Para comenzar, transfiera los ovarios extirpados de un pez cebra a una placa de seis pocillos que contenga dos mililitros de solución de disociación celular. Incubar los ovarios a 28,5 grados centígrados durante dos o tres horas. Agregue de dos a tres mililitros de medio L15 precalentado al tampón para detener la digestión.
A continuación, coloque un colador de células de 70 micrómetros en otro pocillo de la placa de seis pocillos. Agregue medio L15 al pozo, asegurándose de que el nivel medio sea más alto que el colador. Ahora, use una pipeta para extraer el medio digestivo a través del colador de células.
Retire el exceso de medio con una pipeta. Agregue cuatro mililitros de medio L15 fresco en el pocillo y vuelva a suspender suavemente los ovocitos. Después de un par de minutos, pipetee el sobrenadante.
Para seleccionar los ovocitos para el control de calidad, transfiéralos a un plato de 35 milímetros de ancho que contenga medio L15 fresco. Observe los ovocitos bajo un microscopio óptico con un aumento de 10X o más. Use una herramienta de inyección roma para extraer cualquier fragmento de célula, ovocitos en etapa uno o cualquier otro ovocito en etapa.
Para confirmar la etapa de crecimiento, añada Hoechst 33342 al medio L15 que contiene los ovocitos e incube. Observar los ovocitos con un microscopio de fluorescencia bajo excitación láser UV. Escoja cuidadosamente los ovocitos que no cumplan con los criterios deseados con una aguja.
El ovario juvenil mostró una abundancia de ovocitos transparentes en estadio uno acompañados de una población más pequeña de ovocitos en estadio dos. Los ovarios de peces adultos mostraron un predominio de ovocitos opacos en etapa tardía de dos a tres vocitos. El método de referencia dio como resultado numerosos núcleos de células de la granulosa teñidos en la superficie de los ovocitos que envuelven densamente los ovocitos.
Por el contrario, el método modificado permitió la separación de ovocitos en estadio uno desprovistos de tinción de núcleos de células de la granulosa.
