Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü (K08-DK073545 ve NICHD-sponsorluğunda Fikri ve Gelişimsel Engelliler Araştırma Merkezi Yeni Araştırmacı Ödülü), Philadelphia Vakfı, Pennsylvania McCabe ödülü Üniversitesi (MJF) yanı sıra, Tristan tarafından finanse edildi Mullen Fonu (MJF ve MY). Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık enstitülerinin resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

<ol>
	<li>Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C. elegans: A practical approach. , (1999).</li><li>Dingley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiratory+chain+dysfunction+variably+increases+oxidant+stress+in+Caenorhabditis+elegans.">Mitochondrial respiratory chain dysfunction variably increases oxidant stress in Caenorhabditis elegans.</a> Mitochondrion. 10, 125-136 (2010).</li><li>Jones, B. N., Gilligan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=o-Phthaldialdehyde+precolumn+derivatization+and+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography+of+polypeptide+hydrolysates+and+physiological+fluids.">o-Phthaldialdehyde precolumn derivatization and reversed-phase high-performance liquid chromatography of polypeptide hydrolysates and physiological fluids.</a> Journal of chromatography. 266, 471-482 (1983).</li><li>Falk, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+pathway+profiling+of+mitochondrial+respiratory+chain+mutants+in+C.+elegans.">Metabolic pathway profiling of mitochondrial respiratory chain mutants in C. elegans.</a> Molecular genetics and metabolism. 93, 388-397 (2008).</li><li>Yudkoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+in+vivo+ureagenesis+with+stable+isotopes.">Measuring in vivo ureagenesis with stable isotopes.</a> Molecular genetics and metabolism. 100, 37-41 (2010).</li><li>Tsang, W. Y., Sayles, L. C., Grad, L. I., Pilgrim, D. B., Lemire, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiratory+chain+deficiency+in+Caenorhabditis+elegans+results+in+developmental+arrest+and+increased+life+span.">Mitochondrial respiratory chain deficiency in Caenorhabditis elegans results in developmental arrest and increased life span.</a> J Biol Chem. 276, 32240-32246 (2001).</li></ol>

Izotopik bolluk aracı metabolitleri ölçmek için kütle spektrometresi uygulanması kritik biyokimyasal değişiklikler 5 harika detaylı bir resmini tanıyor. Burada, genetik olarak çok yönlü bir model hayvan, C. aracılık metabolik akı değerlendirmek için bu son derece duyarlı ve özgül bir metodoloji istismar için ayrıntılı protokolleri sağladı elegans. Gerçekten de, stabil izotop ile yaşayan hayvanların beslenmesi aşağı metabolitleri izotopik zenginleştirme ölçerken metabolik öncüleri (örneğin, C-13 glukoz gibi) aracı metabolik yolu akı içine roman fikir izin etiketli. Glikoliz, pirüvat metabolizma ve trikarboksilik asit döngüsü ile akı sağlam analiz elde etmek için güvenilir bir yöntem geliştirdi. Bu erken larval gelişim evreleri stabil izotop beslenen hayvanlarda ya da post-mitotik yetişkin dönemde başlayan hem de elde edilebilir. Ücretsiz solucan alanin, aspartat, glutamat ve glutamin farklı türlerin mutlak izotopik zenginleştirme önceden belirlemek için, 4 açıklandığı gibi farklı metabolit türlerin izotopik zenginleştirme, yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile tüm solucan serbest amino asit profili ile birlikte okudu. Gerçekten de, 1.000 ila 2.000 genç erişkin senkron solucanları hacimde, amino asit ve organik asit analitlerin ölçerken izotopik zenginleştirme tutarlı desenler elde edilir. Böyle bir metodoloji, hassas, yabani tip solucanlar göre nükleer gen tabanlı mitokondriyal mutant anormal aracı akı ayrımcılık. Bu teknik uygunluğu belirli biyokimyasal yollar sık ​​görülen doğumsal metabolizma akı değişiklikleri araştırmak için değeri tutar. Özellikle, stabil izotop ile işaretlenmiş glikoz kullanımını mitokondrial hastalığı ile ilgili merkezi metabolik yollar aracılığıyla karbon akı bilgilendirir. Gerçekten de, bizim böyle bir metodolojinin uygulama hassas yabani tip solucanlar göreceli bir nükleer gen tabanlı mitokondriyal karmaşık III altbirim mutant suş (isp-1 (qm150)) anormal aracı akı ayrımcılık öneririz. Izotopik maruz kalma birkaç gün bir süre içinde tamamlanmış olduğundan, hücre tabanlı modeller belirlenecek gibi sayısal izotopik zenginleştirme zaman belirli bir süre boyunca &quot;kararlı durum&quot; zenginleştirme değeri yerine ölçülebilir akı temsil ettiğini kabul etmek önemlidir. saat dakika bir süre için izotop maruz. Yolağı akı nematod gelişimi boyunca sorguya başka potansiyel sınırlama özellikle mutant suşların ortaya çıkan larva gelişimini uzunlukları farklı ilgilidir. Örneğin, birçok ciddi mitokondriyal mutasyonlar üçüncü (L3) larva dönemi 6 tutuklama neden olduğu bilinmektedir. Bu nedenle, sadece yetişkinliğe hayatta hayvanlar izotop esas analizi tüm mutant nüfusunun temsilcisi olmayabilir. Ancak, bu yöntem belirli bir larva dönemi (L2) ziyade hayvanlar yetişkin aşamaya ulaşmak için bekleyen aracı metabolitleri izotopik dahil değerlendirmek için adapte edilebilir. Benzer şekilde, büyük olasılıkla Dauer olarak bilinen alternatif larva dönemi girin hayvanların önemli ölçüde doğrudan dört larval aşamalardan geçerek devam hayvanlara göre (büyük olasılıkla daha düşük) metabolik akı değiştirmiştir. Gelecek çalışma aynı zamanda doğrudan Dauer sahne hayvanlarda farklı genetik geçmişleri izotopik birleştirmek değerlendirmek için yapılabilir. Hayvanlar genç yetişkin aşamasına ulaştıktan sonra başlayan sabit bir süre için (burada, 24 ila 48 saat) stabil izotop hayvanların maruz kalması (Protokol B ayrıntılı olarak) değişken gelişim dönemlerinin etkisi ortadan kaldırır. 13 C-glikoz glikoliz, pirüvat metabolizma ve trikarboksilik asit döngüsü akı sorguluyor, diğer izotop izleyiciler nematod ilgi diğer yollar aracılığıyla biyokimyasal yol akı sorgulamak için potansiyel değerlendirilecektir olabilir. Örneğin, 15 N-glisin amino asit cirosu nematod olarak değerlendirmek için kullanılabilir olabilir. Bu yaklaşımın bir başka potansiyel sınırlama metaboliti algılama hassasiyet seviyesi. Deneyimlerimiz, en az 500 genç erişkin nematod burada istihdam edilen HPLC ve GC / MS yöntemleri başarıyla izotopik birleştirmek ölçmek için gerekli göstermektedir. Ultra performanslı sıvı kromatografi (UPLC) gibi yüksek hassasiyette, enstrümanların kullanımı, biz bu tek solucanlar metaboliti olan türler içine metabolitleri ve izotopik dahil güvenilir kantitatif izin olası tahmin rağmen, çalışılan hayvan sayısının daha da azalmasına izin verebilir. Biz, biz her bir suş düşük bolluk metabolitleri güvenilir bir şekilde tespit etmek için deney başına 1.000 hayvanların solucan popülasyonları okudu. Ancak, böyle bir GABA gibi bazı metabolitleri, sadece güvenilir, sipariş üzerine, nematod nüfusları çok daha büyük sayısal olabilir1x10 6 hayvanların 4. Özet olarak, stabil izotop profili doğuştan metabolizma uzun çalışma için kullanılan bir non-invaziv ve güvenli (radyoaktif olmayan) bir yaklaşım sağlar. Bu metodoloji C. Uygulama elegans bireysel genetik bozukluklar ve / veya farmakolojik ajan maruz kalma sonucu in vivo, gerçek zamanlı, tüm hayvan seviyesinde meydana gelen metabolik değişiklikler, araştırmak için roman kapasiteli sağlar .

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>S. basal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1 - page 59</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Cholesterol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C-8503</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>OP50 E. coli</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Protocols A and C</td>
</tr>
<tr>
<td>K12 E. coli</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>NGM agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Research Products INT</td>
<td>N81800-1000.0</td>
<td>Protocols A, B, and C</td>
</tr>
<tr>
<td>13C glucose (universally labeled)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cambridge Isotope labs</td>
<td>CLM-1396</td>
<td>Protocol A and C</td>
</tr>
<tr>
<td>13C glucose (1,6 labeled)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cambridge Isotope labs</td>
<td>CLM-2717</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>60% Perchloric acid (PCA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>MK2766500</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>&epsilon;-aminocaproic acid (Internal Standard)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A-2504</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>MTBSTFA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Regis</td>
<td>270243</td>
<td>Protocol E</td>
</tr>
<tr>
<td>Acetonitrile</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Regis</td>
<td>270010</td>
<td>Protocol E</td>
</tr>
<tr>
<td>AG 1-X8, 100-200, Chloride form resin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BIO-RAD</td>
<td>140-1441</td>
<td>Protocols A and B (organic acid extraction)</td>
</tr>
<tr>
<td>AG 50W-X8, 100-200, Hydrogen form resin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BIO-RAD</td>
<td>142-1441</td>
<td>Protocols A and B (amino acid extraction)</td>
</tr>
<tr>
<td>NaHCO3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S-8875</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>NaOH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S8045</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>3N HCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>320331</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>1N HCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>320331</td>
<td>Protocol A</td>
</tr>
<tr>
<td>0.1 N HCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>320331</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>4N NH4OH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>30501</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>4N KOH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>484016</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Deionized water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Milli Q Biocel</td>
<td>ZMQA60F01</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>Helium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Airgas</td>
<td>24001364</td>
<td>Protocol C2</td>
</tr>
<tr>
<td>SMZ-800 Zoom Stereo-Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NIKON</td>
<td>NI MNA41000</td>
<td>Protocols A, B, and C</td>
</tr>
<tr>
<td>pH meter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>S68167</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Table top centrifuge - 5804R</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>05-400-93</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Incubated platform shaker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New Brunswick</td>
<td>M1324-0004</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>Mini LabRoller Rotator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Labnet</td>
<td>H-5500</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Pestles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kontes</td>
<td>K749520-0090</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Drill</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kontes</td>
<td>K749540-0000</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>1 L glass beaker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>02-539P</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 L Erlenmeyer Flasks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>89000-368</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>25 mL Erlenmeyer Flasks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>89000-356</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>7ml round-bottom glass tubes + rubber stopper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>VT6431</td>
<td>Protocols A, B, and C1,C2</td>
</tr>
<tr>
<td>10 ml round-bottom glass tubes + rubber stopper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>VT6430</td>
<td>Protocol C2</td>
</tr>
<tr>
<td>Blue top tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Labco</td>
<td>438B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 ml conical plastic tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>14-959-49A</td>
<td>All protocols</td>
</tr>
<tr>
<td>1.5 ml microfuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>02-681-320</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Syringes (1 mL, 10 mL, 20 mL)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Medical</td>
<td>301025, 301029, 301031</td>
<td>Protocols C1 and C2</td>
</tr>
<tr>
<td>25 gauge needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>22-253-131</td>
<td>Protocols C1 and C2</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-Prep Chromatography Columns</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BIO-RAD</td>
<td>731-1550</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>Pasteur pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>14673-043</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>60mm Petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>25373-085</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass chamber (cut bottom of 1 L flask) fitted with grease-sealed 3-way stopcock</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom Made in Glass Shop</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>Optically transparent glass plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom Made in Glass Shop</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>Reacti-Vap III Evaporator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>18826</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>Cotton</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>14224-516</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>High Vacuum Grease</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>1597418</td>
<td>Protocol C1</td>
</tr>
<tr>
<td>Aluminum Foil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>01-213-18</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>Timer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ISC Bioexpress</td>
<td>T-2504-5</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>Gas-Ratio Mass Spectrometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermophinigan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>GC-MS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HP</td>
<td>5980/5971</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>GC-MS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>6980N/5973N</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>HPLC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Varian</td>
<td>9010</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

stable isotopic profiling of intermediary metabolic flux in developing and adult stage caenorhabditis elegans

Kararlı izotop profil uzun hassas araştırmalar, genetik mutasyonlar ve / veya hücresel ve memeli modellerinde farmakolojik tedaviler metabolik sonuçları izin verdi. Burada, nematod, Caenorhabditis elegans aracı metabolizma ve metabolik akı kararlı izotop profil gerçekleştirmek için detaylı yöntemleri açıklar. Yöntemler çeşitli farmakolojik tedavilere maruz kaldığında, genç yetişkinler olarak nematod büyüme medya agar plaklarına veya başından erken gelişim ya kararlı izotopu maruz hayvanların tüm solucan serbest amino asitler, etiketli karbon dioksit, etiketli organik asitler, amino asitler ve etiketli profil için açıklanan sıvı kültürü. Serbest amino asitler,% 4 perklorik asit çıkarılan tüm solucan alikotları yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) ile nicel. Evrensel etiketli 13 C-glukoz veya 1,6 - 13 C 2-glukoz, etiketli karbon, karbon dioksit kütle spektrometresi (hem atmosferik ve çözünmüş) yanı sıra, glikoliz yoluyla akı göstergesidir metabolitleri tarafından takip kararlı izotop habercisi olarak kullanılmaktadır pirüvat metabolizma ve trikarboksilik asit döngüsü. Temsilcisi (isp-1 (qm150) izotopik esas mitokondriyal kompleksi III mutant solucanlar gibi göreceli bir ölçüde, yabani tip nematod izotop pozlama süresi etkileri, çeşitli bakteriyel temizleme protokolleri ve alternatif solucan bozulma yöntemleri göstermek için dahil edilmiştir ) yabani tip solucanlar göre. Yaşayan nematod kararlı izotop profil Uygulama bireysel genetik bozukluklar ve / veya farmakolojik tedaviler neden olan bütün hayvan düzeyinde gerçek-zamanlı metabolik değişiklikler araştırmak için yeni bir kapasite sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Kararlı izotop profil aracı metabolik akı gaz kromatografisi kütle spektrometrik analizi, nematod açıklanan<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt;. Yöntem, karbon dioksit, organik asitler, amino asitler ve agar plaklarına gelişimi sırasında ya da sıvı kültür yetişkinlik döneminde ya izotop maruz izotopik zenginleştirme değerlendirilmesi için ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Kararlı İzotopik Profil geliştirilmesi ve Yetişkin Sahne Aracı Metabolik Akı Caenorhabditis elegans</em

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

stable-isotopic-profiling-intermediary-metabolic-flux-developing

Research

JoVE Journal

Biology

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

13.4K Görüntüleme.  The Children's Hospital of Philadelphia. Kararlı izotop profil aracı metabolik akı gaz kromatografisi kütle spektrometrik analizi, nematod açıklanan Caenorhabditis elegans. Yöntem, karbon dioksit, organik asitler, amino asitler ve agar plaklarına gelişimi sırasında ya da sıvı kültür yetişkinlik döneminde ya izotop maruz izotopik zenginleştirme değerlendirilmesi için ayrıntılı olarak açıklanmıştır.