Este trabalho foi apoiado por doações do Programa de Ciência e Tecnologia TCM da Província de Zhejiang, China (2017ZA055; 2018ZA036), e o Projeto de Ciência e Tecnologia de Zunyi, província de Guizhou, China (Zunyi City Kehe Support NS (2020) No. 18) para X. Xu. Os autores agradecem ao Laboratório de Biologia Molecular da Youjia (Hangzhou) Biomedical Technology Company por fornecer treinamento em cultura de células.

Os tecidos mamários normais frescos usados neste protocolo são coletados da cirurgia ao redor da lesão de mastite lobular granulomatosa refratária no Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Médica Chinesa de Zhejiang, de acordo com as diretrizes do Comitê de Ética Médica do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Médica Chinesa de Zhejiang (Protocolo No. ChiMCTR2100005281, Data: 2017-07-17).
1. Aquisição de tecido
<ol><li>Colete tecidos mamários frescos de espécimes cirúrgicos retirados de mulheres adultas em tubos estéreis contendo 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) com penicilina/estreptomicina a 3% (P/S). NOTA: Os tecidos mamários devem ser manuseados de acordo com os seguintes detalhes dentro de 24 horas após a coleta da cirurgia.</li>
</ol>2. Pré-tratamento do tecido
<ol><li>Remova o tecido adiposo do tecido mamário com dois pares de pinças, garantindo que o tecido mamário restante tenha ~ 1 g de peso.</li>
	<li>Enxaguar o tecido mamário em solução de etanol a 75% (5 mL) por 5 s e depois lavar com 20 mL de solução de lavagem (Tabela 1) por 2 x 5 min.</li>
</ol>3. Digestão do tecido
<ol><li>Corte o tecido mamário em fragmentos menores, triturando o tecido usando duas lâminas cirúrgicas por um período de 15 min para obter o homogeneizado do tecido. Transfira os pedaços de tecido para um tubo de centrífuga de 50 mL.</li>
	<li>Adicione 10 mL de dispase 5,0 mg/mL + solução de colagenase 5,0 mg/mL, 3 mL de tripsina a 0,25% e 7 mL de PBS a um total de 20 mL de solução de digestão em um tubo de centrifugação de 50 mL que contém os fragmentos de tecido mamário. Colocar o tubo em banho-maria a 37 °C e incubar durante 1,5 h; agite o tubo a cada 20 min.</li>
	<li>Pare o processo de digestão injetando 20 mL da solução neutralizante. Misture o conteúdo pipetando ~ 15x.</li>
	<li>Filtrar a mistura através de um filtro de malha de 100 μm. Centrifugue a 156 × g por 5 min.</li>
	<li>Remover o sobrenadante e repetir a incubação do sedimento com 20 ml de solução neutralizante. Misture o conteúdo pipetando 15x e centrifugue a 156 × g por 5 min.</li>
	<li>Remova o sobrenadante cuidadosamente e ressuspenda o pellet celular com 10 mL de meio de cultura inicial. Colocar a suspensão de células numa placa de cultura de células de 100 mm.</li>
	<li>Cultive as células em uma incubadora de CO2 a 5% a 37 °C. Substitua o meio de cultura original por meio de células epiteliais frescas a cada três dias. Verifique as células e atualize o meio a cada 2 dias.</li>
</ol>4. Passagem celular
<ol><li>Remova o prato de 100 mm da incubadora quando as células atingirem 80%-90% de confluência, descarte o meio usado e enxágue o prato 2x com 2 mL de PBS. Remova o PBS e, em seguida, adicione 2 mL de tripsina a 0,05% em cada placa de 100 mm. NOTA: Agite o prato para certificar-se de que a solução de tripsina tenha contato suficiente com o fundo do prato.</li>
	<li>Coloque o prato de 100 mm em uma incubadora a 37 °C por ~7 min para o processo de digestão.</li>
	<li>Examine as células com um microscópio usando uma objetiva de 40x para garantir que a maioria das células tenha sido dissociada do fundo do prato.</li>
	<li>Pare o processo de digestão adicionando 8 mL de solução neutralizante e transfira as células para um tubo de 15 mL. Misture as células pipetando para cima e para baixo 10-15x. Centrifugue as células a 156 × g durante 5 min.</li>
	<li>Remova o sobrenadante com cuidado, ressuspenda as células com 10 mL de meio de células epiteliais e conte o número de células.</li>
	<li>Adicionar 1 × 106 células em 10 ml de meio de células epiteliais numa placa de 100 mm.</li>
	<li>Atualize o meio celular epitelial e observe as células a cada 2 dias.</li>
</ol>5. Criopreservação celular
<ol><li>Repita as etapas 4.1-4.4.</li>
	<li>Remova o sobrenadante com cuidado e ressuspenda as células em 2 mL de solução de criopreservação celular.</li>
	<li>Transfira 1 mL da solução de criopreservação contendo as células para cada frasco criogênico.</li>
	<li>Registre os nomes das células criopreservadas, os números das passagens e as datas.</li>
	<li>Coloque os frascos para injetáveis em um recipiente de congelamento a -80 °C durante a noite.</li>
	<li>Remova os frascos criogênicos do freezer a -80 ° C e transfira-os rapidamente para nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo.</li>
</ol>

Protocolo para Isolar Células Epiteliais Mamárias de Tecido Humano

<ol>
	<li>Smolarz, B., Nowak, A. Z., Romanowicz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer-epidemiology,+classification,+pathogenesis+and+treatment+(review+of+literature).">Breast cancer-epidemiology, classification, pathogenesis and treatment (review of literature).</a> Cancers (Basel). 14 (10), 2569 (2022).</li><li>Gudjonsson, T., Adriance, M. C., Sternlicht, M. D., Petersen, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myoepithelial+cells:+Their+origin+and+function+in+breast+morphogenesis+and+neoplasia.">Myoepithelial cells: Their origin and function in breast morphogenesis and neoplasia.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10 (3), 261-272 (2005).</li><li>Faridi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+the+primary+epithelial+breast+cancer+cells+and+the+adjacent+normal+epithelial+cells+from+iranian+women's+breast+cancer+tumors.">Isolation and characterization of the primary epithelial breast cancer cells and the adjacent normal epithelial cells from iranian women's breast cancer tumors.</a> Cytotechnology. 70 (2), 625-639 (2018).</li><li>Tovar, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+rat+mammary+gland:+Isolation,+characterization,+and+culture+of+purified+mammary+epithelial+cells+and+fibroblasts.">Dissecting the rat mammary gland: Isolation, characterization, and culture of purified mammary epithelial cells and fibroblasts.</a> Bio Protoc. 10 (22), e3818 (2020).</li><li>Jiang, X., Yang, H., Jing, Q., He, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+&amp;#34;selective+secondary+tissue+attachment&amp;#34;+method+for+isolation+and+purification+of+mammary+epithelial+cells.">A &amp;#34;selective secondary tissue attachment&amp;#34; method for isolation and purification of mammary epithelial cells.</a> Acta Histochem. 124 (8), 151972 (2022).</li><li>Bernardini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+pig+mammary+epithelial+cell+culture+model+as+a+non-clinical+tool+for+studying+epithelial+barrier-a+contribution+from+the+imi-conception+project.">Development of a pig mammary epithelial cell culture model as a non-clinical tool for studying epithelial barrier-a contribution from the imi-conception project.</a> Animals (Basel). 11 (7), 2012 (2021).</li><li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transdifferentiation+of+goat+ear+fibroblasts+into+lactating+mammary+epithelial+cells+induced+by+small+molecule+compounds.">Transdifferentiation of goat ear fibroblasts into lactating mammary epithelial cells induced by small molecule compounds.</a> Biochem Biophys Res Commun. 573, 55-61 (2021).</li><li>Hammond, S. L., Ham, R. G., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+growth+of+human+mammary+epithelial+cells:+Rapid+clonal+growth+in+defined+medium+and+extended+serial+passage+with+pituitary+extract.">Serum-free growth of human mammary epithelial cells: Rapid clonal growth in defined medium and extended serial passage with pituitary extract.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (17), 5435-5439 (1984).</li><li>Zubeldia-Plazaola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+methods+for+the+isolation+of+human+breast+epithelial+and+myoepithelial+cells.">Comparison of methods for the isolation of human breast epithelial and myoepithelial cells.</a> Front Cell Dev Biol. 3, 32 (2015).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+and+efficient+method+to+isolate+primary+human+keratinocytes+from+adult+skin+tissue.">A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue.</a> J Vis Exp. (138), e57784 (2018).</li><li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+human+gingival+epithelial+cells+using+y-27632.">Isolation and culture of primary human gingival epithelial cells using y-27632.</a> J Vis Exp. (177), e62978 (2021).</li><li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+primary+human+mammary+epithelial+cells+isolated+and+propagated+by+conditional+reprogrammed+cell+culture.">Characterization of primary human mammary epithelial cells isolated and propagated by conditional reprogrammed cell culture.</a> Oncotarget. 9 (14), 11503-11514 (2018).</li><li>B&#246;cker, W., Hungermann, D., Decker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+breast.">Anatomy of the breast.</a> Pathologe. 30 (1), 6-12 (2009).</li><li>Kouros-Mehr, H., Slorach, E. M., Sternlicht, M. D., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gata-3+maintains+the+differentiation+of+the+luminal+cell+fate+in+the+mammary+gland.">Gata-3 maintains the differentiation of the luminal cell fate in the mammary gland.</a> Cell. 127 (5), 1041-1055 (2006).</li><li>Wang, X., Reagan, M. R., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+adipose+tissue+models+for+studying+mammary+gland+development+and+breast+tissue+engineering.">Synthetic adipose tissue models for studying mammary gland development and breast tissue engineering.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 15 (3), 365-376 (2010).</li><li>Ethier, S. P., Mahacek, M. L., Gullick, W. J., Frank, T. S., Weber, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+isolation+of+normal+luminal+mammary+epithelial+cells+and+breast+cancer+cells+from+primary+and+metastatic+sites+using+selective+media.">Differential isolation of normal luminal mammary epithelial cells and breast cancer cells from primary and metastatic sites using selective media.</a> Cancer Res. 53 (3), 627-635 (1993).</li><li>Band, V., Sager, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctive+traits+of+normal+and+tumor-derived+human+mammary+epithelial+cells+expressed+in+a+medium+that+supports+long-term+growth+of+both+cell+types.">Distinctive traits of normal and tumor-derived human mammary epithelial cells expressed in a medium that supports long-term growth of both cell types.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (4), 1249-1253 (1989).</li><li>Taylor-Papadimitriou, J., Shearer, M., Tilly, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+properties+of+cells+cultured+from+early-lactation+human+milk.">Some properties of cells cultured from early-lactation human milk.</a> J Natl Cancer Inst. 58 (6), 1563-1571 (1977).</li><li>Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Y-27632+simplifies+the+isolation+procedure+of+human+primary+epidermal+cells+by+selectively+blocking+focal+adhesion+of+dermal+cells.">Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells.</a> J Tissue Eng Regen Med. 12 (2), e1251-e1255 (2018).</li><li>Yin, J., Yu, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+kinases+regulate+corneal+epithelial+wound+healing.">Rho kinases regulate corneal epithelial wound healing.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 295 (2), C378-C387 (2008).</li><li>Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., Mcbride, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+keratinocytes+are+efficiently+immortalized+by+a+rho+kinase+inhibitor.">Human keratinocytes are efficiently immortalized by a rho kinase inhibitor.</a> J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).</li><li>&#346;cie&#380;y&#324;ska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+human+primary+keratinocytes-a+methods+review.">Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review.</a> Exp Dermatol. 28 (2), 107-112 (2019).</li><li>Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispase,+a+neutral+protease+from+bacillus+polymyxa,+is+a+powerful+fibronectinase+and+type+IV+collagenase.">Dispase, a neutral protease from bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase.</a> J Invest Dermatol. 93 (2), 287-290 (1989).</li><li>Ren, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cultures+of+mouse+small+intestinal+epithelial+cells+using+the+dissociating+enzyme+type+I+collagenase+and+hyaluronidase.">Primary cultures of mouse small intestinal epithelial cells using the dissociating enzyme type I collagenase and hyaluronidase.</a> Braz J Med Biol Res. 50 (5), e5831 (2017).</li></ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse em relação à publicação deste artigo.

Os HMECs são vitais na preservação da integridade anatômica e funcional do tecido mamário e são úteis em investigações científicas, implementações clínicas e domínios associados15. As células epiteliais primárias são um tipo de células especializadas que têm passagens limitadas e vida útil mais curta. No entanto, o crescimento dos HMECs tem sido dificultado por restrições técnicas, que consequentemente dificultam os avanços da pesquisa em câncer de mama e outras doenças i...

O câncer de mama é o principal tipo de câncer diagnosticado em mulheres em todo o mundo e é a principal causa de morte por câncer1. A patogênese do câncer de mama é complexa, envolvendo múltiplos fatores, como genética, ambiente e estilo de vida. HMECs, células produtoras de leite ativas, são um dos componentes mais importantes do tecido mamário e provavelmente são as células originais envolvidas na carcinogênese do câncer de mama. Portanto, os HMECs têm recebido mais atenção dos pesquisadores para o estudo do câncer de mama2. Além disso, as células primárias têm a capacidade de fornecer uma caracterização biologicamente relevante de processos celulares complexos devido à retenção de estabilidade genética, morfologia normal e um conjunto mais completo de funções celulares básicas que não podem ser alcançadas com linhagens celulares imortalizadas3. Portanto, o isolamento e a cultura de HMECs primários são uma etapa essencial para o estudo da maioria das doenças relacionadas à mama, como câncer de mama e doenças inflamatórias da mama.
Atualmente, um sistema estável e reprodutível para o isolamento, cultura e identificação de células epiteliais mamárias de ratos, vacas, porcos e cabras foi estabelecido 4,5,6,7. No entanto, o isolamento e a cultura de HMECs primários são desafiadores devido ao microambiente complexo e ao baixo rendimento das células. Durante décadas, os cientistas têm procurado o método mais eficaz para isolar e cultivar HMECs, embora um sistema de cultura para HMECs tenha sido estabelecido há quase 20 anos. Por exemplo, Hammond et al. desenvolveram um meio de cultura sem soro no qual os HMECs cresceram eficientemente8. Recentemente, Zubeldia-Plazaola et al. testaram quatro métodos de isolamento diferentes usando procedimentos de digestão enzimática rápida/lenta combinados com filtração sequencial ou etapas de centrifugação diferencial para obter HMECs9. Eles descobriram que o método de digestão lenta, juntamente com a centrifugação diferencial, é o método mais eficiente para isolar HMECs do tecido mamário fresco. No entanto, esse método de isolamento requer grandes pedaços de tecido (40-75 g) e usa maiores quantidades de enzimas de digestão. Seu procedimento é complicado (pelo menos três centrifugações diferentes para obter diferentes frações celulares), além de demorado. Portanto, ainda é necessário um método simples e rápido para obter eficientemente populações de HMECs a partir de pequenas quantidades de tecido mamário para pesquisa e aplicações clínicas9.
Nossos estudos anteriores mostraram que a adição do inibidor de quinase associada a Rho (ROCK) Y-27632 no meio de cultura inicial pode simplificar o processo de isolamento de células epidérmicas da pele humana10, que também tem sido usado com sucesso para o isolamento de células epiteliais gengivais11. Além disso, pesquisas anteriores conduzidas pelo grupo de Zubeldia-Plazaola e pelo grupo de Jin indicaram que o Y-27632 tem a capacidade de estimular o crescimento in vitro rápido e ilimitado de células epiteliais primárias derivadas do tecido mamário 9,12. O presente estudo teve como objetivo testar se o uso de Y-27632 simplificaria o isolamento e a cultura de HMECs e estabelecemos com sucesso um método simples e de fácil execução para isolar HMECs de pequenos pedaços (1 g) de tecido mamário.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin</td>
			<td>Basalmedia</td>
			<td>K431010</td>
			<td>For HMECs&#160; dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge Tubes</td>
			<td>NEST</td>
			<td>081722CK01</td>
			<td>For cell digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m mesh filter</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>431752</td>
			<td>For HMECs filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Cell Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>solarbio</td>
			<td>P1110-100ml</td>
			<td>For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td>For cell centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>431752</td>
			<td>Cell filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5404HN133048</td>
			<td>Cell centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>42820906</td>
			<td>For cell incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type I</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SKU:SCR103</td>
			<td>For HMECs isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase&#160;</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>CAS:42613-33-2</td>
			<td>For HMECs isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>8122622</td>
			<td>Component of neutralization medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2556132P</td>
			<td>Component of neutralization medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered solution</td>
			<td>Tecono</td>
			<td>20201033</td>
			<td>Washing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti CK7</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab68459</td>
			<td>For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti GATA3</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab199428</td>
			<td>For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>IY0040</td>
			<td>ROCK inhibitor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of primary human mammary epithelial cells

A glândula mamária é uma estrutura fundamental da mama e desempenha um papel essencial na reprodução. As células epiteliais mamárias humanas (HMECs), que são as células de origem do câncer de mama e outras doenças inflamatórias relacionadas à mama, têm atraído atenção considerável. No entanto, isolar e cultivar HMECs primários in vitro para fins de pesquisa tem sido um desafio devido à sua natureza altamente diferenciada e queratinizada e sua curta vida útil. Portanto, desenvolver um método simples e eficiente para isolar e cultivar HMECs é de grande valor científico para o estudo da biologia da mama e doenças relacionadas à mama. Neste estudo, isolamos com sucesso os HMECs primários de pequenas quantidades de tecido mamário por digestão com uma mistura de enzimas combinada com uma cultura inicial em soro fetal bovino-DMEM a 5% contendo o inibidor de quinase associada a Rho (ROCK) Y-27632, seguido de expansão da cultura em meio de queratinócitos sem soro. Essa abordagem promove seletivamente o crescimento de células epiteliais, resultando em um rendimento celular otimizado. A simplicidade e conveniência desse método o tornam adequado para pesquisas laboratoriais e clínicas, que devem fornecer informações valiosas sobre essas importantes áreas de estudo.

Breast cancer is the primary type of cancer diagnosed in women globally and is the primary cause of death from cancer1. The pathogenesis of breast cancer is complex, involving multiple factors such as genetics, environment, and lifestyle. HMECs, active milk-producing cells, are one of the most important components of mammary tissue and likely are the original cells involved in breast cancer carcinogenesis. Therefore, HMECs have received the most attention from researchers for the study of breast cancer2. Furthermore, primary cells have the ability to provide a biologically relevant characterization of complex cellular processes due to their retention of genetic stability, normal morphology, and a more complete set of basic cellular functions that cannot be achieved with immortalized cell lines3. Hence, the isolation and culture of primary HMECs is an essential step for the study of most breast-related diseases such as breast cancer and breast inflammatory diseases.
At present, a stable and reproducible system for the isolation, culture, and identification of mammary epithelial cells from rats, cows, pigs, and goats has been established4,5,6,7. However, the isolation and culture of primary HMECs are challenging due to the complex microenvironment and the low yield of cells. For decades, scientists have been searching for the most effective method to isolate and cultivate HMECs although a culture system for HMECs was established nearly 20 years ago. For example, Hammond et al. developed a serum-free culture medium in which HMECs grew efficiently8. Recently, Zubeldia-Plazaola et al. tested four different isolation methods using fast/slow enzyme digestion procedures combined with sequential filtration or differential centrifugation steps to obtain HMECs9. They found that the slow digestion method together with differential centrifugation is the most efficient method to isolate HMECs from fresh breast tissue. However, that isolation method requires large pieces of tissue (40-75 g) and uses larger amounts of digestion enzymes. Their procedure is complicated (at least three different centrifugations to obtain different cell fractions), as well as time-consuming. Therefore, a simple and quick method is still needed to efficiently obtain populations of HMECs from small amounts of mammary tissue for research and clinical applications9.
Our previous studies showed that adding the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632 into the initial culture medium can simplify the process of isolating human skin epidermal cells10, which has also been successfully used for the isolation of gingival epithelial cells11. Additionally, earlier research conducted by Zubeldia-Plazaola&#39;s group and Jin&#39;s group has indicated that Y-27632 has the ability to stimulate quick and unlimited in vitro growth of primary epithelial cells derived from mammary tissue9,12. The present study aimed to test whether using Y-27632 would simplify the isolation and culture of HMECs and we successfully established a simple and easily performed method to isolate HMECs from small pieces (1 g) of mammary tissue.

Autor em destaque: Integrando a medicina oriental e ocidental para o tratamento da mastite granulomatosa

Isolamento e Cultura de Células Epiteliais Mamárias Humanas Primárias

Our research focus on elucidating the treatment avenues for refractory granulomatous mastitis. Leveraging an integrative approach that combines traditional Chinese and Western medicinal methodologies simultaneously will expose the complex pathogenic mechanisms driving the disease and its complications, with a focus to endeavor to alleviate these issues and improve patient prognostication. Our research reports an easier, time-saving, and the economical protocol for efficiently isolating and growing primary human mammary epithelial cells, or HMECs, from a small amount of mammary tissue.This protocol is suitable for quickly producing primary HMECs for lab and clinical applications. Building upon this study, we aim to develop a granulomatous mastitis mammary epithelial cell model to deepen our understanding of etiology and validated treatment strategies.

A Figura 1 mostra um esquema do procedimento. O protocolo envolve o uso de uma combinação de enzimas, a saber, dispase, colagenase e tripsina. Essa combinação é utilizada com o objetivo de separar a folha epitelial da camada de fibroblastos abaixo dela e, posteriormente, utilizar a tripsina para dissociar as células epiteliais mamárias em uma suspensão. Além disso, o crescimento de células epiteliais foi efetivamente promovido pela adição de Y-27632 ao meio de cultura inicial. Co...

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O presente estudo relata um protocolo mais fácil, que economiza tempo e é econômico para isolar e cultivar com eficiência células epiteliais mamárias humanas primárias (HMECs) a partir de pequenas quantidades de tecido mamário. Este protocolo é adequado para produzir rapidamente HMECs primários, tanto para aplicações laboratoriais quanto clínicas.

The mammary gland is a fundamental structure of the breast and plays an essential role in reproduction. Human mammary epithelial cells (HMECs), which are ...

Nossa pesquisa se concentra em elucidar as vias de tratamento para mastite granulomatosa refratária. Alavancar uma abordagem integrativa que combina metodologias medicinais tradicionais chinesas e ocidentais simultaneamente exporá os complexos mecanismos patogênicos que impulsionam a doença e suas complicações, com foco no esforço para aliviar esses problemas e melhorar o prognóstico do paciente. Nossa pesquisa relata um protocolo mais fácil, econômico e econômico para isolar e cultivar com eficiência células epiteliais mamárias humanas primárias, ou HMECs, de uma pequena quantidade de tecido mamário.Este protocolo é adequado para produzir rapidamente HMECs primários para aplicações laboratoriais e clínicas. Com base neste estudo, pretendemos desenvolver um modelo de células epiteliais mamárias de mastite granulomatosa para aprofundar nossa compreensão da etiologia e estratégias de tratamento validadas.

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Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Primary Human Mammary Epithelial Cells

560 visualizações.  The First Clinical Medical College of Zhejiang Chinese Medical University. Nossa pesquisa se concentra em elucidar as vias de tratamento para mastite granulomatosa refratária. Alavancar uma abordagem integrativa que combina metodologias medicinais tradicionais chinesas e ocidentais simultaneamente exporá os complexos mecanismos patogênicos que impulsionam a doença e suas complicações, com foco no esforço para aliviar esses problemas e melhorar o prognóstico do paciente. Nossa pesquisa relata um protocolo mais fácil, econômico e econômico para isolar e cul...