Para comenzar, coloque el cultivo celular Sf1Ep tripsinizado y una placa de 6 pocillos en una plataforma de trabajo. Agregue el número apropiado de celdas Sf1Ep y medio Sf1Ep a cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Incubar las placas a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante la noche.
Combine los componentes de TpCM-2 en un recipiente estéril, agregando ditiotreitol como un polvo seco al final. Mezcle y filtre suavemente el medio con una unidad de filtro de 0,22 micrómetros. Preequilibre el medio en un frasco anaeróbico, evacúe la cámara usando una aspiradora doméstica y vuelva a llenar con una mezcla de 95% de nitrógeno y 5% de dióxido de carbono tres veces.
A continuación, rellene con 1,5% de oxígeno, 5% de dióxido de carbono y equilibre la mezcla de nitrógeno gaseoso. Transfiera rápidamente el medio a una incubadora de tres gases, configurada a 34 grados centígrados e incube durante la noche. Después de la incubación durante la noche, retire el medio del cultivo de Sf1Ep y enjuague las células con un pequeño volumen de TpCM-2 preequilibrado.
Después de retirar el enjuague, agregue una cantidad adecuada de TpCM-2 y equilibre la placa en 1,5% de oxígeno, 5% de dióxido de carbono y equilibre la atmósfera de nitrógeno a 34 grados centígrados durante tres o cuatro horas. Retire el cultivo existente de T. pallidum de la incubadora de bajo oxígeno y examine la capa de células Sf1Ep en cada pocillo. Después de registrar la densidad y el aspecto de las células, pipetee el medio de cada pocillo en un tubo cónico estéril de 15 mililitros.
Enjuague cada pocillo con 0,35 mililitros de tripsina-EDTA precalentado y agregue el enjuague al tubo de 15 mililitros. Agregue otros 0,35 mililitros de tripsina-EDTA a cada pocillo e incube durante cinco minutos a 37 grados Celsius para eliminar las células Sf1Ep de la placa y T.pallidum de la célula Sf1Ep. Después del desprendimiento, combine las células disociadas de T. pallidum y Sf1Ep con el medio de reserva recolectado en el tubo cónico de 15 mililitros y registre el volumen total recuperado para el cálculo del rendimiento por cultivo.
Inocular la placa previamente preparada de células Sf1Ep con un volumen determinado de T. pallidum cosechado. Después de intercambiar la atmósfera en la placa, incube a 34 grados centígrados dentro del frasco de cerveza o en una incubadora de tres gases. Después de la inoculación, utilice una cámara de recuento auxiliar para enumerar T. pallidum bajo microscopía de campo oscuro.
Agregue 50% de glicerol a una concentración final de 10% al cultivo de T. pallidum y disperse el glicerol mediante pipeteo suave o inversión. Distribuya la preparación en alícuotas de uno a dos mililitros en viales de congelador con tapa de rosca e inmediatamente coloque los viales en un congelador a 80 grados Celsius o en un congelador de nitrógeno líquido. Prepare y preequilibre dos placas de 96 pocillos con 1000 células Sf1Ep y 200 microlitros de TpCM-2 por pocillo e incube durante la noche en una incubadora de cultivo de tejidos.
Al día siguiente, reemplace el medio Sf1Ep con TpCM-2 como se describió anteriormente. Después de la cuantificación, diluya T. pallidum en TpCM-2 para producir dos preparaciones con concentraciones de 10 y 40 células por mililitro. Inocular 50 microlitros por pocillo de la preparación de 10 T. pallidum por mililitro en una de las placas de 96 ell preparadas.
En los dos pocillos de control de cada placa, inocular el 2 x 10 a la potencia de tres T.pallidum por mililitro de dilución. Equilibre las placas con la mezcla de gas bajo en oxígeno e incube en un frasco de cerveza o incubadora de tres gases a 34 grados centígrados. Al séptimo día, retire la mitad del medio y reemplácelo con TpCM-2 fresco y equilibrado.
Una vez que se identifican los pocillos positivos mediante microscopía de campo oscuro, tripsinícese los pocillos positivos y transfiera la suspensión celular a las placas de 24 pocillos previamente preparadas para una mayor expansión. Por lo general, T. pallidum retiene más del 90% de la motilidad y se multiplica logarítmicamente con un tiempo de duplicación de 33 a 45 horas durante aproximadamente siete días antes de entrar en la fase estacionaria. En el transcurso de una semana, las espiroquetas se sometieron a aproximadamente cuatro o cinco duplicaciones.
