Este trabajo fue financiado en parte por los Institutos Nacionales de Salud (K08-DK073545 NICHD y patrocinado por la investigación intelectual y Deficiencias del Desarrollo Centro de Premio al Investigador Nuevo), la Fundación Filadelfia, y la Universidad de Pennsylvania premio McCabe (MJF), así como la de Tristán Mullen Fondo (MJF y MI). El contenido es responsabilidad exclusiva de sus autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

<ol>
	<li>Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C. elegans: A practical approach. , (1999).</li><li>Dingley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiratory+chain+dysfunction+variably+increases+oxidant+stress+in+Caenorhabditis+elegans.">Mitochondrial respiratory chain dysfunction variably increases oxidant stress in Caenorhabditis elegans.</a> Mitochondrion. 10, 125-136 (2010).</li><li>Jones, B. N., Gilligan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=o-Phthaldialdehyde+precolumn+derivatization+and+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography+of+polypeptide+hydrolysates+and+physiological+fluids.">o-Phthaldialdehyde precolumn derivatization and reversed-phase high-performance liquid chromatography of polypeptide hydrolysates and physiological fluids.</a> Journal of chromatography. 266, 471-482 (1983).</li><li>Falk, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+pathway+profiling+of+mitochondrial+respiratory+chain+mutants+in+C.+elegans.">Metabolic pathway profiling of mitochondrial respiratory chain mutants in C. elegans.</a> Molecular genetics and metabolism. 93, 388-397 (2008).</li><li>Yudkoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+in+vivo+ureagenesis+with+stable+isotopes.">Measuring in vivo ureagenesis with stable isotopes.</a> Molecular genetics and metabolism. 100, 37-41 (2010).</li><li>Tsang, W. Y., Sayles, L. C., Grad, L. I., Pilgrim, D. B., Lemire, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiratory+chain+deficiency+in+Caenorhabditis+elegans+results+in+developmental+arrest+and+increased+life+span.">Mitochondrial respiratory chain deficiency in Caenorhabditis elegans results in developmental arrest and increased life span.</a> J Biol Chem. 276, 32240-32246 (2001).</li></ol>

La aplicación de la espectrometría de masas para medir la abundancia isotópica de metabolitos intermedios ofrece una imagen maravillosamente detallada de los cambios bioquímicos críticos 5. En este caso, hemos proporcionado protocolos detallados para la explotación de esta metodología altamente sensible y específica para evaluar el flujo intermediario metabólico en el modelo animal genéticamente versátil, C. elegans. De hecho, la alimentación de los animales que viven con isótopos estables etiquetados precursores metabólicos (por ejemplo, 13 C-glucosa) permite la visión novedosa en el flujo vía intermediarios metabólicos en la medición de enriquecimiento isotópico en los metabolitos intermedios. Hemos desarrollado una metodología fiable para obtener un análisis sólido de flujo a través de la glicólisis, el metabolismo del piruvato y el ciclo del ácido tricarboxílico. Esto se puede lograr tanto en los animales alimentados con isótopos estables de las primeras etapas del desarrollo larval o principios en el período post-mitótico adultos. Enriquecimiento isotópico en diferentes especies de metabolitos pueden ser estudiadas en conjunto con el gusano entero sin perfil de aminoácidos por cromatografía líquida de alto rendimiento, como se describió anteriormente 4, para determinar el enriquecimiento isotópico absoluta en las diferentes especies de gusano de alanina libre, aspartato, glutamato y la glutamina. De hecho, los patrones consistentes de enriquecimiento isotópico se obtienen al medir los aminoácidos y ácidos orgánicos analitos en alícuotas de entre 1.000 y 2.000 jóvenes gusanos adultos sincrónica. Dicha metodología sensible puede discriminar el flujo anormal de intermediario en el gen nuclear basada en las cepas mutantes mitocondrial en relación con los gusanos de tipo salvaje. Esta técnica tiene un valor para investigar las alteraciones del flujo de vías bioquímicas específicas de interés común de los errores innatos del metabolismo. En particular, la utilización de la glucosa marcada con isótopos estables informa el flujo de carbono por el centro de las rutas metabólicas de interés para la enfermedad mitocondrial. De hecho, nuestros datos sugieren la aplicación de dicha metodología sensible puede discriminar flujo intermediario anormal en un gen nuclear basado mitocondrial subunidad compleja cepa mutante III (ISP-1 (qm150)) en relación con los gusanos de tipo salvaje. Es importante reconocer que, desde la exposición isotópica se completa en un período de uno a varios días, el enriquecimiento isotópico cuantificados representa un &quot;estado estable&quot; valor de enriquecimiento y no cuantificables de flujo durante un período definido de tiempo que pudieran determinarse en la celda de los modelos basados ​​en expuestos a los isótopos de un periodo de minutos a horas. Otra limitación potencial de interrogar a la vía de flujo a lo largo del desarrollo de los nematodos se relaciona con diferentes longitudes de desarrollo de las larvas que se producen, en particular, cepas mutantes. Por ejemplo, muchas mutaciones mitocondriales severas son conocidos por causar un paro en la tercera (L3) estado larval 6. Así, el análisis de la incorporación de isótopos sólo en los animales que sobreviven a la edad adulta puede no ser representativa de la población mutante todo. Sin embargo, esta metodología podría ser adaptado para evaluar la incorporación de isótopos en los metabolitos intermediarios en una etapa específica de larvas (por ejemplo, L2) en lugar de esperar a los animales para llegar a la etapa adulta. Del mismo modo, los animales que entran en la etapa larval alternativa conocida como Dauer probablemente han alterado significativamente (probabilidad baja) del metabolismo de flujo en relación con los animales que proceden directamente a través de los cuatro estadios larvarios. Estudio en el futuro también se podría realizar una evaluación directa de la incorporación isotópica en los animales etapa Dauer de diferentes orígenes genéticos. Exponiendo los animales a los isótopos estables por un período de tiempo fijo (en este caso, 24 a 48 horas) a partir una vez que los animales llegaron a la etapa de adulto joven (como se detalla en el Protocolo B) elimina el impacto de la variable de períodos de desarrollo. Mientras que el 13 C-glucosa en el metabolismo de la glucólisis sólo interroga, el piruvato y el flujo del ciclo del ácido tricarboxílico, otros trazadores isotópicos podrían ser evaluados para interrogar flujo vía bioquímica a través de otras vías de interés en los nematodos. Por ejemplo, 15 N-glicina podría ser utilizada para evaluar el volumen de negocios de aminoácidos en los nematodos. Otra limitación potencial de este enfoque es el nivel de sensibilidad de la detección de metabolitos. Nuestra experiencia sugiere un mínimo de 500 nematodos adultos jóvenes son necesarios para cuantificar el éxito constitución isotópica de los métodos HPLC y GC / MS empleado aquí. Utilización de instrumentos con una mayor sensibilidad, como la cromatografía líquida de ultra (UPLC), puede permitir una mayor reducción del número de animales estudiados, aunque prevemos que esto es poco probable que permitan la cuantificación fiable de los metabolitos y la incorporación de isótopos en las especies de gusanos de un solo metabolito. Se estudiaron las poblaciones de gusanos de 1.000 animales por experimento, que nos pareció confiable detectar metabolitos de baja abundancia en cada cepa. Sin embargo, algunos metabolitos, como el GABA, sólo puede cuantificarse en las poblaciones mucho más grandes de los nematodos, en el orden de1x10 6 animales 4. En resumen, los perfiles de isótopos estables proporciona una manera no invasiva y segura (no radiactivo) enfoque que ha sido utilizado para estudiar los errores innatos del metabolismo. Aplicación de esta metodología a C. elegans proporciona la capacidad de la novela para investigar in vivo, en tiempo real, las alteraciones metabólicas que se producen en el nivel animal entero, que puede ser consecuencia de trastornos genéticos individuales y / o exposiciones farmacológicas del agente.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>S. basal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1 - page 59</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Cholesterol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C-8503</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>OP50 E. coli</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Protocols A and C</td>
</tr>
<tr>
<td>K12 E. coli</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>NGM agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Research Products INT</td>
<td>N81800-1000.0</td>
<td>Protocols A, B, and C</td>
</tr>
<tr>
<td>13C glucose (universally labeled)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cambridge Isotope labs</td>
<td>CLM-1396</td>
<td>Protocol A and C</td>
</tr>
<tr>
<td>13C glucose (1,6 labeled)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cambridge Isotope labs</td>
<td>CLM-2717</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>60% Perchloric acid (PCA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>MK2766500</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>&epsilon;-aminocaproic acid (Internal Standard)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A-2504</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>MTBSTFA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Regis</td>
<td>270243</td>
<td>Protocol E</td>
</tr>
<tr>
<td>Acetonitrile</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Regis</td>
<td>270010</td>
<td>Protocol E</td>
</tr>
<tr>
<td>AG 1-X8, 100-200, Chloride form resin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BIO-RAD</td>
<td>140-1441</td>
<td>Protocols A and B (organic acid extraction)</td>
</tr>
<tr>
<td>AG 50W-X8, 100-200, Hydrogen form resin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BIO-RAD</td>
<td>142-1441</td>
<td>Protocols A and B (amino acid extraction)</td>
</tr>
<tr>
<td>NaHCO3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S-8875</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>NaOH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S8045</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>3N HCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>320331</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>1N HCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>320331</td>
<td>Protocol A</td>
</tr>
<tr>
<td>0.1 N HCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>320331</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>4N NH4OH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>30501</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>4N KOH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>484016</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Deionized water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Milli Q Biocel</td>
<td>ZMQA60F01</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>Helium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Airgas</td>
<td>24001364</td>
<td>Protocol C2</td>
</tr>
<tr>
<td>SMZ-800 Zoom Stereo-Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NIKON</td>
<td>NI MNA41000</td>
<td>Protocols A, B, and C</td>
</tr>
<tr>
<td>pH meter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>S68167</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Table top centrifuge - 5804R</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>05-400-93</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Incubated platform shaker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New Brunswick</td>
<td>M1324-0004</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>Mini LabRoller Rotator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Labnet</td>
<td>H-5500</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Pestles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kontes</td>
<td>K749520-0090</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Drill</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kontes</td>
<td>K749540-0000</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>1 L glass beaker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>02-539P</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 L Erlenmeyer Flasks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>89000-368</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>25 mL Erlenmeyer Flasks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>89000-356</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>7ml round-bottom glass tubes + rubber stopper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>VT6431</td>
<td>Protocols A, B, and C1,C2</td>
</tr>
<tr>
<td>10 ml round-bottom glass tubes + rubber stopper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>VT6430</td>
<td>Protocol C2</td>
</tr>
<tr>
<td>Blue top tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Labco</td>
<td>438B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 ml conical plastic tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>14-959-49A</td>
<td>All protocols</td>
</tr>
<tr>
<td>1.5 ml microfuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>02-681-320</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Syringes (1 mL, 10 mL, 20 mL)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Medical</td>
<td>301025, 301029, 301031</td>
<td>Protocols C1 and C2</td>
</tr>
<tr>
<td>25 gauge needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>22-253-131</td>
<td>Protocols C1 and C2</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-Prep Chromatography Columns</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BIO-RAD</td>
<td>731-1550</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>Pasteur pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>14673-043</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>60mm Petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>25373-085</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass chamber (cut bottom of 1 L flask) fitted with grease-sealed 3-way stopcock</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom Made in Glass Shop</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>Optically transparent glass plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom Made in Glass Shop</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>Reacti-Vap III Evaporator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>18826</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>Cotton</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>14224-516</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>High Vacuum Grease</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>1597418</td>
<td>Protocol C1</td>
</tr>
<tr>
<td>Aluminum Foil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>01-213-18</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>Timer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ISC Bioexpress</td>
<td>T-2504-5</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>Gas-Ratio Mass Spectrometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermophinigan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>GC-MS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HP</td>
<td>5980/5971</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>GC-MS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>6980N/5973N</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>HPLC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Varian</td>
<td>9010</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

stable isotopic profiling of intermediary metabolic flux in developing and adult stage caenorhabditis elegans

Perfiles de isótopos estables ha permitido a largo investigaciones sensibles de las consecuencias metabólicas de las mutaciones genéticas y / o tratamientos farmacológicos en modelos celulares y los mamíferos. A continuación, describimos los métodos detallados para realizar perfiles de isótopos estables del metabolismo intermediario y de flujo metabólico en el nematodo Caenorhabditis elegans. Se describen los métodos para crear perfiles de todo gusano aminoácidos libres, el dióxido de carbono marcado, etiquetado ácidos orgánicos y aminoácidos marcados en animales expuestos a cualquiera de los isótopos estables de desarrollo temprano en las placas de agar crecimiento de nematodos o los medios de comunicación a partir de adultos jóvenes por la exposición a diversos tratamientos farmacológicos en cultivo líquido. Los aminoácidos libres son cuantificados por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en alícuotas gusano extrae todo en el 4% de ácido perclórico. Universalmente marcado con 13 C-glucosa o 1,6 - 13 C 2-glucosa se ​​utiliza como precursor de isótopos estables de carbono marcado que se traza mediante espectrometría de masas de dióxido de carbono (tanto en la atmósfera y disuelto), así como en los metabolitos de indicativo de flujo a través de la glucólisis , el metabolismo del piruvato y el ciclo del ácido tricarboxílico. Los resultados representativos se incluyen para demostrar los efectos del tiempo de los isótopos de la exposición, varios protocolos de intercambio de bacterias, y otros métodos de interrupción del gusano de tipo salvaje nematodos, así como el grado relativo de incorporación de isótopos en el complejo III mitocondrial gusanos mutantes (ISP-1 (qm150) ) en relación con los gusanos de tipo salvaje. La aplicación de perfiles de isótopos estables en los nematodos de vida ofrece una capacidad nueva para investigar las alteraciones en el animal completo nivel metabólico en tiempo real que son causadas por desórdenes genéticos individuales y / o tratamientos farmacológicos.

Watch this Scientific Journal Video about Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Perfiles de isótopos estables de análisis de cromatografía de gases espectrometría de masa de flujo de intermediario metabólico se describe en el nematodo,<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt;. Los métodos son detallados para evaluar el enriquecimiento isotópico en el dióxido de carbono, ácidos orgánicos y aminoácidos después de la exposición, ya sea durante el desarrollo de isótopos en placas de agar o en la edad adulta en cultivo líquido.

Perfiles de isótopos estables de flujo intermediarios metabólicos en fase de desarrollo y de Adultos Caenorhabditis elegans</em

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

stable-isotopic-profiling-intermediary-metabolic-flux-developing

Research

JoVE Journal

Biology

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

13.4K vistas.  The Children's Hospital of Philadelphia. Perfiles de isótopos estables de análisis de cromatografía de gases espectrometría de masa de flujo de intermediario metabólico se describe en el nematodo, Caenorhabditis elegans. Los métodos son detallados para evaluar el enriquecimiento isotópico en el dióxido de carbono, ácidos orgánicos y aminoácidos después de la exposición, ya sea durante el desarrollo de isótopos en placas de agar o en la edad adulta en cultivo líquido.