Bu çalışma, Çin'in Zhejiang Eyaleti TCM Bilim ve Teknoloji Programından alınan hibelerle desteklenmiştir (2017ZA055; 2018ZA036) ve Çin'in Guizhou eyaleti, Zunyi Bilim ve Teknoloji Projesi (Zunyi Şehri Kehe Destek NS (2020) No. 18) X. Xu'ya. Yazarlar, hücre kültürü eğitimi verdiği için Youjia (Hangzhou) Biyomedikal Teknoloji Şirketi Moleküler Biyoloji Laboratuvarı'na teşekkür eder.

Bu protokolde kullanılan taze normal meme dokuları, Zhejiang Çin Tıp Üniversitesi Birinci Bağlı Hastanesi'nde, Zhejiang Çin Tıp Üniversitesi Birinci Bağlı Hastanesi Tıbbi Etik Komitesi'nin yönergelerine göre refrakter granülomatöz lobüler mastit lezyonu etrafındaki cerrahiden toplanır (Protokol No. ChiMCTR2100005281, Tarih: 2017-07-17).
1. Doku edinimi
<ol><li>Yetişkin kadınlardan alınan cerrahi örneklerden taze meme dokularını% 3 penisilin / streptomisin (P / S) içeren 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içeren steril tüplere toplayın. NOT: Meme dokuları, ameliyattan alındıktan sonraki 24 saat içinde aşağıdaki ayrıntılara göre ele alınmalıdır.</li>
</ol>2. Dokunun ön tedavisi
<ol><li>Yağ dokusunu meme dokusundan iki çift forseps ile çıkarın ve kalan meme dokusunun ~1 g ağırlığında olduğundan emin olun.</li>
	<li>Meme dokusunu 5 saniye boyunca% 75 etanol çözeltisinde (5 mL) durulayın ve ardından 20 mL yıkama çözeltisi (Tablo 1) ile 2 x 5 dakika yıkayın.</li>
</ol>3. Dokunun sindirimi
<ol><li>Meme dokusunu daha küçük parçalara bölün ve doku homojenatını elde etmek için 15 dakikalık bir süre boyunca iki cerrahi bıçak kullanarak dokuyu parçalayın. Doku parçalarını 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>Meme dokusu parçalarını içeren 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplam 20 mL sindirim solüsyonuna 10 mL 5.0 mg / mL dispas + 5.0 mg / mL kollajenaz solüsyonu, 3 mL %0.25 tripsin ve 7 mL PBS ekleyin. Tüpü 37 ° C'de bir su banyosuna yerleştirin ve 1,5 saat inkübe edin; Tüpü her 20 dakikada bir çalkalayın.</li>
	<li>20 mL nötralize edici solüsyon enjekte ederek sindirim işlemini durdurun. İçeriği ~15x pipetleyerek karıştırın.</li>
	<li>Karışımı 100 μm'lik bir gözenekli filtreden süzün. 156 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı çıkarın ve peletin inkübasyonunu 20 mL nötralize edici çözelti ile tekrarlayın. İçeriği 15x pipetleyerek karıştırın ve 156 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve hücre peletini 10 mL başlangıç kültür ortamı ile yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu 100 mm'lik bir hücre kültürü kabına yerleştirin.</li>
	<li>Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO2 inkübatörde yetiştirin. Orijinal kültür ortamını her üç günde bir taze epitel hücre ortamı ile değiştirin. Hücreleri kontrol edin ve ortamı her 2 günde bir yenileyin.</li>
</ol>4. Hücre geçişi
<ol><li>Hücreler %80-90 birleşime ulaştığında 100 mm'lik kabı inkübatörden çıkarın, kullanılan ortamı atın ve kabı 2 mL PBS ile 2 kez durulayın. PBS'yi çıkarın ve ardından her 100 mm'lik tabağa 2 mL% 0.05 tripsin ekleyin. NOT: Tripsin çözeltisinin tabağın dibi ile yeterli temas ettiğinden emin olmak için tabağı döndürün.</li>
	<li>Sindirim işlemi için 100 mm'lik kabı 37 °C'lik bir inkübatöre ~7 dakika yerleştirin.</li>
	<li>Hücrelerin çoğunun tabağın dibinden ayrıldığından emin olmak için 40x objektif kullanarak hücreleri mikroskopla inceleyin.</li>
	<li>8 mL nötralize edici solüsyon ekleyerek sindirim işlemini durdurun ve hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Hücreleri 10-15 kat yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Hücreleri 156 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı dikkatlice çıkarın, hücreleri 10 mL epitel hücre ortamı ile yeniden süspanse edin ve hücre sayısını sayın.</li>
	<li>100 mm'lik bir tabakta 10 mL epitel hücre ortamında 1 ×10 6 hücre ekleyin.</li>
	<li>Epitel hücre ortamını yenileyin ve hücreleri her 2 günde bir gözlemleyin.</li>
</ol>5. Hücre kriyoprezervasyonu
<ol><li>4.1-4.4 adımlarını tekrarlayın.</li>
	<li>Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve hücreleri 2 mL hücre kriyoprezervasyon solüsyonunda yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Hücreleri içeren kriyoprezervasyon solüsyonunun 1 mL'sini her bir kriyojenik şişeye aktarın.</li>
	<li>Dondurularak saklanmış hücrelerin adlarını, geçiş numaralarını ve tarihlerini kaydedin.</li>
	<li>Şişeleri gece boyunca -80 ° C'de kontrollü bir dondurma kabına koyun.</li>
	<li>Kriyojenik şişeleri -80 °C dondurucudan çıkarın ve uzun süreli saklama için hızlı bir şekilde sıvı nitrojene aktarın.</li>
</ol>

Meme Epitel Hücrelerini İnsan Dokusundan İzole Etme Protokolü

<ol>
	<li>Smolarz, B., Nowak, A. Z., Romanowicz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer-epidemiology,+classification,+pathogenesis+and+treatment+(review+of+literature).">Breast cancer-epidemiology, classification, pathogenesis and treatment (review of literature).</a> Cancers (Basel). 14 (10), 2569 (2022).</li><li>Gudjonsson, T., Adriance, M. C., Sternlicht, M. D., Petersen, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myoepithelial+cells:+Their+origin+and+function+in+breast+morphogenesis+and+neoplasia.">Myoepithelial cells: Their origin and function in breast morphogenesis and neoplasia.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10 (3), 261-272 (2005).</li><li>Faridi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+the+primary+epithelial+breast+cancer+cells+and+the+adjacent+normal+epithelial+cells+from+iranian+women's+breast+cancer+tumors.">Isolation and characterization of the primary epithelial breast cancer cells and the adjacent normal epithelial cells from iranian women's breast cancer tumors.</a> Cytotechnology. 70 (2), 625-639 (2018).</li><li>Tovar, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+rat+mammary+gland:+Isolation,+characterization,+and+culture+of+purified+mammary+epithelial+cells+and+fibroblasts.">Dissecting the rat mammary gland: Isolation, characterization, and culture of purified mammary epithelial cells and fibroblasts.</a> Bio Protoc. 10 (22), e3818 (2020).</li><li>Jiang, X., Yang, H., Jing, Q., He, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+&amp;#34;selective+secondary+tissue+attachment&amp;#34;+method+for+isolation+and+purification+of+mammary+epithelial+cells.">A &amp;#34;selective secondary tissue attachment&amp;#34; method for isolation and purification of mammary epithelial cells.</a> Acta Histochem. 124 (8), 151972 (2022).</li><li>Bernardini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+pig+mammary+epithelial+cell+culture+model+as+a+non-clinical+tool+for+studying+epithelial+barrier-a+contribution+from+the+imi-conception+project.">Development of a pig mammary epithelial cell culture model as a non-clinical tool for studying epithelial barrier-a contribution from the imi-conception project.</a> Animals (Basel). 11 (7), 2012 (2021).</li><li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transdifferentiation+of+goat+ear+fibroblasts+into+lactating+mammary+epithelial+cells+induced+by+small+molecule+compounds.">Transdifferentiation of goat ear fibroblasts into lactating mammary epithelial cells induced by small molecule compounds.</a> Biochem Biophys Res Commun. 573, 55-61 (2021).</li><li>Hammond, S. L., Ham, R. G., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+growth+of+human+mammary+epithelial+cells:+Rapid+clonal+growth+in+defined+medium+and+extended+serial+passage+with+pituitary+extract.">Serum-free growth of human mammary epithelial cells: Rapid clonal growth in defined medium and extended serial passage with pituitary extract.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (17), 5435-5439 (1984).</li><li>Zubeldia-Plazaola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+methods+for+the+isolation+of+human+breast+epithelial+and+myoepithelial+cells.">Comparison of methods for the isolation of human breast epithelial and myoepithelial cells.</a> Front Cell Dev Biol. 3, 32 (2015).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+and+efficient+method+to+isolate+primary+human+keratinocytes+from+adult+skin+tissue.">A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue.</a> J Vis Exp. (138), e57784 (2018).</li><li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+human+gingival+epithelial+cells+using+y-27632.">Isolation and culture of primary human gingival epithelial cells using y-27632.</a> J Vis Exp. (177), e62978 (2021).</li><li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+primary+human+mammary+epithelial+cells+isolated+and+propagated+by+conditional+reprogrammed+cell+culture.">Characterization of primary human mammary epithelial cells isolated and propagated by conditional reprogrammed cell culture.</a> Oncotarget. 9 (14), 11503-11514 (2018).</li><li>B&#246;cker, W., Hungermann, D., Decker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+breast.">Anatomy of the breast.</a> Pathologe. 30 (1), 6-12 (2009).</li><li>Kouros-Mehr, H., Slorach, E. M., Sternlicht, M. D., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gata-3+maintains+the+differentiation+of+the+luminal+cell+fate+in+the+mammary+gland.">Gata-3 maintains the differentiation of the luminal cell fate in the mammary gland.</a> Cell. 127 (5), 1041-1055 (2006).</li><li>Wang, X., Reagan, M. R., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+adipose+tissue+models+for+studying+mammary+gland+development+and+breast+tissue+engineering.">Synthetic adipose tissue models for studying mammary gland development and breast tissue engineering.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 15 (3), 365-376 (2010).</li><li>Ethier, S. P., Mahacek, M. L., Gullick, W. J., Frank, T. S., Weber, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+isolation+of+normal+luminal+mammary+epithelial+cells+and+breast+cancer+cells+from+primary+and+metastatic+sites+using+selective+media.">Differential isolation of normal luminal mammary epithelial cells and breast cancer cells from primary and metastatic sites using selective media.</a> Cancer Res. 53 (3), 627-635 (1993).</li><li>Band, V., Sager, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctive+traits+of+normal+and+tumor-derived+human+mammary+epithelial+cells+expressed+in+a+medium+that+supports+long-term+growth+of+both+cell+types.">Distinctive traits of normal and tumor-derived human mammary epithelial cells expressed in a medium that supports long-term growth of both cell types.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (4), 1249-1253 (1989).</li><li>Taylor-Papadimitriou, J., Shearer, M., Tilly, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+properties+of+cells+cultured+from+early-lactation+human+milk.">Some properties of cells cultured from early-lactation human milk.</a> J Natl Cancer Inst. 58 (6), 1563-1571 (1977).</li><li>Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Y-27632+simplifies+the+isolation+procedure+of+human+primary+epidermal+cells+by+selectively+blocking+focal+adhesion+of+dermal+cells.">Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells.</a> J Tissue Eng Regen Med. 12 (2), e1251-e1255 (2018).</li><li>Yin, J., Yu, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+kinases+regulate+corneal+epithelial+wound+healing.">Rho kinases regulate corneal epithelial wound healing.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 295 (2), C378-C387 (2008).</li><li>Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., Mcbride, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+keratinocytes+are+efficiently+immortalized+by+a+rho+kinase+inhibitor.">Human keratinocytes are efficiently immortalized by a rho kinase inhibitor.</a> J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).</li><li>&#346;cie&#380;y&#324;ska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+human+primary+keratinocytes-a+methods+review.">Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review.</a> Exp Dermatol. 28 (2), 107-112 (2019).</li><li>Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispase,+a+neutral+protease+from+bacillus+polymyxa,+is+a+powerful+fibronectinase+and+type+IV+collagenase.">Dispase, a neutral protease from bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase.</a> J Invest Dermatol. 93 (2), 287-290 (1989).</li><li>Ren, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cultures+of+mouse+small+intestinal+epithelial+cells+using+the+dissociating+enzyme+type+I+collagenase+and+hyaluronidase.">Primary cultures of mouse small intestinal epithelial cells using the dissociating enzyme type I collagenase and hyaluronidase.</a> Braz J Med Biol Res. 50 (5), e5831 (2017).</li></ol>

Yazarlar, bu makalenin yayınlanması ile ilgili herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

HMEC'ler, meme dokusunun anatomik ve fonksiyonel bütünlüğünün korunmasında hayati öneme sahiptir ve bilimsel araştırmalarda, klinik uygulamalarda ve ilgili alanlarda faydalıdırlar15. Birincil epitel hücreleri, sınırlı geçişlere ve daha kısa ömürlere sahip bir tür özel hücredir. Bununla birlikte, HMEC'lerin büyümesi, meme kanseri ve meme ile ilgili diğer enflamatuar hastalıklardaki araştırma ilerlemelerini engelleyen teknik kısıtlamalar tarafından engellenmiştir<su...

Meme kanseri, tüm dünyada kadınlarda teşhis edilen birincil kanser türüdür ve kanserden ölümlerin birincil nedenidir1. Meme kanserinin patogenezi karmaşıktır ve genetik, çevre ve yaşam tarzı gibi birçok faktörü içerir. Aktif süt üreten hücreler olan HMEC'ler, meme dokusunun en önemli bileşenlerinden biridir ve muhtemelen meme kanseri karsinogenezinde yer alan orijinal hücrelerdir. Bu nedenle, HMEC'ler meme kanseri çalışması için araştırmacılardan en fazla ilgiyi görmüştür2. Ayrıca, birincil hücreler, genetik stabiliteyi, normal morfolojiyi ve ölümsüzleştirilmiş hücre dizileri ile elde edilemeyen daha eksiksiz bir temel hücresel işlevler setini korumaları nedeniyle karmaşık hücresel süreçlerin biyolojik olarak ilgili bir karakterizasyonunu sağlama yeteneğine sahiptir3. Bu nedenle, primer HMEC'lerin izolasyonu ve kültürü, meme kanseri ve meme inflamatuar hastalıkları gibi meme ile ilgili hastalıkların çoğunun incelenmesi için önemli bir adımdır.
Şu anda, sıçanlardan,, domuzlardan ve keçilerden meme epitel hücrelerinin izolasyonu, kültürü ve tanımlanması için kararlı ve tekrarlanabilir bir sistem kurulmuştur 4,5,6,7. Bununla birlikte, birincil HMEC'lerin izolasyonu ve kültürü, karmaşık mikro çevre ve düşük hücre verimi nedeniyle zordur. Onlarca yıldır bilim adamları, HMEC'ler için bir kültür sistemi yaklaşık 20 yıl önce kurulmuş olmasına rağmen, HMEC'leri izole etmek ve yetiştirmek için en etkili yöntemi arıyorlar. Örneğin, Hammond ve ark. HMEC'lerin verimli bir şekilde büyüdüğü serum içermeyen bir kültür ortamı geliştirdi8. Son zamanlarda, Zubeldia-Plazaola ve ark. HMEC'leri elde etmek için sıralı filtrasyon veya diferansiyel santrifüjleme adımları ile birlikte hızlı/yavaş enzim sindirim prosedürlerini kullanarak dört farklı izolasyon yöntemini test etti9. Diferansiyel santrifüjleme ile birlikte yavaş sindirim yönteminin, HMEC'leri taze meme dokusundan izole etmek için en etkili yöntem olduğunu buldular. Bununla birlikte, bu izolasyon yöntemi büyük doku parçaları (40-75 g) gerektirir ve daha büyük miktarlarda sindirim enzimleri kullanır. Prosedürleri karmaşıktır (farklı hücre fraksiyonları elde etmek için en az üç farklı santrifüjleme) ve zaman alıcıdır. Bu nedenle, araştırma ve klinik uygulamalar için küçük miktarlarda meme dokusundan HMEC popülasyonlarını verimli bir şekilde elde etmek için hala basit ve hızlı bir yönteme ihtiyaç vardır9.
Önceki çalışmalarımız, Rho ile ilişkili kinaz (ROCK) inhibitörü Y-27632'nin ilk kültür ortamına eklenmesinin, diş eti epitel hücrelerinin11 izolasyonu için de başarıyla kullanılan insan derisi epidermal hücrelerinin10 izole edilmesi sürecini basitleştirebileceğini göstermiştir. Ek olarak, Zubeldia-Plazaola'nın grubu ve Jin'in grubu tarafından yürütülen daha önceki araştırmalar, Y-27632'nin meme dokusundantüretilen primer epitel hücrelerinin hızlı ve sınırsız in vitro büyümesini uyarma yeteneğine sahip olduğunu göstermiştir 9,12. Bu çalışma, Y-27632 kullanımının HMEC'lerin izolasyonunu ve kültürünü basitleştirip basitleştirmeyeceğini test etmeyi amaçladı ve HMEC'leri küçük meme dokusu parçalarından (1 g) izole etmek için basit ve kolay uygulanabilir bir yöntemi başarıyla oluşturduk.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin</td>
			<td>Basalmedia</td>
			<td>K431010</td>
			<td>For HMECs&#160; dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge Tubes</td>
			<td>NEST</td>
			<td>081722CK01</td>
			<td>For cell digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m mesh filter</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>431752</td>
			<td>For HMECs filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Cell Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>solarbio</td>
			<td>P1110-100ml</td>
			<td>For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td>For cell centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>431752</td>
			<td>Cell filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5404HN133048</td>
			<td>Cell centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>42820906</td>
			<td>For cell incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type I</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SKU:SCR103</td>
			<td>For HMECs isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase&#160;</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>CAS:42613-33-2</td>
			<td>For HMECs isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>8122622</td>
			<td>Component of neutralization medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2556132P</td>
			<td>Component of neutralization medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered solution</td>
			<td>Tecono</td>
			<td>20201033</td>
			<td>Washing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti CK7</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab68459</td>
			<td>For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti GATA3</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab199428</td>
			<td>For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>IY0040</td>
			<td>ROCK inhibitor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of primary human mammary epithelial cells

Meme bezi, memenin temel bir yapısıdır ve üremede önemli bir rol oynar. Meme kanseri ve diğer meme ile ilgili enflamatuar hastalıkların köken hücreleri olan insan meme epitel hücreleri (HMEC'ler) büyük ilgi görmüştür. Bununla birlikte, birincil HMEC'lerin araştırma amacıyla in vitro olarak izole edilmesi ve kültürlenmesi, oldukça farklılaşmış, keratinize yapıları ve kısa ömürleri nedeniyle zor olmuştur. Bu nedenle, HMEC'leri izole etmek ve kültürlemek için basit ve etkili bir yöntem geliştirmek, meme biyolojisi ve meme ile ilgili hastalıkların incelenmesi için büyük bilimsel değere sahiptir. Bu çalışmada, Rho ile ilişkili kinaz (ROCK) inhibitörü Y-27632 içeren %5'lik fetal sığır serumu-DMEM'de bir başlangıç kültürü ile birleştirilmiş bir enzim karışımı ile sindirim yoluyla küçük miktarlarda meme dokusundan primer HMEC'leri başarılı bir şekilde izole ettik ve ardından serumsuz keratinosit ortamında kültür genişletmesi izledik. Bu yaklaşım, epitel hücrelerinin büyümesini seçici olarak teşvik ederek optimize edilmiş bir hücre verimi ile sonuçlanır. Bu yöntemin basitliği ve rahatlığı, onu hem laboratuvar hem de klinik araştırmalar için uygun hale getirir ve bu da bu önemli çalışma alanlarına değerli bilgiler sağlamalıdır.

Breast cancer is the primary type of cancer diagnosed in women globally and is the primary cause of death from cancer1. The pathogenesis of breast cancer is complex, involving multiple factors such as genetics, environment, and lifestyle. HMECs, active milk-producing cells, are one of the most important components of mammary tissue and likely are the original cells involved in breast cancer carcinogenesis. Therefore, HMECs have received the most attention from researchers for the study of breast cancer2. Furthermore, primary cells have the ability to provide a biologically relevant characterization of complex cellular processes due to their retention of genetic stability, normal morphology, and a more complete set of basic cellular functions that cannot be achieved with immortalized cell lines3. Hence, the isolation and culture of primary HMECs is an essential step for the study of most breast-related diseases such as breast cancer and breast inflammatory diseases.
At present, a stable and reproducible system for the isolation, culture, and identification of mammary epithelial cells from rats, cows, pigs, and goats has been established4,5,6,7. However, the isolation and culture of primary HMECs are challenging due to the complex microenvironment and the low yield of cells. For decades, scientists have been searching for the most effective method to isolate and cultivate HMECs although a culture system for HMECs was established nearly 20 years ago. For example, Hammond et al. developed a serum-free culture medium in which HMECs grew efficiently8. Recently, Zubeldia-Plazaola et al. tested four different isolation methods using fast/slow enzyme digestion procedures combined with sequential filtration or differential centrifugation steps to obtain HMECs9. They found that the slow digestion method together with differential centrifugation is the most efficient method to isolate HMECs from fresh breast tissue. However, that isolation method requires large pieces of tissue (40-75 g) and uses larger amounts of digestion enzymes. Their procedure is complicated (at least three different centrifugations to obtain different cell fractions), as well as time-consuming. Therefore, a simple and quick method is still needed to efficiently obtain populations of HMECs from small amounts of mammary tissue for research and clinical applications9.
Our previous studies showed that adding the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632 into the initial culture medium can simplify the process of isolating human skin epidermal cells10, which has also been successfully used for the isolation of gingival epithelial cells11. Additionally, earlier research conducted by Zubeldia-Plazaola&#39;s group and Jin&#39;s group has indicated that Y-27632 has the ability to stimulate quick and unlimited in vitro growth of primary epithelial cells derived from mammary tissue9,12. The present study aimed to test whether using Y-27632 would simplify the isolation and culture of HMECs and we successfully established a simple and easily performed method to isolate HMECs from small pieces (1 g) of mammary tissue.

Yazar Spotlight: Granülomatöz Mastit Tedavisi için Doğu ve Batı Tıbbının Entegrasyonu

Primer İnsan Meme Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü

Our research focus on elucidating the treatment avenues for refractory granulomatous mastitis. Leveraging an integrative approach that combines traditional Chinese and Western medicinal methodologies simultaneously will expose the complex pathogenic mechanisms driving the disease and its complications, with a focus to endeavor to alleviate these issues and improve patient prognostication. Our research reports an easier, time-saving, and the economical protocol for efficiently isolating and growing primary human mammary epithelial cells, or HMECs, from a small amount of mammary tissue.This protocol is suitable for quickly producing primary HMECs for lab and clinical applications. Building upon this study, we aim to develop a granulomatous mastitis mammary epithelial cell model to deepen our understanding of etiology and validated treatment strategies.

Şekil 1 , prosedürün bir şemasını göstermektedir. Protokol, dispas, kollajenaz ve tripsin gibi bir enzim kombinasyonunun kullanılmasını içerir. Bu kombinasyon, epitel tabakasını altındaki fibroblast tabakasından ayırmak ve daha sonra meme epitel hücrelerini bir süspansiyona ayırmak için tripsin kullanmak amacıyla kullanılır. Ek olarak, epitel hücrelerinin büyümesi, ilk kültür ortamına Y-27632 eklenerek etkili bir şekilde desteklendi. Sonuç olarak, bu yöntem, y...

Read this Scientific Article Protocol about Isolation and Culture of Primary Human Mammary Epithelial Cells at JoVE.com

Bu çalışma, primer insan meme epitel hücrelerini (HMEC'ler) küçük miktarlarda meme dokusundan verimli bir şekilde izole etmek ve büyütmek için daha kolay, zaman kazandıran ve ekonomik bir protokol bildirmektedir. Bu protokol, hem laboratuvar hem de klinik uygulamalar için birincil HMEC'lerin hızlı bir şekilde üretilmesi için uygundur.

The mammary gland is a fundamental structure of the breast and plays an essential role in reproduction. Human mammary epithelial cells (HMECs), which are ...

Araştırmamız, refrakter granülomatöz mastitis için tedavi yollarını aydınlatmaya odaklanmaktadır. Geleneksel Çin ve Batı tıbbi metodolojilerini aynı anda birleştiren bütünleştirici bir yaklaşımdan yararlanmak, bu sorunları hafifletmeye ve hasta prognostiğini iyileştirmeye odaklanarak, hastalığı ve komplikasyonlarını yönlendiren karmaşık patojenik mekanizmaları ortaya çıkaracaktır. Araştırmamız, birincil insan meme epitel hücrelerini veya HMEC'leri az miktarda meme dokusundan verimli bir şekilde izole etmek ve büyütmek için daha kolay, zaman kazandıran ve ekonomik bir protokol bildirmektedir.Bu protokol, laboratuvar ve klinik uygulamalar için birincil HMEC'lerin hızlı bir şekilde üretilmesi için uygundur. Bu çalışmaya dayanarak, etiyoloji anlayışımızı ve doğrulanmış tedavi stratejilerimizi derinleştirmek için bir granülomatöz mastitis meme epitel hücre modeli geliştirmeyi amaçlıyoruz.

isolation-and-culture-of-primary-human-mammary-epithelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Primary Human Mammary Epithelial Cells

595 Görüntüleme.  The First Clinical Medical College of Zhejiang Chinese Medical University. Araştırmamız, refrakter granülomatöz mastitis için tedavi yollarını aydınlatmaya odaklanmaktadır. Geleneksel Çin ve Batı tıbbi metodolojilerini aynı anda birleştiren bütünleştirici bir yaklaşımdan yararlanmak, bu sorunları hafifletmeye ve hasta prognostiğini iyileştirmeye odaklanarak, hastalığı ve komplikasyonlarını yönlendiren karmaşık patojenik mekanizmaları ortaya çıkaracaktır. Araştırmamız, birincil insan meme epitel hücrelerini veya HMEC'leri az mik...

Video: Yazar Spotlight: Granülomatöz Mastit Tedavisi için Doğu ve Batı Tıbbının Entegrasyonu

The mammary gland is a fundamental structure of the breast and plays an essential role in reproduction. Human mammary epithelial cells (HMECs), which are the origin cells of breast cancer and other breast-related inflammatory diseases, have garnered considerable attention. However, isolating and culturing primary HMECs in vitro for research purposes has been challenging due to their highly differentiated, keratinized nature and their short lifespan. Therefore, developing a simple and efficient method to isolate and culture HMECs is of great scientific value for the study of breast biology and breast-related diseases. In this study, we successfully isolated primary HMECs from small amounts of mammary tissue by digestion with a mixture of enzymes combined with an initial culture in 5% fetal bovine serum-DMEM containing the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632, followed by culture expansion in serum-free keratinocyte medium. This approach selectively promotes the growth of epithelial cells, resulting in an optimized cell yield. The simplicity and convenience of this method make it suitable for both laboratory and clinical research, which should provide valuable insights into these important areas of study.

The present study reports an easier, time-saving, and economical protocol to efficiently isolate and grow primary human mammary epithelial cells (HMECs) from small amounts of mammary tissue. This protocol is suitable for quickly producing primary HMECs both for laboratory and clinical applications.

Biyoloji

Digestion of Mammary Tissue for Isolating Human Mammary Epithelial Cells

Begin by dissociating the tissue. Use two pairs of forceps to remove the adipose tissue from the mammary tissue. Ensure that the remaining mammary tissue weighs approximately one gram.Rinse the mammary tissue in five milliliters of 75%ethanol solution for five seconds. Then, wash with 20 milliliters of washing solution two times for five minutes each. Then, use two surgical blades to slice the mammary tissue into smaller fragments.Continuously for 15 minutes to obtain a tissue homogenate, transfer the shredded tissue to a 50 milliliter centrifuge tube. Add 10 milliliters of dispase and collagenase solution, three milliliters of 0.25%trypsin, and seven milliliters of PBS for a total of 20 milliliters of digestion solution. Place the tube in a water bath at 37 degrees Celsius and incubate for 1 1/2 hours, shaking the tube every 20 minutes.To stop the digestion process, add 20 milliliters of neutralizing solution. Then, pipette the contents approximately 15 times to ensure thorough mixing. Filter the mixture through a 100 micron mesh filter.After that, centrifuge at 156G for five minutes. Then, remove the supernatant. Repeat incubation of the pellet with 20 milliliters of neutralizing solution, then mix by pipetting.Centrifuge again for five minutes. Carefully remove the supernatant and resuspend the cell pellet with 10 milliliters of initial culture medium. Plate the cell suspension in a 100 millimeter cell culture dish.Cultivate the cells in a 5%carbon dioxide incubator at 37 degrees Celsius. Replace the original culture medium with fresh epithelial cell medium every third day. Check the cells and refresh the medium every two days.Using this protocol, human mammary epithelial cells were isolated from mammary tissue. Post isolation analysis showed that cells treated with ROCK inhibitor Y-27632 exhibited pronounced growth compared to the control group. CCK-8 assay revealed that cells in the medium containing Y-27632 proliferated at a significantly higher rate than those in the control medium.Immunofluorescence assays confirmed that the majority of cells expressed mammary epithelial cell markers, CK7 and GATA3, with negligible presence of other cell types in subsequent passages. Further, qRT-PCR studies showed consistent expression levels of CK7 and GATA3 over several passages indicating consistent phenotype or differentiation capacity.