Este trabalho foi financiado em parte pelo National Institutes of Health (K08-DK073545 e NICHD patrocinado Intelectual e Desenvolvimento Deficiência Research Center New Investigator Award), a Fundação Filadélfia, e University of Pennsylvania prêmio McCabe (MJF), bem como o Tristan Mullen Fundo (MJF e MY). O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam, necessariamente, a posição oficial dos institutos nacionais da saúde.

<ol>
	<li>Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C. elegans: A practical approach. , (1999).</li><li>Dingley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiratory+chain+dysfunction+variably+increases+oxidant+stress+in+Caenorhabditis+elegans.">Mitochondrial respiratory chain dysfunction variably increases oxidant stress in Caenorhabditis elegans.</a> Mitochondrion. 10, 125-136 (2010).</li><li>Jones, B. N., Gilligan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=o-Phthaldialdehyde+precolumn+derivatization+and+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography+of+polypeptide+hydrolysates+and+physiological+fluids.">o-Phthaldialdehyde precolumn derivatization and reversed-phase high-performance liquid chromatography of polypeptide hydrolysates and physiological fluids.</a> Journal of chromatography. 266, 471-482 (1983).</li><li>Falk, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+pathway+profiling+of+mitochondrial+respiratory+chain+mutants+in+C.+elegans.">Metabolic pathway profiling of mitochondrial respiratory chain mutants in C. elegans.</a> Molecular genetics and metabolism. 93, 388-397 (2008).</li><li>Yudkoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+in+vivo+ureagenesis+with+stable+isotopes.">Measuring in vivo ureagenesis with stable isotopes.</a> Molecular genetics and metabolism. 100, 37-41 (2010).</li><li>Tsang, W. Y., Sayles, L. C., Grad, L. I., Pilgrim, D. B., Lemire, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiratory+chain+deficiency+in+Caenorhabditis+elegans+results+in+developmental+arrest+and+increased+life+span.">Mitochondrial respiratory chain deficiency in Caenorhabditis elegans results in developmental arrest and increased life span.</a> J Biol Chem. 276, 32240-32246 (2001).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Aplicação de espectrometria de massa para medir a abundância isotópica em metabólitos intermediários proporciona uma imagem detalhada de crítica maravilhosamente alterações bioquímicas 5. Aqui, nós fornecemos protocolos detalhados para explorar esta metodologia altamente sensível e específico para avaliar fluxo metabólico intermediário no modelo animal geneticamente versáteis, C. elegans. Na verdade, a alimentação dos animais que vivem com o isótopo estável rotulados precursores metabólicos (tais como 13 C-glicose) permite uma visão romance em fluxo intermediário via metabólica quando se mede o enriquecimento isotópico em metabólitos jusante. Temos desenvolvido metodologia confiável para obter análise robusta de fluxo através da glicólise, metabolismo do piruvato, e o ciclo do ácido tricarboxílico. Isto pode ser conseguido tanto em animais alimentados com isótopo estável desde o início de estágios de desenvolvimento larval ou início no período pós-mitóticas adulto. Enriquecimento isotópico em diferentes espécies metabólito pode ser estudada em conjunto com todo perfil de ácido amino verme livre por cromatografia líquida de alta eficiência, como descrito anteriormente 4, para determinar o enriquecimento isotópico absoluta em diferentes espécies de verme livre alanina, aspartato, glutamato e glutamina. De fato, padrões consistentes de enriquecimento isotópico são obtidos quando a medição de aminoácidos e ácidos orgânicos analitos em alíquotas de 1.000 a 2.000 jovens adultos worms síncrona. Tal metodologia pode discriminar sensivelmente o fluxo intermediário anormal em gene nuclear baseado mitocondrial cepas mutantes em relação ao tipo selvagem worms. Esta técnica tem valor para investigar alterações no fluxo específico vias bioquímicas comuns de relevância para erros inatos do metabolismo. Em particular, a utilização de glicose marcada com isótopo estável informa fluxo de carbono através de vias metabólicas centrais de relevância para doença mitocondrial. De fato, nossos dados sugerem a aplicação de tal metodologia pode discriminar sensivelmente o fluxo intermediário anormal em um gene nuclear baseado complexo mitocondrial da subunidade III cepa mutante (isp-1 (qm150)) em relação ao tipo selvagem worms. É importante reconhecer que, desde a exposição isotópica é completada por um período de um a vários dias, quantificados enriquecimento isotópico representa um &quot;estado estacionário&quot; valor de enriquecimento, em vez de fluxo quantificável durante um período definido de tempo, como pode ser determinada em células baseado em modelos expostos ao isótopo por um período de minutos a horas. Outra limitação potencial de interrogar fluxo percurso ao longo do desenvolvimento do nematóide se relaciona com diferentes comprimentos de desenvolvimento larval que ocorrem em particular cepas mutantes. Por exemplo, muitos graves mutações mitocondriais são conhecidos por causar prisão na terceira fase larval (L3) 6. Assim, a análise de isótopos de incorporação apenas em animais que sobrevivem até a idade adulta pode não ser representativa de toda a população mutante. No entanto, esta metodologia pode ser adaptada para avaliar incorporação isotópica em metabólitos intermediários em um estágio específico de larva (como L2) em vez de esperar para os animais para chegar à fase adulta. Da mesma forma, os animais que entram no estágio larval alternativa conhecida como Dauer provavelmente alteraram significativamente fluxo metabólico (baixa probabilidade) em relação aos animais que proceda diretamente através das quatro fases larval. Estudo futuro também pode ser realizada para avaliar diretamente a incorporação isotópica em animais estágio Dauer de diferentes backgrounds genéticos. Exposição dos animais ao isótopo estável por um período de tempo fixo (aqui, 24 a 48 horas), começando uma vez animais atingiram a fase adulta jovem (conforme detalhado no Protocolo B) remove o impacto da variável períodos de desenvolvimento. Enquanto 13 C-glicose apenas interroga metabolismo, glicólise piruvato e fluxo de Ciclo do ácido cítrico, outros traçadores isotópicos poderiam ser avaliados para interrogar fluxo caminho bioquímico através de outras vias de interesse em nematóides. Por exemplo, 15 N-glicina pode ser utilizada para avaliar volume de negócios de aminoácidos em nematóides. Outra limitação potencial desta abordagem é o nível de sensibilidade da detecção de metabólito. Nossa experiência sugere um mínimo de 500 nematóides adultos jovens são necessários para quantificar com sucesso incorporação isotópica pelos métodos HPLC e GC / MS empregada aqui. Utilização de instrumentos com maior sensibilidade, como cromatografia ultra-desempenho líquido (UPLC), pode permitir uma maior redução do número de animais estudados, embora nós antecipamos isso é improvável para permitir a quantificação confiável de metabólitos e incorporação isotópica em espécies metabólito de worms único. Foram estudadas populações verme de 1.000 animais por experiência, que nós encontramos para detectar confiavelmente metabólitos baixa abundância em cada tensão. No entanto, alguns metabólitos, tais como GABA, só pode ser confiavelmente quantificados em populações muito maiores de nematóides, na ordem de1x10 6 animais 4. Em resumo, o perfil de isótopos estáveis ​​é um não-invasivo e seguro abordagem (não radioativos) que tem sido utilizada para estudar os erros inatos do metabolismo. Aplicação desta metodologia para C. elegans fornece a capacidade de romance para investigar in vivo, em tempo real, alterações metabólicas que ocorrem no nível animal inteiro, o que pode resultar de doenças genéticas individuais e / ou exposições agente farmacológico.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>S. basal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1 - page 59</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Cholesterol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C-8503</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>OP50 E. coli</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Protocols A and C</td>
</tr>
<tr>
<td>K12 E. coli</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>NGM agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Research Products INT</td>
<td>N81800-1000.0</td>
<td>Protocols A, B, and C</td>
</tr>
<tr>
<td>13C glucose (universally labeled)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cambridge Isotope labs</td>
<td>CLM-1396</td>
<td>Protocol A and C</td>
</tr>
<tr>
<td>13C glucose (1,6 labeled)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cambridge Isotope labs</td>
<td>CLM-2717</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>60% Perchloric acid (PCA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>MK2766500</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>&epsilon;-aminocaproic acid (Internal Standard)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A-2504</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>MTBSTFA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Regis</td>
<td>270243</td>
<td>Protocol E</td>
</tr>
<tr>
<td>Acetonitrile</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Regis</td>
<td>270010</td>
<td>Protocol E</td>
</tr>
<tr>
<td>AG 1-X8, 100-200, Chloride form resin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BIO-RAD</td>
<td>140-1441</td>
<td>Protocols A and B (organic acid extraction)</td>
</tr>
<tr>
<td>AG 50W-X8, 100-200, Hydrogen form resin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BIO-RAD</td>
<td>142-1441</td>
<td>Protocols A and B (amino acid extraction)</td>
</tr>
<tr>
<td>NaHCO3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S-8875</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>NaOH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S8045</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>3N HCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>320331</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>1N HCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>320331</td>
<td>Protocol A</td>
</tr>
<tr>
<td>0.1 N HCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>320331</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>4N NH4OH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>30501</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>4N KOH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>484016</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Deionized water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Milli Q Biocel</td>
<td>ZMQA60F01</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>Helium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Airgas</td>
<td>24001364</td>
<td>Protocol C2</td>
</tr>
<tr>
<td>SMZ-800 Zoom Stereo-Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NIKON</td>
<td>NI MNA41000</td>
<td>Protocols A, B, and C</td>
</tr>
<tr>
<td>pH meter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>S68167</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Table top centrifuge - 5804R</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>05-400-93</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Incubated platform shaker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New Brunswick</td>
<td>M1324-0004</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>Mini LabRoller Rotator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Labnet</td>
<td>H-5500</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Pestles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kontes</td>
<td>K749520-0090</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Drill</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kontes</td>
<td>K749540-0000</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>1 L glass beaker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>02-539P</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 L Erlenmeyer Flasks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>89000-368</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>25 mL Erlenmeyer Flasks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>89000-356</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>7ml round-bottom glass tubes + rubber stopper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>VT6431</td>
<td>Protocols A, B, and C1,C2</td>
</tr>
<tr>
<td>10 ml round-bottom glass tubes + rubber stopper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>VT6430</td>
<td>Protocol C2</td>
</tr>
<tr>
<td>Blue top tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Labco</td>
<td>438B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 ml conical plastic tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>14-959-49A</td>
<td>All protocols</td>
</tr>
<tr>
<td>1.5 ml microfuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>02-681-320</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Syringes (1 mL, 10 mL, 20 mL)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Medical</td>
<td>301025, 301029, 301031</td>
<td>Protocols C1 and C2</td>
</tr>
<tr>
<td>25 gauge needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>22-253-131</td>
<td>Protocols C1 and C2</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-Prep Chromatography Columns</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BIO-RAD</td>
<td>731-1550</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>Pasteur pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>14673-043</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>60mm Petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>25373-085</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass chamber (cut bottom of 1 L flask) fitted with grease-sealed 3-way stopcock</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom Made in Glass Shop</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>Optically transparent glass plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom Made in Glass Shop</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>Reacti-Vap III Evaporator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>18826</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>Cotton</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>14224-516</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>High Vacuum Grease</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>1597418</td>
<td>Protocol C1</td>
</tr>
<tr>
<td>Aluminum Foil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>01-213-18</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>Timer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ISC Bioexpress</td>
<td>T-2504-5</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>Gas-Ratio Mass Spectrometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermophinigan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>GC-MS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HP</td>
<td>5980/5971</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>GC-MS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>6980N/5973N</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>HPLC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Varian</td>
<td>9010</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

stable isotopic profiling of intermediary metabolic flux in developing and adult stage caenorhabditis elegans

Perfis isotópicos estáveis ​​há muito tempo permitido investigações sensíveis das conseqüências metabólicas de mutações genéticas e / ou terapias farmacológicas em modelos celulares e mamíferos. Aqui, descrevemos os métodos detalhados para traçar um perfil isotópico estável de metabolismo intermediário e fluxo metabólico na nematóide, Caenorhabditis elegans. Métodos são descritos para perfilar toda verme aminoácidos livres, dióxido de carbono marcado, rotulado ácidos orgânicos, aminoácidos e rotulado em animais expostos a ambos os isótopos estáveis ​​de desenvolvimento inicial em mídia nematóide crescimento agar placas ou começando como adultos jovens, porém expostos a vários tratamentos farmacológicos em cultura líquida. Aminoácidos livres são quantificados por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) em alíquotas verme todo extraído em 4% de ácido perclórico. Universalmente rotulados 13 C-glicose ou 1,6 - 13 C 2-glicose é utilizada como precursor estável isotópica de carbono, cujo rótulo é rastreado por espectrometria de massa de dióxido de carbono (ambos da atmosfera e dissolvido), bem como em metabólitos indicativo de fluxo através da glicólise , metabolismo do piruvato, e o ciclo do ácido tricarboxílico. Resultados representativos são incluídos para demonstrar os efeitos do tempo de exposição de isótopos, vários protocolos de limpeza bacteriana e métodos de interrupção alternativa verme em tipo selvagem nematóides, bem como a extensão relativa de incorporação isotópica no complexo III mitocondrial mutante worms (isp-1 (qm150) ) em relação ao tipo selvagem worms. Aplicação de perfis isotópica estável em nematóides de vida proporciona uma capacidade inovadora para investigar a todo o nível animal alterações em tempo real metabólicos que são causadas por doenças genéticas individuais e / ou terapias farmacológicas.

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Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Profiling isotópica estável por análise de massa de gás cromatografia espectrometria de fluxo metabólico intermediário é descrito no nematóide,<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt;. Métodos são detalhados para avaliar enriquecimento isotópico em dióxido de carbono, ácidos orgânicos e aminoácidos após a exposição de isótopos, quer durante o desenvolvimento em placas de agar ou durante a vida adulta na cultura líquido.

Profiling isotópicas estáveis ​​de fluxo metabólico intermediário na fase de desenvolvimento e Adultos Caenorhabditis elegans</em

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

stable-isotopic-profiling-intermediary-metabolic-flux-developing

Research

JoVE Journal

Biology

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

13.4K visualizações.  The Children's Hospital of Philadelphia. Profiling isotópica estável por análise de massa de gás cromatografia espectrometria de fluxo metabólico intermediário é descrito no nematóide, Caenorhabditis elegans. Métodos são detalhados para avaliar enriquecimento isotópico em dióxido de carbono, ácidos orgânicos e aminoácidos após a exposição de isótopos, quer durante o desenvolvimento em placas de agar ou durante a vida adulta na cultura líquido.

Profiling isotópicas estáveis ​​de fluxo metabólico intermediário na fase de desenvolvimento e Adultos Caenorhabditis elegans

Profiling isotópicas estáveis de fluxo metabólico intermediário na fase de desenvolvimento e Adultos Caenorhabditis elegans