この研究は、中国浙江省のTCM科学技術プログラム(2017ZA055;2018ZA036)、および中国貴州省遵義市科学技術プロジェクト(遵義市克河支援NS(2020)第18号)からX.Xu.著者らは、細胞培養トレーニングを提供してくれたYoujia(Hangzhou)Biomedical Technology Companyの分子生物学研究所に感謝します。

このプロトコルで使用される新鮮な正常な乳腺組織は、浙江中医科大学の最初の付属病院の医療倫理委員会のガイドラインに従って、浙江中医科大学の最初の付属病院の難治性肉芽腫性小葉性乳房炎の病変の周りの手術から収集されます(プロトコル番号。ChiMCTR2100005281、日付:2017-07-17)。
1. ティッシュの採取
<ol><li>成人女性から採取した手術標本から新鮮な乳腺組織を、10 mL のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) と 3% ペニシリン/ストレプトマイシン (P/S) を含む 滅菌チューブに採取します。 注:乳腺組織は、手術からの収集後24時間以内に、次の詳細に従って取り扱う必要があります。</li>
</ol>2.組織の前処理
<ol><li>2対の鉗子で乳腺組織から脂肪組織を取り出し、残りの乳腺組織の重量が~1gであることを確認します。</li>
	<li>乳房組織を75%エタノール溶液(5 mL)で5秒間すすぎ、次に20 mLの洗浄液(表1)で2 x 5分間洗浄します。.</li>
</ol>3.組織の消化
<ol><li>乳腺組織を小さな断片にスライスし、2つの外科用ブレードを使用して組織を15分間細断して、組織ホモジネートを取得します。組織片を50 mLの遠心分離チューブに移します。</li>
	<li>10 mLの5.0 mg/mLディスパーゼ+5.0 mg/mLコラゲナーゼ溶液、3 mLの0.25%トリプシン、および7 mLのPBSを、乳腺組織断片を含む50 mLの遠心チューブに合計20 mLの消化溶液に加えます。チューブを37°Cのウォーターバスに入れ、1.5時間インキュベートします。チューブを20分ごとに振ってください。</li>
	<li>20mLの中和液を注入して消化プロセスを停止します。~15回ピペッティングして内容物を混合します。</li>
	<li>混合物を100μmメッシュフィルターでろ過します。156 × g で5分間遠心分離します。</li>
	<li>上清を取り除き、20 mLの中和溶液でペレットのインキュベーションを繰り返します。内容物を15倍ピペッティングして混合し、156 × g で5分間遠心分離します。</li>
	<li>上清を慎重に取り除き、細胞ペレットを10 mLの初期培養培地で再懸濁します。細胞懸濁液を100 mmの細胞培養皿に播種します。</li>
	<li>5% CO2 インキュベーターで細胞を37°Cで培養します。 元の培地を3日ごとに新鮮な上皮細胞培地と交換します。細胞を確認し、2日ごとに培地を更新してください。</li>
</ol>4. 細胞継代
<ol><li>細胞が80%〜90%のコンフルエントに達したら、インキュベーターから100 mmディッシュを取り出し、使用済みの培地を廃棄し、2 mLのPBSでディッシュを2回すすいでください。PBSを取り出し、100 mmの各皿に2 mLの0.05%トリプシンを加えます。. 注意: トリプシン溶液が皿の底に十分に接触していることを確認するために、皿を回転させます。</li>
	<li>100 mmディッシュを37°Cのインキュベーターに~7分間入れて、消化プロセスを行います。</li>
	<li>40倍対物レンズを使用して顕微鏡で細胞を検査し、ほとんどの細胞が皿の底から解離していることを確認します。</li>
	<li>8 mLの中和溶液を加えて消化プロセスを停止し、細胞を15 mLチューブに移します。ピペッティングで10〜15倍に動かして細胞を混合します。細胞を156 × g で5分間遠心分離します。</li>
	<li>上清を慎重に取り除き、10mLの上皮細胞培地で細胞を再懸濁し、細胞数を数えます。</li>
	<li>100 mmディッシュ中の10 mLの上皮細胞培地に1 × 106細胞を加え ます。</li>
	<li>上皮細胞培地をリフレッシュし、2日ごとに細胞を観察します。</li>
</ol>5. 細胞凍結保存
<ol><li>手順4.1〜4.4を繰り返します。</li>
	<li>上清を慎重に取り除き、細胞を2 mLの細胞凍結保存溶液に再懸濁します。</li>
	<li>細胞を含む凍結保存溶液1 mLを各極低温バイアルに移します。</li>
	<li>凍結保存された細胞の名前、継代番号、および日付を記録します。</li>
	<li>バイアルを制御速度の凍結容器に-80°Cで一晩置きます。</li>
	<li>-80°Cの冷凍庫から極低温バイアルを取り出し、液体窒素にすばやく移して長期保存します。</li>
</ol>

人間のティッシュからの乳腺の上皮細胞を単離するためのプロトコル

<ol>
	<li>Smolarz, B., Nowak, A. Z., Romanowicz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer-epidemiology,+classification,+pathogenesis+and+treatment+(review+of+literature).">Breast cancer-epidemiology, classification, pathogenesis and treatment (review of literature).</a> Cancers (Basel). 14 (10), 2569 (2022).</li><li>Gudjonsson, T., Adriance, M. C., Sternlicht, M. D., Petersen, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myoepithelial+cells:+Their+origin+and+function+in+breast+morphogenesis+and+neoplasia.">Myoepithelial cells: Their origin and function in breast morphogenesis and neoplasia.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10 (3), 261-272 (2005).</li><li>Faridi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+the+primary+epithelial+breast+cancer+cells+and+the+adjacent+normal+epithelial+cells+from+iranian+women's+breast+cancer+tumors.">Isolation and characterization of the primary epithelial breast cancer cells and the adjacent normal epithelial cells from iranian women's breast cancer tumors.</a> Cytotechnology. 70 (2), 625-639 (2018).</li><li>Tovar, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+rat+mammary+gland:+Isolation,+characterization,+and+culture+of+purified+mammary+epithelial+cells+and+fibroblasts.">Dissecting the rat mammary gland: Isolation, characterization, and culture of purified mammary epithelial cells and fibroblasts.</a> Bio Protoc. 10 (22), e3818 (2020).</li><li>Jiang, X., Yang, H., Jing, Q., He, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+&amp;#34;selective+secondary+tissue+attachment&amp;#34;+method+for+isolation+and+purification+of+mammary+epithelial+cells.">A &amp;#34;selective secondary tissue attachment&amp;#34; method for isolation and purification of mammary epithelial cells.</a> Acta Histochem. 124 (8), 151972 (2022).</li><li>Bernardini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+pig+mammary+epithelial+cell+culture+model+as+a+non-clinical+tool+for+studying+epithelial+barrier-a+contribution+from+the+imi-conception+project.">Development of a pig mammary epithelial cell culture model as a non-clinical tool for studying epithelial barrier-a contribution from the imi-conception project.</a> Animals (Basel). 11 (7), 2012 (2021).</li><li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transdifferentiation+of+goat+ear+fibroblasts+into+lactating+mammary+epithelial+cells+induced+by+small+molecule+compounds.">Transdifferentiation of goat ear fibroblasts into lactating mammary epithelial cells induced by small molecule compounds.</a> Biochem Biophys Res Commun. 573, 55-61 (2021).</li><li>Hammond, S. L., Ham, R. G., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+growth+of+human+mammary+epithelial+cells:+Rapid+clonal+growth+in+defined+medium+and+extended+serial+passage+with+pituitary+extract.">Serum-free growth of human mammary epithelial cells: Rapid clonal growth in defined medium and extended serial passage with pituitary extract.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (17), 5435-5439 (1984).</li><li>Zubeldia-Plazaola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+methods+for+the+isolation+of+human+breast+epithelial+and+myoepithelial+cells.">Comparison of methods for the isolation of human breast epithelial and myoepithelial cells.</a> Front Cell Dev Biol. 3, 32 (2015).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+and+efficient+method+to+isolate+primary+human+keratinocytes+from+adult+skin+tissue.">A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue.</a> J Vis Exp. (138), e57784 (2018).</li><li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+human+gingival+epithelial+cells+using+y-27632.">Isolation and culture of primary human gingival epithelial cells using y-27632.</a> J Vis Exp. (177), e62978 (2021).</li><li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+primary+human+mammary+epithelial+cells+isolated+and+propagated+by+conditional+reprogrammed+cell+culture.">Characterization of primary human mammary epithelial cells isolated and propagated by conditional reprogrammed cell culture.</a> Oncotarget. 9 (14), 11503-11514 (2018).</li><li>B&#246;cker, W., Hungermann, D., Decker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+breast.">Anatomy of the breast.</a> Pathologe. 30 (1), 6-12 (2009).</li><li>Kouros-Mehr, H., Slorach, E. M., Sternlicht, M. D., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gata-3+maintains+the+differentiation+of+the+luminal+cell+fate+in+the+mammary+gland.">Gata-3 maintains the differentiation of the luminal cell fate in the mammary gland.</a> Cell. 127 (5), 1041-1055 (2006).</li><li>Wang, X., Reagan, M. R., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+adipose+tissue+models+for+studying+mammary+gland+development+and+breast+tissue+engineering.">Synthetic adipose tissue models for studying mammary gland development and breast tissue engineering.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 15 (3), 365-376 (2010).</li><li>Ethier, S. P., Mahacek, M. L., Gullick, W. J., Frank, T. S., Weber, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+isolation+of+normal+luminal+mammary+epithelial+cells+and+breast+cancer+cells+from+primary+and+metastatic+sites+using+selective+media.">Differential isolation of normal luminal mammary epithelial cells and breast cancer cells from primary and metastatic sites using selective media.</a> Cancer Res. 53 (3), 627-635 (1993).</li><li>Band, V., Sager, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctive+traits+of+normal+and+tumor-derived+human+mammary+epithelial+cells+expressed+in+a+medium+that+supports+long-term+growth+of+both+cell+types.">Distinctive traits of normal and tumor-derived human mammary epithelial cells expressed in a medium that supports long-term growth of both cell types.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (4), 1249-1253 (1989).</li><li>Taylor-Papadimitriou, J., Shearer, M., Tilly, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+properties+of+cells+cultured+from+early-lactation+human+milk.">Some properties of cells cultured from early-lactation human milk.</a> J Natl Cancer Inst. 58 (6), 1563-1571 (1977).</li><li>Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Y-27632+simplifies+the+isolation+procedure+of+human+primary+epidermal+cells+by+selectively+blocking+focal+adhesion+of+dermal+cells.">Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells.</a> J Tissue Eng Regen Med. 12 (2), e1251-e1255 (2018).</li><li>Yin, J., Yu, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+kinases+regulate+corneal+epithelial+wound+healing.">Rho kinases regulate corneal epithelial wound healing.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 295 (2), C378-C387 (2008).</li><li>Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., Mcbride, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+keratinocytes+are+efficiently+immortalized+by+a+rho+kinase+inhibitor.">Human keratinocytes are efficiently immortalized by a rho kinase inhibitor.</a> J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).</li><li>&#346;cie&#380;y&#324;ska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+human+primary+keratinocytes-a+methods+review.">Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review.</a> Exp Dermatol. 28 (2), 107-112 (2019).</li><li>Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispase,+a+neutral+protease+from+bacillus+polymyxa,+is+a+powerful+fibronectinase+and+type+IV+collagenase.">Dispase, a neutral protease from bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase.</a> J Invest Dermatol. 93 (2), 287-290 (1989).</li><li>Ren, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cultures+of+mouse+small+intestinal+epithelial+cells+using+the+dissociating+enzyme+type+I+collagenase+and+hyaluronidase.">Primary cultures of mouse small intestinal epithelial cells using the dissociating enzyme type I collagenase and hyaluronidase.</a> Braz J Med Biol Res. 50 (5), e5831 (2017).</li></ol>

著者らは、この論文の出版に関して利益相反がないことを宣言します。

HMECは、乳腺組織の解剖学的および機能的完全性を維持するのに不可欠であり、科学的調査、臨床実施、および関連ドメイン15に有用です。初代上皮細胞は、継代が限られ、寿命が短い特殊な細胞の一種です。しかし、HMECの成長は技術的な制約によって妨げられており、その結果、乳がんや乳房に関連する他の炎症性疾患の研究の進歩が妨げられてきました16</su...

乳がんは、世界中の女性に診断される主要ながんの種類であり、がんによる主な死因です1。乳がんの病因は複雑で、遺伝学、環境、生活習慣など複数の要因が関与しています。HMECs(活性乳産生細胞)は、乳腺組織の最も重要な構成要素の1つであり、乳がんの発がんに関与する元の細胞である可能性が高いです。したがって、HMECは乳がんの研究で研究者から最も注目を集めています2。さらに、初代細胞は、遺伝的安定性、正常な形態、および不死化細胞株3では達成できない基本的な細胞機能のより完全なセットの保持により、複雑な細胞プロセスの生物学的に関連性のある特性評価を提供する能力を有する。したがって、初代HMECの単離と培養は、乳がんや乳房炎症性疾患などのほとんどの乳房関連疾患の研究に不可欠なステップです。
現在、ラット、ウシ、ブタ、およびヤギからの乳腺上皮細胞の単離、培養、および同定のための安定で再現性のあるシステムが確立されている4,5,6,7。しかし、初代HMECの単離と培養は、複雑な微小環境と細胞の低収率のために困難です。何十年もの間、科学者たちはHMECを分離して培養するための最も効果的な方法を探してきましたが、HMECの培養システムは20年近く前に確立されました。例えば、Hammondらは、HMECが効率的に増殖する無血清培地を開発した8。最近、Zubeldia-Plazaolaらは、高速/低速酵素消化手順と逐次ろ過または示差遠心分離ステップを組み合わせて4つの異なる分離法を試験し、HMEC9を取得しました。その結果、ゆっくりとした消化法と示差遠心分離が、新鮮な乳房組織からHMECを分離する最も効率的な方法であることを発見しました。ただし、この分離法では、大きな組織片(40〜75 g)が必要であり、大量の消化酵素を使用します。その手順は複雑で(異なる細胞画分を得るために少なくとも3つの異なる遠心分離を行う)、時間がかかる。したがって、研究および臨床応用のために少量の乳腺組織からHMECの集団を効率的に取得するには、簡単で迅速な方法が依然として必要です9。
我々の先行研究は、初期培地にRho関連キナーゼ(ROCK)阻害剤Y−27632を添加すると、ヒト皮膚表皮細胞10の単離プロセスを簡素化できることを示しており、これは歯肉上皮細胞11の単離にも成功裏に使用されている。さらに、Zubeldia-PlazaolaのグループとJinのグループが実施した以前の研究では、Y-27632が乳腺組織に由来する初代上皮細胞の迅速かつ無制限のin vitro増殖を刺激する能力を有することが示されています9,12。本研究は、Y-27632を用いることでHMECの単離と培養が容易になるかどうかを検討することを目的としており、乳組織の小片(1g)からHMECを簡便に分離する方法を確立することに成功しました。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin</td>
			<td>Basalmedia</td>
			<td>K431010</td>
			<td>For HMECs&#160; dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge Tubes</td>
			<td>NEST</td>
			<td>081722CK01</td>
			<td>For cell digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m mesh filter</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>431752</td>
			<td>For HMECs filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Cell Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>solarbio</td>
			<td>P1110-100ml</td>
			<td>For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td>For cell centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>431752</td>
			<td>Cell filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5404HN133048</td>
			<td>Cell centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>42820906</td>
			<td>For cell incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type I</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SKU:SCR103</td>
			<td>For HMECs isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase&#160;</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>CAS:42613-33-2</td>
			<td>For HMECs isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>8122622</td>
			<td>Component of neutralization medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2556132P</td>
			<td>Component of neutralization medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered solution</td>
			<td>Tecono</td>
			<td>20201033</td>
			<td>Washing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti CK7</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab68459</td>
			<td>For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti GATA3</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab199428</td>
			<td>For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>IY0040</td>
			<td>ROCK inhibitor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of primary human mammary epithelial cells

乳腺は乳房の基本的な構造であり、生殖に不可欠な役割を果たしています。乳がんをはじめとする乳房関連炎症性疾患の起源細胞であるヒト乳腺上皮細胞(HMEC)が大きな注目を集めています。しかし、研究目的での初代HMECのin vitro での単離と培養は、その高度に分化し、角質化した性質と短い寿命のために困難でした。したがって、HMECを分離して培養するためのシンプルで効率的な方法を開発することは、乳房生物学および乳房関連疾患の研究にとって大きな科学的価値があります。本研究では、Rho関連キナーゼ(ROCK)阻害剤Y-27632を含む5%ウシ胎児血清DMEMで初期培養を行い、酵素混合物と組み合わせた酵素混合物による消化により、少量の乳腺組織から初代HMECを単離し、続いて無血清ケラチノサイト培地で培養増殖することに成功しました。このアプローチは、上皮細胞の増殖を選択的に促進し、細胞収量を最適化します。この方法のシンプルさと利便性は、実験室研究と臨床研究の両方に適しており、これらの重要な研究分野について貴重な洞察を提供するはずです。

Breast cancer is the primary type of cancer diagnosed in women globally and is the primary cause of death from cancer1. The pathogenesis of breast cancer is complex, involving multiple factors such as genetics, environment, and lifestyle. HMECs, active milk-producing cells, are one of the most important components of mammary tissue and likely are the original cells involved in breast cancer carcinogenesis. Therefore, HMECs have received the most attention from researchers for the study of breast cancer2. Furthermore, primary cells have the ability to provide a biologically relevant characterization of complex cellular processes due to their retention of genetic stability, normal morphology, and a more complete set of basic cellular functions that cannot be achieved with immortalized cell lines3. Hence, the isolation and culture of primary HMECs is an essential step for the study of most breast-related diseases such as breast cancer and breast inflammatory diseases.
At present, a stable and reproducible system for the isolation, culture, and identification of mammary epithelial cells from rats, cows, pigs, and goats has been established4,5,6,7. However, the isolation and culture of primary HMECs are challenging due to the complex microenvironment and the low yield of cells. For decades, scientists have been searching for the most effective method to isolate and cultivate HMECs although a culture system for HMECs was established nearly 20 years ago. For example, Hammond et al. developed a serum-free culture medium in which HMECs grew efficiently8. Recently, Zubeldia-Plazaola et al. tested four different isolation methods using fast/slow enzyme digestion procedures combined with sequential filtration or differential centrifugation steps to obtain HMECs9. They found that the slow digestion method together with differential centrifugation is the most efficient method to isolate HMECs from fresh breast tissue. However, that isolation method requires large pieces of tissue (40-75 g) and uses larger amounts of digestion enzymes. Their procedure is complicated (at least three different centrifugations to obtain different cell fractions), as well as time-consuming. Therefore, a simple and quick method is still needed to efficiently obtain populations of HMECs from small amounts of mammary tissue for research and clinical applications9.
Our previous studies showed that adding the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632 into the initial culture medium can simplify the process of isolating human skin epidermal cells10, which has also been successfully used for the isolation of gingival epithelial cells11. Additionally, earlier research conducted by Zubeldia-Plazaola&#39;s group and Jin&#39;s group has indicated that Y-27632 has the ability to stimulate quick and unlimited in vitro growth of primary epithelial cells derived from mammary tissue9,12. The present study aimed to test whether using Y-27632 would simplify the isolation and culture of HMECs and we successfully established a simple and easily performed method to isolate HMECs from small pieces (1 g) of mammary tissue.

著者スポットライト:肉芽腫性乳房炎の治療のための東洋医学と西洋医学の統合

初代ヒト乳腺上皮細胞の単離と培養

Our research focus on elucidating the treatment avenues for refractory granulomatous mastitis. Leveraging an integrative approach that combines traditional Chinese and Western medicinal methodologies simultaneously will expose the complex pathogenic mechanisms driving the disease and its complications, with a focus to endeavor to alleviate these issues and improve patient prognostication. Our research reports an easier, time-saving, and the economical protocol for efficiently isolating and growing primary human mammary epithelial cells, or HMECs, from a small amount of mammary tissue.This protocol is suitable for quickly producing primary HMECs for lab and clinical applications. Building upon this study, we aim to develop a granulomatous mastitis mammary epithelial cell model to deepen our understanding of etiology and validated treatment strategies.

図 1 に、この手順の概略を示します。このプロトコルには、酵素の組み合わせ、すなわち、ディスパーゼ、コラゲナーゼ、およびトリプシンの使用が含まれます。この組み合わせは、上皮シートをその下の線維芽細胞層から剥離し、続いてトリプシンを利用して乳腺上皮細胞を懸濁液に解離させる目的で利用されます。また、初期培地にY-27632を添加することにより、上...

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本研究は、少量の乳腺組織から初代ヒト乳腺上皮細胞(HMEC)を効率的に分離し、増殖するための、より簡単で時間を節約し、経済的なプロトコルを報告しています。このプロトコールは、実験室および臨床アプリケーションの両方で一次HMECを迅速に製造するのに適しています。

The mammary gland is a fundamental structure of the breast and plays an essential role in reproduction. Human mammary epithelial cells (HMECs), which are ...

私たちの研究は、難治性肉芽腫性乳房炎の治療手段を解明することに焦点を当てています。伝統的な中国と西洋の医療方法論を同時に組み合わせた統合的なアプローチを活用することで、病気とその合併症を引き起こす複雑な病原性メカニズムが明らかになり、これらの問題を軽減し、患者の予後を改善することに焦点を当てます。私たちの研究は、少量の乳腺組織から初代ヒト乳腺上皮細胞(HMEC)を効率的に分離および増殖するための、より簡単で時間を節約し、経済的なプロトコルを報告しています。このプロトコールは、ラボおよび臨床アプリケーション用の一次HMECを迅速に製造するのに適しています。この研究に基づいて、肉芽腫性乳房炎乳腺上皮細胞モデルの開発を目指しており、病因と検証済みの治療戦略についての理解を深めます。

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Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Primary Human Mammary Epithelial Cells

628 ビュー.  The First Clinical Medical College of Zhejiang Chinese Medical University. 私たちの研究は、難治性肉芽腫性乳房炎の治療手段を解明することに焦点を当てています。伝統的な中国と西洋の医療方法論を同時に組み合わせた統合的なアプローチを活用することで、病気とその合併症を引き起こす複雑な病原性メカニズムが明らかになり、これらの問題を軽減し、患者の予後を改善することに焦点を当てます。私たちの研究は、少量の乳腺組織か?...

ビデオ: 著者スポットライト:肉芽腫性乳房炎の治療のための東洋医学と西洋医学の統合

The mammary gland is a fundamental structure of the breast and plays an essential role in reproduction. Human mammary epithelial cells (HMECs), which are the origin cells of breast cancer and other breast-related inflammatory diseases, have garnered considerable attention. However, isolating and culturing primary HMECs in vitro for research purposes has been challenging due to their highly differentiated, keratinized nature and their short lifespan. Therefore, developing a simple and efficient method to isolate and culture HMECs is of great scientific value for the study of breast biology and breast-related diseases. In this study, we successfully isolated primary HMECs from small amounts of mammary tissue by digestion with a mixture of enzymes combined with an initial culture in 5% fetal bovine serum-DMEM containing the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632, followed by culture expansion in serum-free keratinocyte medium. This approach selectively promotes the growth of epithelial cells, resulting in an optimized cell yield. The simplicity and convenience of this method make it suitable for both laboratory and clinical research, which should provide valuable insights into these important areas of study.

The present study reports an easier, time-saving, and economical protocol to efficiently isolate and grow primary human mammary epithelial cells (HMECs) from small amounts of mammary tissue. This protocol is suitable for quickly producing primary HMECs both for laboratory and clinical applications.

生物学

Digestion of Mammary Tissue for Isolating Human Mammary Epithelial Cells

Begin by dissociating the tissue. Use two pairs of forceps to remove the adipose tissue from the mammary tissue. Ensure that the remaining mammary tissue weighs approximately one gram.Rinse the mammary tissue in five milliliters of 75%ethanol solution for five seconds. Then, wash with 20 milliliters of washing solution two times for five minutes each. Then, use two surgical blades to slice the mammary tissue into smaller fragments.Continuously for 15 minutes to obtain a tissue homogenate, transfer the shredded tissue to a 50 milliliter centrifuge tube. Add 10 milliliters of dispase and collagenase solution, three milliliters of 0.25%trypsin, and seven milliliters of PBS for a total of 20 milliliters of digestion solution. Place the tube in a water bath at 37 degrees Celsius and incubate for 1 1/2 hours, shaking the tube every 20 minutes.To stop the digestion process, add 20 milliliters of neutralizing solution. Then, pipette the contents approximately 15 times to ensure thorough mixing. Filter the mixture through a 100 micron mesh filter.After that, centrifuge at 156G for five minutes. Then, remove the supernatant. Repeat incubation of the pellet with 20 milliliters of neutralizing solution, then mix by pipetting.Centrifuge again for five minutes. Carefully remove the supernatant and resuspend the cell pellet with 10 milliliters of initial culture medium. Plate the cell suspension in a 100 millimeter cell culture dish.Cultivate the cells in a 5%carbon dioxide incubator at 37 degrees Celsius. Replace the original culture medium with fresh epithelial cell medium every third day. Check the cells and refresh the medium every two days.Using this protocol, human mammary epithelial cells were isolated from mammary tissue. Post isolation analysis showed that cells treated with ROCK inhibitor Y-27632 exhibited pronounced growth compared to the control group. CCK-8 assay revealed that cells in the medium containing Y-27632 proliferated at a significantly higher rate than those in the control medium.Immunofluorescence assays confirmed that the majority of cells expressed mammary epithelial cell markers, CK7 and GATA3, with negligible presence of other cell types in subsequent passages. Further, qRT-PCR studies showed consistent expression levels of CK7 and GATA3 over several passages indicating consistent phenotype or differentiation capacity.