Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des TCM Science and Technology Program der Provinz Zhejiang, China, unterstützt (2017ZA055; 2018ZA036) und das Wissenschafts- und Technologieprojekt von Zunyi, Provinz Guizhou, China (Zunyi City Kehe Support NS (2020) Nr. 18) an X. Xu. Die Autoren danken dem Molecular Biology Laboratory der Youjia (Hangzhou) Biomedical Technology Company für die Bereitstellung von Zellkulturschulungen.

Frisches normales Brustgewebe, das in diesem Protokoll verwendet wird, wird aus der Operation um die Läsion der refraktären granulomatösen lobulären Mastitis im ersten angeschlossenen Krankenhaus der Zhejiang Chinese Medical University gemäß den Richtlinien des medizinischen Ethikkomitees des ersten angeschlossenen Krankenhauses der Zhejiang Chinese Medical University (Protokoll Nr. ChiMCTR2100005281, Datum: 17.07.2017).
1. Entnahme von Gewebe
<ol><li>Sammeln Sie frisches Brustgewebe aus chirurgischen Proben, die von erwachsenen Frauen entnommen wurden, in sterile Röhrchen mit 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 3 % Penicillin/Streptomycin (P/S). HINWEIS: Brustgewebe sollte innerhalb von 24 Stunden nach der Entnahme aus der Operation gemäß den folgenden Angaben behandelt werden.</li>
</ol>2. Vorbehandlung des Gewebes
<ol><li>Entfernen Sie das Fettgewebe mit zwei Pinzettenpaaren aus dem Brustgewebe und stellen Sie sicher, dass das verbleibende Brustgewebe ~1 g wiegt.</li>
	<li>Spülen Sie das Brustgewebe 5 s lang in einer 75%igen Ethanollösung (5 mL) und waschen Sie es dann 2 x 5 Minuten lang mit 20 mL Waschlösung (Tabelle 1).</li>
</ol>3. Verdauung des Gewebes
<ol><li>Schneiden Sie das Brustgewebe in kleinere Fragmente und zerkleinern Sie das Gewebe mit zwei chirurgischen Klingen für eine Dauer von 15 Minuten, um das Gewebehomogenat zu erhalten. Übertragen Sie die Gewebestücke in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen.</li>
	<li>Fügen Sie 10 ml 5,0 mg/ml Dispase + 5,0 mg/ml Kollagenaselösung, 3 ml 0,25% Trypsin und 7 ml PBS zu insgesamt 20 ml Aufschlusslösung in einem 50 ml-Zentrifugenröhrchen hinzu, das die Brustgewebefragmente enthält. Stellen Sie das Röhrchen in ein Wasserbad bei 37 °C und inkubieren Sie es 1,5 h lang; Schütteln Sie die Tube alle 20 min.</li>
	<li>Stoppen Sie den Verdauungsprozess, indem Sie 20 ml der Neutralisationslösung injizieren. Mischen Sie den Inhalt durch Pipettieren ~15x.</li>
	<li>Filtrieren Sie das Gemisch durch einen 100 μm Maschenfilter. Bei 156 × g 5 min zentrifugieren.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand und wiederholen Sie die Inkubation des Pellets mit 20 ml Neutralisationslösung. Mischen Sie den Inhalt durch 15-faches Pipettieren und zentrifugieren Sie ihn 5 Minuten lang bei 156 × g .</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet mit 10 mL Anfangskulturmedium. Plattieren Sie die Zellsuspension in einer 100-mm-Zellkulturschale.</li>
	<li>Kultivieren Sie die Zellen in einem 5% CO2 -Inkubator bei 37 °C. Ersetzen Sie das ursprüngliche Kulturmedium jeden dritten Tag durch frisches Epithelzellmedium. Überprüfen Sie die Zellen und erneuern Sie das Medium alle 2 Tage.</li>
</ol>4. Zell-Passaging
<ol><li>Nehmen Sie die 100-mm-Schale aus dem Inkubator, wenn die Zellen eine Konfluenz von 80 % bis 90 % erreichen, entsorgen Sie das verwendete Medium und spülen Sie die Schale 2x mit 2 ml PBS aus. Entfernen Sie PBS und geben Sie dann 2 ml 0,05% Trypsin in jede 100-mm-Schale. HINWEIS: Schwenken Sie die Schale, um sicherzustellen, dass die Trypsinlösung ausreichend Kontakt mit dem Boden der Schale hat.</li>
	<li>Stellen Sie die 100-mm-Schale für ~7 min in einen 37 °C Inkubator für den Aufschluss.</li>
	<li>Untersuchen Sie die Zellen mit einem Mikroskop und einem 40-fach-Objektiv, um sicherzustellen, dass die meisten Zellen vom Boden der Schale dissoziiert wurden.</li>
	<li>Stoppen Sie den Verdauungsprozess, indem Sie 8 mL Neutralisationslösung hinzufügen und die Zellen in ein 15 mL Röhrchen überführen. Mischen Sie die Zellen, indem Sie 10-15x auf und ab pipettieren. Die Zellen bei 156 × g 5 min zentrifugieren.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, resuspendieren Sie die Zellen mit 10 ml Epithelzellmedium und zählen Sie die Anzahl der Zellen.</li>
	<li>1 × 106 Zellen in 10 ml Epithelzellmedium in eine 100-mm-Schale geben.</li>
	<li>Frischen Sie das Epithelzellmedium auf und beobachten Sie die Zellen alle 2 Tage.</li>
</ol>5. Kryokonservierung von Zellen
<ol><li>Wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.4.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 2 ml Kryokonservierungslösung.</li>
	<li>Übertragen Sie 1 ml der Kryokonservierungslösung, die die Zellen enthält, in jedes kryogene Fläschchen.</li>
	<li>Notieren Sie die Namen der kryokonservierten Zellen, die Durchgangsnummern und die Daten.</li>
	<li>Stellen Sie die Fläschchen über Nacht in einen Gefrierbehälter mit kontrollierter Geschwindigkeit bei -80 °C.</li>
	<li>Nehmen Sie die kryogenen Fläschchen aus dem -80 °C-Gefrierschrank und überführen Sie sie schnell in flüssigen Stickstoff für die Langzeitlagerung.</li>
</ol>

Protokoll zur Isolierung von Brustepithelzellen aus menschlichem Gewebe

<ol>
	<li>Smolarz, B., Nowak, A. Z., Romanowicz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer-epidemiology,+classification,+pathogenesis+and+treatment+(review+of+literature).">Breast cancer-epidemiology, classification, pathogenesis and treatment (review of literature).</a> Cancers (Basel). 14 (10), 2569 (2022).</li><li>Gudjonsson, T., Adriance, M. C., Sternlicht, M. D., Petersen, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myoepithelial+cells:+Their+origin+and+function+in+breast+morphogenesis+and+neoplasia.">Myoepithelial cells: Their origin and function in breast morphogenesis and neoplasia.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10 (3), 261-272 (2005).</li><li>Faridi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+the+primary+epithelial+breast+cancer+cells+and+the+adjacent+normal+epithelial+cells+from+iranian+women's+breast+cancer+tumors.">Isolation and characterization of the primary epithelial breast cancer cells and the adjacent normal epithelial cells from iranian women's breast cancer tumors.</a> Cytotechnology. 70 (2), 625-639 (2018).</li><li>Tovar, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+rat+mammary+gland:+Isolation,+characterization,+and+culture+of+purified+mammary+epithelial+cells+and+fibroblasts.">Dissecting the rat mammary gland: Isolation, characterization, and culture of purified mammary epithelial cells and fibroblasts.</a> Bio Protoc. 10 (22), e3818 (2020).</li><li>Jiang, X., Yang, H., Jing, Q., He, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+&amp;#34;selective+secondary+tissue+attachment&amp;#34;+method+for+isolation+and+purification+of+mammary+epithelial+cells.">A &amp;#34;selective secondary tissue attachment&amp;#34; method for isolation and purification of mammary epithelial cells.</a> Acta Histochem. 124 (8), 151972 (2022).</li><li>Bernardini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+pig+mammary+epithelial+cell+culture+model+as+a+non-clinical+tool+for+studying+epithelial+barrier-a+contribution+from+the+imi-conception+project.">Development of a pig mammary epithelial cell culture model as a non-clinical tool for studying epithelial barrier-a contribution from the imi-conception project.</a> Animals (Basel). 11 (7), 2012 (2021).</li><li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transdifferentiation+of+goat+ear+fibroblasts+into+lactating+mammary+epithelial+cells+induced+by+small+molecule+compounds.">Transdifferentiation of goat ear fibroblasts into lactating mammary epithelial cells induced by small molecule compounds.</a> Biochem Biophys Res Commun. 573, 55-61 (2021).</li><li>Hammond, S. L., Ham, R. G., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+growth+of+human+mammary+epithelial+cells:+Rapid+clonal+growth+in+defined+medium+and+extended+serial+passage+with+pituitary+extract.">Serum-free growth of human mammary epithelial cells: Rapid clonal growth in defined medium and extended serial passage with pituitary extract.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (17), 5435-5439 (1984).</li><li>Zubeldia-Plazaola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+methods+for+the+isolation+of+human+breast+epithelial+and+myoepithelial+cells.">Comparison of methods for the isolation of human breast epithelial and myoepithelial cells.</a> Front Cell Dev Biol. 3, 32 (2015).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+and+efficient+method+to+isolate+primary+human+keratinocytes+from+adult+skin+tissue.">A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue.</a> J Vis Exp. (138), e57784 (2018).</li><li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+human+gingival+epithelial+cells+using+y-27632.">Isolation and culture of primary human gingival epithelial cells using y-27632.</a> J Vis Exp. (177), e62978 (2021).</li><li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+primary+human+mammary+epithelial+cells+isolated+and+propagated+by+conditional+reprogrammed+cell+culture.">Characterization of primary human mammary epithelial cells isolated and propagated by conditional reprogrammed cell culture.</a> Oncotarget. 9 (14), 11503-11514 (2018).</li><li>B&#246;cker, W., Hungermann, D., Decker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+breast.">Anatomy of the breast.</a> Pathologe. 30 (1), 6-12 (2009).</li><li>Kouros-Mehr, H., Slorach, E. M., Sternlicht, M. D., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gata-3+maintains+the+differentiation+of+the+luminal+cell+fate+in+the+mammary+gland.">Gata-3 maintains the differentiation of the luminal cell fate in the mammary gland.</a> Cell. 127 (5), 1041-1055 (2006).</li><li>Wang, X., Reagan, M. R., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+adipose+tissue+models+for+studying+mammary+gland+development+and+breast+tissue+engineering.">Synthetic adipose tissue models for studying mammary gland development and breast tissue engineering.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 15 (3), 365-376 (2010).</li><li>Ethier, S. P., Mahacek, M. L., Gullick, W. J., Frank, T. S., Weber, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+isolation+of+normal+luminal+mammary+epithelial+cells+and+breast+cancer+cells+from+primary+and+metastatic+sites+using+selective+media.">Differential isolation of normal luminal mammary epithelial cells and breast cancer cells from primary and metastatic sites using selective media.</a> Cancer Res. 53 (3), 627-635 (1993).</li><li>Band, V., Sager, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctive+traits+of+normal+and+tumor-derived+human+mammary+epithelial+cells+expressed+in+a+medium+that+supports+long-term+growth+of+both+cell+types.">Distinctive traits of normal and tumor-derived human mammary epithelial cells expressed in a medium that supports long-term growth of both cell types.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (4), 1249-1253 (1989).</li><li>Taylor-Papadimitriou, J., Shearer, M., Tilly, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+properties+of+cells+cultured+from+early-lactation+human+milk.">Some properties of cells cultured from early-lactation human milk.</a> J Natl Cancer Inst. 58 (6), 1563-1571 (1977).</li><li>Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Y-27632+simplifies+the+isolation+procedure+of+human+primary+epidermal+cells+by+selectively+blocking+focal+adhesion+of+dermal+cells.">Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells.</a> J Tissue Eng Regen Med. 12 (2), e1251-e1255 (2018).</li><li>Yin, J., Yu, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+kinases+regulate+corneal+epithelial+wound+healing.">Rho kinases regulate corneal epithelial wound healing.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 295 (2), C378-C387 (2008).</li><li>Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., Mcbride, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+keratinocytes+are+efficiently+immortalized+by+a+rho+kinase+inhibitor.">Human keratinocytes are efficiently immortalized by a rho kinase inhibitor.</a> J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).</li><li>&#346;cie&#380;y&#324;ska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+human+primary+keratinocytes-a+methods+review.">Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review.</a> Exp Dermatol. 28 (2), 107-112 (2019).</li><li>Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispase,+a+neutral+protease+from+bacillus+polymyxa,+is+a+powerful+fibronectinase+and+type+IV+collagenase.">Dispase, a neutral protease from bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase.</a> J Invest Dermatol. 93 (2), 287-290 (1989).</li><li>Ren, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cultures+of+mouse+small+intestinal+epithelial+cells+using+the+dissociating+enzyme+type+I+collagenase+and+hyaluronidase.">Primary cultures of mouse small intestinal epithelial cells using the dissociating enzyme type I collagenase and hyaluronidase.</a> Braz J Med Biol Res. 50 (5), e5831 (2017).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass es keine Interessenkonflikte bezüglich der Veröffentlichung dieser Arbeit gibt.

HMECs sind für die Erhaltung der anatomischen und funktionellen Integrität von Brustgewebe von entscheidender Bedeutung und sie sind nützlich in wissenschaftlichen Untersuchungen, klinischen Implementierungen und verwandten Bereichen15. Primäre Epithelzellen sind eine Art spezialisierter Zellen mit begrenzten Passagen und kürzerer Lebensdauer. Das Wachstum von HMECs wurde jedoch durch technische Einschränkungen behindert, die folglich die Fortschritte in der Forschung bei Brustkrebs und ande...

Brustkrebs ist die häufigste Krebsart, die bei Frauen weltweit diagnostiziert wird, und die häufigste Todesursache durch Krebs1. Die Pathogenese von Brustkrebs ist komplex und umfasst mehrere Faktoren wie Genetik, Umwelt und Lebensstil. HMECs, aktive milchproduzierende Zellen, sind einer der wichtigsten Bestandteile des Brustgewebes und wahrscheinlich die ursprünglichen Zellen, die an der Krebsentstehung von Brustkrebs beteiligt sind. Daher haben HMECs von Forschern die meiste Aufmerksamkeit für die Erforschung von Brustkrebserhalten 2. Darüber hinaus haben Primärzellen die Fähigkeit, eine biologisch relevante Charakterisierung komplexer zellulärer Prozesse zu liefern, da sie ihre genetische Stabilität, ihre normale Morphologie und einen vollständigeren Satz grundlegender zellulärer Funktionen beibehalten, die mit immortalisierten Zelllinien nicht erreicht werden können3. Daher ist die Isolierung und Kultur von primären HMECs ein wesentlicher Schritt für die Erforschung der meisten Brusterkrankungen wie Brustkrebs und entzündliche Brusterkrankungen.
Gegenwärtig wurde ein stabiles und reproduzierbares System für die Isolierung, Kultivierung und Identifizierung von Brustepithelzellen von Ratten, Kühen, Schweinen und Ziegen etabliert 4,5,6,7. Die Isolierung und Kultivierung von primären HMECs stellt jedoch aufgrund der komplexen Mikroumgebung und der geringen Ausbeute der Zellen eine Herausforderung dar. Seit Jahrzehnten suchen Wissenschaftler nach der effektivsten Methode, um HMECs zu isolieren und zu kultivieren, obwohl bereits vor fast 20 Jahren ein Kultursystem für HMECs etabliert wurde. Zum Beispiel entwickelten Hammond et al. ein serumfreies Kulturmedium, in dem HMECs effizient wuchsen8. Kürzlich testeten Zubeldia-Plazaola et al. vier verschiedene Isolationsmethoden mit schnellen/langsamen Enzymaufschlussverfahren in Kombination mit sequentieller Filtration oder differentiellen Zentrifugationsschritten, um HMECszu erhalten 9. Sie fanden heraus, dass die Methode der langsamen Verdauung zusammen mit der differentiellen Zentrifugation die effizienteste Methode ist, um HMECs aus frischem Brustgewebe zu isolieren. Diese Isolierungsmethode erfordert jedoch große Gewebestücke (40-75 g) und verwendet größere Mengen an Verdauungsenzymen. Ihr Verfahren ist kompliziert (mindestens drei verschiedene Zentrifugen, um unterschiedliche Zellfraktionen zu erhalten) und zeitaufwändig. Daher ist nach wie vor eine einfache und schnelle Methode erforderlich, um Populationen von HMECs aus kleinen Mengen von Brustgewebe für Forschung und klinische Anwendungen effizient zu gewinnen9.
Unsere früheren Studien zeigten, dass die Zugabe des Rho-assoziierten Kinase (ROCK)-Inhibitors Y-27632 zum ursprünglichen Kulturmedium den Prozess der Isolierung menschlicher Hautepidermiszellen vereinfachen kann10, der auch erfolgreich für die Isolierung von gingivalen Epithelzellen eingesetzt wurde11. Darüber hinaus haben frühere Forschungen, die von der Gruppe von Zubeldia-Plazaola und Jin durchgeführt wurden, gezeigt, dass Y-27632 die Fähigkeit hat, ein schnelles und unbegrenztes In-vitro-Wachstum von primären Epithelzellen aus Brustgewebe zu stimulieren 9,12. In der vorliegenden Studie sollte getestet werden, ob die Verwendung von Y-27632 die Isolierung und Kultivierung von HMECs vereinfachen würde, und wir haben erfolgreich eine einfache und leicht durchzuführende Methode zur Isolierung von HMECs aus kleinen Stücken (1 g) Brustgewebe etabliert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin</td>
			<td>Basalmedia</td>
			<td>K431010</td>
			<td>For HMECs&#160; dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge Tubes</td>
			<td>NEST</td>
			<td>081722CK01</td>
			<td>For cell digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m mesh filter</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>431752</td>
			<td>For HMECs filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Cell Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>solarbio</td>
			<td>P1110-100ml</td>
			<td>For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td>For cell centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>431752</td>
			<td>Cell filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5404HN133048</td>
			<td>Cell centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>42820906</td>
			<td>For cell incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type I</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SKU:SCR103</td>
			<td>For HMECs isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase&#160;</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>CAS:42613-33-2</td>
			<td>For HMECs isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>8122622</td>
			<td>Component of neutralization medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2556132P</td>
			<td>Component of neutralization medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered solution</td>
			<td>Tecono</td>
			<td>20201033</td>
			<td>Washing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti CK7</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab68459</td>
			<td>For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti GATA3</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab199428</td>
			<td>For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>IY0040</td>
			<td>ROCK inhibitor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of primary human mammary epithelial cells

Die Brustdrüse ist eine grundlegende Struktur der Brust und spielt eine wesentliche Rolle bei der Fortpflanzung. Menschliche Brustepithelzellen (HMECs), die Ursprungszellen von Brustkrebs und anderen entzündlichen Erkrankungen der Brust, haben große Aufmerksamkeit erregt. Die Isolierung und Kultivierung von primären HMECs in vitro zu Forschungszwecken war jedoch aufgrund ihrer hochdifferenzierten, keratinisierten Natur und ihrer kurzen Lebensdauer eine Herausforderung. Daher ist die Entwicklung einer einfachen und effizienten Methode zur Isolierung und Kultivierung von HMECs von großem wissenschaftlichem Wert für die Erforschung der Brustbiologie und brustbedingter Krankheiten. In dieser Studie isolierten wir erfolgreich primäre HMECs aus kleinen Mengen von Brustgewebe durch Verdauung mit einer Mischung von Enzymen in Kombination mit einer Anfangskultur in 5% fötalem Rinderserum-DMEM, das den Rho-assoziierten Kinase (ROCK)-Inhibitor Y-27632 enthielt, gefolgt von einer Kulturexpansion in serumfreiem Keratinozytenmedium. Dieser Ansatz fördert selektiv das Wachstum von Epithelzellen, was zu einer optimierten Zellausbeute führt. Die Einfachheit und Bequemlichkeit dieser Methode machen sie sowohl für die Labor- als auch für die klinische Forschung geeignet, was wertvolle Einblicke in diese wichtigen Studienbereiche liefern sollte.

Breast cancer is the primary type of cancer diagnosed in women globally and is the primary cause of death from cancer1. The pathogenesis of breast cancer is complex, involving multiple factors such as genetics, environment, and lifestyle. HMECs, active milk-producing cells, are one of the most important components of mammary tissue and likely are the original cells involved in breast cancer carcinogenesis. Therefore, HMECs have received the most attention from researchers for the study of breast cancer2. Furthermore, primary cells have the ability to provide a biologically relevant characterization of complex cellular processes due to their retention of genetic stability, normal morphology, and a more complete set of basic cellular functions that cannot be achieved with immortalized cell lines3. Hence, the isolation and culture of primary HMECs is an essential step for the study of most breast-related diseases such as breast cancer and breast inflammatory diseases.
At present, a stable and reproducible system for the isolation, culture, and identification of mammary epithelial cells from rats, cows, pigs, and goats has been established4,5,6,7. However, the isolation and culture of primary HMECs are challenging due to the complex microenvironment and the low yield of cells. For decades, scientists have been searching for the most effective method to isolate and cultivate HMECs although a culture system for HMECs was established nearly 20 years ago. For example, Hammond et al. developed a serum-free culture medium in which HMECs grew efficiently8. Recently, Zubeldia-Plazaola et al. tested four different isolation methods using fast/slow enzyme digestion procedures combined with sequential filtration or differential centrifugation steps to obtain HMECs9. They found that the slow digestion method together with differential centrifugation is the most efficient method to isolate HMECs from fresh breast tissue. However, that isolation method requires large pieces of tissue (40-75 g) and uses larger amounts of digestion enzymes. Their procedure is complicated (at least three different centrifugations to obtain different cell fractions), as well as time-consuming. Therefore, a simple and quick method is still needed to efficiently obtain populations of HMECs from small amounts of mammary tissue for research and clinical applications9.
Our previous studies showed that adding the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632 into the initial culture medium can simplify the process of isolating human skin epidermal cells10, which has also been successfully used for the isolation of gingival epithelial cells11. Additionally, earlier research conducted by Zubeldia-Plazaola&#39;s group and Jin&#39;s group has indicated that Y-27632 has the ability to stimulate quick and unlimited in vitro growth of primary epithelial cells derived from mammary tissue9,12. The present study aimed to test whether using Y-27632 would simplify the isolation and culture of HMECs and we successfully established a simple and easily performed method to isolate HMECs from small pieces (1 g) of mammary tissue.

Autor im Rampenlicht: Integration östlicher und westlicher Medizin zur Behandlung von granulomatöser Mastitis

Isolierung und Kultivierung primärer humaner Brustepithelzellen

Our research focus on elucidating the treatment avenues for refractory granulomatous mastitis. Leveraging an integrative approach that combines traditional Chinese and Western medicinal methodologies simultaneously will expose the complex pathogenic mechanisms driving the disease and its complications, with a focus to endeavor to alleviate these issues and improve patient prognostication. Our research reports an easier, time-saving, and the economical protocol for efficiently isolating and growing primary human mammary epithelial cells, or HMECs, from a small amount of mammary tissue.This protocol is suitable for quickly producing primary HMECs for lab and clinical applications. Building upon this study, we aim to develop a granulomatous mastitis mammary epithelial cell model to deepen our understanding of etiology and validated treatment strategies.

Abbildung 1 zeigt ein Schema des Vorgehens. Das Protokoll beinhaltet die Verwendung einer Kombination von Enzymen, nämlich Dispase, Kollagenase und Trypsin. Diese Kombination wird zu dem Zweck verwendet, die Epithelschicht von der darunter liegenden Fibroblastenschicht abzulösen und anschließend Trypsin zu verwenden, um die Brustepithelzellen in eine Suspension zu dissoziieren. Darüber hinaus wurde das Wachstum von Epithelzellen durch Zugabe von Y-27632 zum ursprünglichen Kulturmedium e...

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Die vorliegende Studie berichtet über ein einfacheres, zeitsparendes und wirtschaftliches Protokoll zur effizienten Isolierung und Züchtung von primären humanen Brustepithelzellen (HMECs) aus kleinen Mengen von Brustgewebe. Dieses Protokoll eignet sich für die schnelle Herstellung von primären HMECs sowohl für Labor- als auch für klinische Anwendungen.

The mammary gland is a fundamental structure of the breast and plays an essential role in reproduction. Human mammary epithelial cells (HMECs), which are ...

Unser Forschungsschwerpunkt liegt auf der Aufklärung der Behandlungsmöglichkeiten der refraktären granulomatösen Mastitis. Die Nutzung eines integrativen Ansatzes, der traditionelle chinesische und westliche medizinische Methoden gleichzeitig kombiniert, wird die komplexen pathogenen Mechanismen aufdecken, die die Krankheit und ihre Komplikationen antreiben, mit dem Ziel, diese Probleme zu lindern und die Prognose der Patienten zu verbessern. Unsere Forschung berichtet von einem einfacheren, zeitsparenden und wirtschaftlichen Protokoll für die effiziente Isolierung und Züchtung von primären humanen Brustepithelzellen (HMECs) aus einer kleinen Menge Brustgewebe.Dieses Protokoll eignet sich für die schnelle Herstellung von primären HMECs für Labor- und klinische Anwendungen. Aufbauend auf dieser Studie wollen wir ein Modell für Brustepithelzellen bei granulomatöser Mastitis entwickeln, um unser Verständnis der Ätiologie und validierter Behandlungsstrategien zu vertiefen.

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Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Primary Human Mammary Epithelial Cells

610 Aufrufe.  The First Clinical Medical College of Zhejiang Chinese Medical University. Unser Forschungsschwerpunkt liegt auf der Aufklärung der Behandlungsmöglichkeiten der refraktären granulomatösen Mastitis. Die Nutzung eines integrativen Ansatzes, der traditionelle chinesische und westliche medizinische Methoden gleichzeitig kombiniert, wird die komplexen pathogenen Mechanismen aufdecken, die die Krankheit und ihre Komplikationen antreiben, mit dem Ziel, diese Probleme zu lindern und die Prognose der Patienten zu verbessern. Unsere Forschung berichtet von einem einfacher...

Serie: Autor im Rampenlicht: Integration östlicher und westlicher Medizin zur Behandlung von granulomatöser Mastitis

The mammary gland is a fundamental structure of the breast and plays an essential role in reproduction. Human mammary epithelial cells (HMECs), which are the origin cells of breast cancer and other breast-related inflammatory diseases, have garnered considerable attention. However, isolating and culturing primary HMECs in vitro for research purposes has been challenging due to their highly differentiated, keratinized nature and their short lifespan. Therefore, developing a simple and efficient method to isolate and culture HMECs is of great scientific value for the study of breast biology and breast-related diseases. In this study, we successfully isolated primary HMECs from small amounts of mammary tissue by digestion with a mixture of enzymes combined with an initial culture in 5% fetal bovine serum-DMEM containing the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632, followed by culture expansion in serum-free keratinocyte medium. This approach selectively promotes the growth of epithelial cells, resulting in an optimized cell yield. The simplicity and convenience of this method make it suitable for both laboratory and clinical research, which should provide valuable insights into these important areas of study.

The present study reports an easier, time-saving, and economical protocol to efficiently isolate and grow primary human mammary epithelial cells (HMECs) from small amounts of mammary tissue. This protocol is suitable for quickly producing primary HMECs both for laboratory and clinical applications.

Forschung

Biologie

Digestion of Mammary Tissue for Isolating Human Mammary Epithelial Cells

Begin by dissociating the tissue. Use two pairs of forceps to remove the adipose tissue from the mammary tissue. Ensure that the remaining mammary tissue weighs approximately one gram.Rinse the mammary tissue in five milliliters of 75%ethanol solution for five seconds. Then, wash with 20 milliliters of washing solution two times for five minutes each. Then, use two surgical blades to slice the mammary tissue into smaller fragments.Continuously for 15 minutes to obtain a tissue homogenate, transfer the shredded tissue to a 50 milliliter centrifuge tube. Add 10 milliliters of dispase and collagenase solution, three milliliters of 0.25%trypsin, and seven milliliters of PBS for a total of 20 milliliters of digestion solution. Place the tube in a water bath at 37 degrees Celsius and incubate for 1 1/2 hours, shaking the tube every 20 minutes.To stop the digestion process, add 20 milliliters of neutralizing solution. Then, pipette the contents approximately 15 times to ensure thorough mixing. Filter the mixture through a 100 micron mesh filter.After that, centrifuge at 156G for five minutes. Then, remove the supernatant. Repeat incubation of the pellet with 20 milliliters of neutralizing solution, then mix by pipetting.Centrifuge again for five minutes. Carefully remove the supernatant and resuspend the cell pellet with 10 milliliters of initial culture medium. Plate the cell suspension in a 100 millimeter cell culture dish.Cultivate the cells in a 5%carbon dioxide incubator at 37 degrees Celsius. Replace the original culture medium with fresh epithelial cell medium every third day. Check the cells and refresh the medium every two days.Using this protocol, human mammary epithelial cells were isolated from mammary tissue. Post isolation analysis showed that cells treated with ROCK inhibitor Y-27632 exhibited pronounced growth compared to the control group. CCK-8 assay revealed that cells in the medium containing Y-27632 proliferated at a significantly higher rate than those in the control medium.Immunofluorescence assays confirmed that the majority of cells expressed mammary epithelial cell markers, CK7 and GATA3, with negligible presence of other cell types in subsequent passages. Further, qRT-PCR studies showed consistent expression levels of CK7 and GATA3 over several passages indicating consistent phenotype or differentiation capacity.