating consistent phenotype or differentiation capacity.