La principal ventaja de este protocolo es que requiere menos mano de obra y mucho tiempo que el método tradicional de contar unidades formadoras de colonias para estimar el crecimiento intracelular de Mycobacterium tuberculosis. Esta técnica hace que sea más fácil para los investigadores examinar rápidamente los medicamentos aprobados por la FDA con el objetivo de reutilizarlos como terapias dirigidas al huésped para tratar la tuberculosis. El método es muy simple y directo.
El conocimiento básico de las técnicas de cultivo de células T portadoras de micobacterias y EO sería suficiente para seguir el protocolo paso a paso. Para comenzar, transfiera de seis a ocho mililitros de cultivo micobacteriano atenuado H37Ra del matraz T25 a un tubo de polipropileno de 15 mililitros. Centrifugar el tubo en una centrífuga de sobremesa.
Después de retirar cuidadosamente el tubo, transfiera el tubo al gabinete de seguridad biológica y espere un minuto para que las bacterias se asienten. Vierta el sobrenadante en el recipiente de desecho del desinfectante. Luego, vuelva a tapar el tubo y suspenda las bacterias en el medio restante golpeando suavemente el costado del tubo y permitiendo que las bacterias se asienten durante un minuto.
Agregue y mezcle dos mililitros de RPMI completo precalentado y transfiéralo a un tubo cónico de 50 mililitros. Para resuspender las micobacterias, extraiga la suspensión en una jeringa de cinco mililitros equipada con una aguja de calibre 25. Luego, expulse muy suavemente por la pared lateral del tubo para minimizar la producción de aerosol y repita el proceso de seis a ocho veces.
Deseche la aguja y la jeringa en un recipiente para objetos punzantes en el gabinete de bioseguridad. Transfiera la suspensión a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros y centrífuga para granular cualquier grumo restante. Devuelva el tubo al gabinete de seguridad y deje que las bacterias se asienten durante un minuto.
Transfiera los 1 a 1,5 mililitros superiores del sobrenadante a un tubo nuevo. Deseche el tubo original en el cubo de basura que contiene el desinfectante. Mezcle bien y agregue varias cantidades de la suspensión micobacteriana a los dos portaobjetos de la cámara de vidrio del pozo, e incube los portaobjetos durante tres horas a 37 grados centígrados.
Después de pipetear hacia arriba y hacia abajo tres veces para desalojar las bacterias no fagocitadas, retire el medio del portaobjetos de la cámara de vidrio. Lavar una vez con dos mililitros de PBS. Descongele las alícuotas de PFA al 4% en PBS almacenadas a menos 20 grados centígrados.
Diluir la alícuota al 2% PFA y añadir dos mililitros a cada pocillo. Después de incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente, retire el portaobjetos del gabinete de seguridad para teñirlo. Deseche el PFA en el contenedor de desechos químicos de PFA y lave el tobogán bajo un chorro suave de agua del grifo.
Usando una pipeta de transferencia de plástico, dispense suficiente auramina para cubrir las células en el portaobjetos e incube el portaobjetos durante un minuto a temperatura ambiente en la oscuridad. Lave el exceso de tinte del portaobjetos con agua del grifo y agregue el enfriador durante un minuto en la oscuridad. Después de lavar el exceso de enfriador, incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente con la tinción de Hoechst en la oscuridad.
Luego lave la mancha de Hoechst. Y después de drenar el exceso de agua, agregue una gota de antifade y un cubreobjetos. Examine el portaobjetos secado al aire bajo el microscopio fluorescente utilizando el objetivo de aceite 100x.
Las micobacterias emitirán fluorescencia verde bajo el filtro Fitz y los núcleos fluorescerán en azul bajo el filtro DAPI. Contar el número de micobacterias fagocitadas por célula y el porcentaje de células infectadas para determinar MOI. Calcule el volumen de suspensión micobacteriana necesaria para lograr el MOI requerido en función del área de superficie de un pozo en la placa.
Después de mezclar la suspensión de micobacterias, agregue el volumen calculado a las celdas en 12 placas de pocillos para lograr el MOI deseado. Incubar la placa a 37 grados centígrados durante tres horas para permitir que las micobacterias sean fagocitadas. Luego elimine las bacterias extracelulares lavando los pocillos con RPMI caliente varias veces.
Agregue 500 microlitros de tampón de lisis durante 10 minutos para lisar los macrófagos en un pocillo de la muestra de tres horas, y recoja el lisado para determinar la tasa de infección inicial. Luego agregue RPMI completo fresco y las dosis de medicamentos requeridas, o control del vehículo, a los pozos restantes. Incubar las placas en la incubadora de dióxido de carbono a 37 grados centígrados durante uno a ocho días, dependiendo del diseño del experimento.
Determinar el porcentaje de tiempo hasta la positividad, o TTP, del inóculo inicial de la muestra de tres horas, caldo Middlebrook caliente y botellas de cultivo de instrumentos a temperatura ambiente. Transfiera el medio de la placa de 12 pocillos a los tubos cónicos etiquetados correspondientes y agregue 500 microlitros de tampón de lisis estéril a cada pocillo. Después de 10 minutos, raspe suavemente las células del pozo con un raspador estéril y combínelas con el medio en el tubo cónico apropiado.
Una vez que el pozo se lava con 0,5 mililitros de PBS estéril y se combina con el medio y el lisado, rompa los grumos pasando suavemente cada muestra a través de una jeringa de aguja de calibre 25 de seis a ocho veces. Diluir la muestra en caldo MB agregando 900 microlitros de caldo MB a 100 microlitros de muestra, y repetir el proceso de cosecha en los puntos de tiempo requeridos durante la incubación. Prepare las botellas del grupo de instrumentos esterilizando la tapa de goma con 70% de alcohol.
Transfiera suficientes suplementos nutricionales para todas las muestras en un tubo cónico y use una aguja y una jeringa para inyectar 0,5 mililitros de suplemento nutricional en el frasco de cultivo del instrumento. Luego, pipetear 500 microlitros de la muestra diluida de uno en 10 en un tubo inferior en V de un mililitro. Use una aguja y una jeringa para inyectar los 500 microlitros de muestra en las botellas de cultivo de instrumentos asignadas.
Después de transportar cuidadosamente las botellas desde el gabinete de bioseguridad hasta el instrumento para cargar, presione el botón de carga en el sistema automatizado de detección microbiana. Escanee los códigos de barras en las botellas de cultivo de instrumentos y coloque las botellas en la incubadora del sistema de detección a 37 grados centígrados durante un máximo de 42 días. Lea y registre el tiempo necesario para alcanzar la positividad desde la pantalla del instrumento y calcule el porcentaje TTP.
Un TTP positivo indica crecimiento micobacteriano. El instrumento automatizado de cultivo líquido monitoreó los niveles de dióxido de carbono cada 10 minutos y calculó TTP, que es el número de días desde la inoculación hasta que los cultivos se marcan como positivos. Se ilustró una relación inversa entre TTP y los valores log(10) de UFC en el inóculo inicial.
Cuando se comparó el crecimiento intracelular de Mycobacterium tuberculosis dentro de macrófagos determinado mediante la enumeración de UFC con el método de cultivo automatizado descrito, se obtuvo una correlación significativa entre los resultados. El crecimiento de Mycobacterium tuberculosis se presentó gráficamente comparando los valores de TTB hasta ocho días después de la infección de macrófagos con el valor inicial de TTP. Una tendencia similar entre UFC y cultivo líquido demostró una inhibición significativa del crecimiento de Mycobacterium tuberculosis en macrófagos en presencia de ácido todo-transretinoico, o AtRA, en solución, o la dosis equivalente de AtRA encapsulada en micropartículas de PLGA.
Se llevó a cabo un experimento de dosis-respuesta en células THP-1 infectadas para determinar la eficacia del antibiótico linezolid solo, o la combinación de linezolid e interferón gamma. No se observó interacción significativa entre los fármacos. La tinción de AFP nos permite utilizar un MOI bajo para minimizar la muerte celular al infectar macrófagos, y para asegurar que se utiliza el mismo MOI independientemente del tratamiento utilizado.
Siguiendo este protocolo, los principales medicamentos antituberculosos pueden identificarse y estudiarse más a fondo para investigar su eficacia in vivo.
