Questo lavoro è stato finanziato in parte dal National Institutes of Health (K08-DK073545 e NICHD sponsorizzato intellettuale e dello sviluppo della ricerca disabilità Center di New Investigator Award), la Fondazione Filadelfia, e la University of Pennsylvania premio McCabe (MJF), così come il Tristano Mullen Fondo (MJF e MY). I contenuti sono di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.

<ol>
	<li>Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C. elegans: A practical approach. , (1999).</li><li>Dingley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiratory+chain+dysfunction+variably+increases+oxidant+stress+in+Caenorhabditis+elegans.">Mitochondrial respiratory chain dysfunction variably increases oxidant stress in Caenorhabditis elegans.</a> Mitochondrion. 10, 125-136 (2010).</li><li>Jones, B. N., Gilligan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=o-Phthaldialdehyde+precolumn+derivatization+and+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography+of+polypeptide+hydrolysates+and+physiological+fluids.">o-Phthaldialdehyde precolumn derivatization and reversed-phase high-performance liquid chromatography of polypeptide hydrolysates and physiological fluids.</a> Journal of chromatography. 266, 471-482 (1983).</li><li>Falk, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+pathway+profiling+of+mitochondrial+respiratory+chain+mutants+in+C.+elegans.">Metabolic pathway profiling of mitochondrial respiratory chain mutants in C. elegans.</a> Molecular genetics and metabolism. 93, 388-397 (2008).</li><li>Yudkoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+in+vivo+ureagenesis+with+stable+isotopes.">Measuring in vivo ureagenesis with stable isotopes.</a> Molecular genetics and metabolism. 100, 37-41 (2010).</li><li>Tsang, W. Y., Sayles, L. C., Grad, L. I., Pilgrim, D. B., Lemire, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiratory+chain+deficiency+in+Caenorhabditis+elegans+results+in+developmental+arrest+and+increased+life+span.">Mitochondrial respiratory chain deficiency in Caenorhabditis elegans results in developmental arrest and increased life span.</a> J Biol Chem. 276, 32240-32246 (2001).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

L&#39;applicazione di spettrometria di massa per misurare l&#39;abbondanza isotopica in metaboliti intermediario offre un quadro meravigliosamente dettagliato dei critici cambiamenti biochimici 5. Qui, abbiamo predisposto protocolli dettagliati per sfruttare questa metodologia altamente sensibile e specifico per la valutazione del metabolismo flusso intermediario nel modello animale geneticamente versatile, C. elegans. Infatti, l&#39;alimentazione degli animali che vivono con isotopi stabili etichettati precursori metabolici (come il 13 C-glucosio) permette di comprendere romanzo in via di flusso intermediario metabolica quando si misura l&#39;arricchimento isotopico in metaboliti a valle. Abbiamo sviluppato una metodologia affidabile per ottenere un&#39;analisi robusta di flusso attraverso la glicolisi, il metabolismo del piruvato, e il ciclo degli acidi tricarbossilici. Ciò può essere realizzato sia in animali nutriti con isotopo stabile dai primi stadi larvali di sviluppo o all&#39;inizio del periodo post-mitotico adulti. Arricchimento isotopico in diverse specie metabolita può essere studiato insieme a tutto il profilo di acidi verme aminoacidi mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni, come descritto in precedenza 4, per determinare assoluto arricchimento isotopico in diverse specie di alanina verme libero, aspartato, glutammato e la glutammina. Infatti, i modelli coerenti di arricchimento isotopico si ottengono quando si misurano analiti di aminoacidi e acidi organici in aliquote da 1.000 a 2.000 giovani vermi adulti sincrono. Tale metodologia può discriminare sensibilmente il flusso anormale intermediario nucleare ceppi gene mitocondriale basato mutante rispetto al wild-type vermi. Questa tecnica ha un valore di indagare le alterazioni del flusso in specifiche vie biochimiche di rilevanza per comuni errori congeniti del metabolismo. In particolare, l&#39;utilizzazione del glucosio marcato con isotopi stabili informa flusso di carbonio attraverso vie metaboliche centrale di rilevanza per le malattie mitocondriali. Infatti, i nostri dati suggeriscono l&#39;applicazione di tale metodologia può sensibilmente discriminare flusso anomalo intermediario in un gene nucleare basato mitocondriale complesso subunità III ceppo mutante (isp-1 (qm150)) rispetto al wild-type vermi. E &#39;importante riconoscere che da quando l&#39;esposizione isotopiche è completato in un periodo di uno o più giorni, quantificati arricchimento isotopico rappresenta un &quot;steady state&quot; valore di arricchimento, piuttosto che il flusso quantificabile in un periodo di tempo definito come potrebbe essere determinato nella cella modelli basati su esposti a isotopo per un periodo di minuti per ore. Un altro potenziale limite di interrogare flusso percorso nel corso dello sviluppo dei nematodi si riferisce a diverse lunghezze di sviluppo larvale che si verificano in particolare i ceppi mutanti. Per esempio, molti gravi mutazioni mitocondriali sono noti per causare l&#39;arresto al terzo (L3) stadio larvale 6. Così, l&#39;analisi di incorporazione dell&#39;isotopo solo negli animali che sopravvivono fino all&#39;età adulta può non essere rappresentativo dell&#39;intera popolazione mutante. Tuttavia, questa metodologia potrebbe essere adattato per valutare l&#39;incorporazione isotopica in metaboliti intermediario in una fase specifica larvale (come L2) piuttosto che aspettare che gli animali per raggiungere lo stadio adulto. Allo stesso modo, gli animali che entrano stadio alternativo larvale conosciuto come dauer probabilmente hanno notevolmente modificato (probabilmente inferiore) rispetto al flusso metabolico animali che procedere direttamente attraverso i quattro stadi larvali. Studio futuro potrebbe essere effettuata anche per valutare direttamente l&#39;incorporazione isotopica negli animali fase dauer di differenti background genetico. Esponendo gli animali a isotopi stabili per un periodo di tempo fisso (qui, da 24 a 48 ore) inizio una volta raggiunto lo stadio animali giovani adulti (come specificato nel protocollo B) elimina l&#39;impatto della variabile periodi di sviluppo. Mentre 13 C-glucosio interroga solo la glicolisi, il metabolismo del piruvato e ciclo degli acidi tricarbossilici flusso, altri traccianti isotopici potrebbe essere valutata a interrogare flusso biochimico percorso attraverso altre vie di interesse nei nematodi. Per esempio, 15 N-glicina può essere utilizzato per valutare fatturato aminoacidi nei nematodi. Un&#39;altra potenziale limitazione di questo approccio è il livello di sensibilità di rilevazione metabolita. La nostra esperienza suggerisce un minimo di 500 nematodi giovani adulti hanno l&#39;obbligo di quantificare con successo incorporazione isotopica con i metodi HPLC e GC / MS impiegato qui. Uso di strumenti con maggiore sensibilità, come la cromatografia liquida ad ultra (UPLC), può permettere un&#39;ulteriore riduzione del numero di animali studiati, anche se prevediamo che questo è improbabile per consentire la quantificazione affidabile di metaboliti e incorporazione isotopica in specie metabolita da worm singolo. Abbiamo studiato le popolazioni verme di 1.000 animali per esperimento, che abbiamo trovato per rilevare in modo affidabile metaboliti abbondanza a basso contenuto di ogni ceppo. Tuttavia, alcuni metaboliti, come ad esempio GABA, non può che essere attendibilmente quantificati in popolazioni molto più grandi di nematodi, su ordine di1x10 6 animali 4. In sintesi, il profilo degli isotopi stabili fornisce un metodo non invasivo e sicuro (non radioattivo), approccio che è stato a lungo utilizzato per lo studio degli errori congeniti del metabolismo. L&#39;applicazione di questa metodologia a C. elegans romanzo fornisce la capacità di indagare in vivo e in tempo reale, alterazioni metaboliche che si verificano a livello di intero animale, che possono derivare da singole malattie genetiche e / o esposizioni agente farmacologico.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>S. basal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1 - page 59</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Cholesterol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C-8503</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>OP50 E. coli</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Protocols A and C</td>
</tr>
<tr>
<td>K12 E. coli</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>NGM agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Research Products INT</td>
<td>N81800-1000.0</td>
<td>Protocols A, B, and C</td>
</tr>
<tr>
<td>13C glucose (universally labeled)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cambridge Isotope labs</td>
<td>CLM-1396</td>
<td>Protocol A and C</td>
</tr>
<tr>
<td>13C glucose (1,6 labeled)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cambridge Isotope labs</td>
<td>CLM-2717</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>60% Perchloric acid (PCA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>MK2766500</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>&epsilon;-aminocaproic acid (Internal Standard)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A-2504</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>MTBSTFA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Regis</td>
<td>270243</td>
<td>Protocol E</td>
</tr>
<tr>
<td>Acetonitrile</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Regis</td>
<td>270010</td>
<td>Protocol E</td>
</tr>
<tr>
<td>AG 1-X8, 100-200, Chloride form resin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BIO-RAD</td>
<td>140-1441</td>
<td>Protocols A and B (organic acid extraction)</td>
</tr>
<tr>
<td>AG 50W-X8, 100-200, Hydrogen form resin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BIO-RAD</td>
<td>142-1441</td>
<td>Protocols A and B (amino acid extraction)</td>
</tr>
<tr>
<td>NaHCO3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S-8875</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>NaOH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S8045</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>3N HCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>320331</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>1N HCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>320331</td>
<td>Protocol A</td>
</tr>
<tr>
<td>0.1 N HCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>320331</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>4N NH4OH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>30501</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>4N KOH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>484016</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Deionized water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Milli Q Biocel</td>
<td>ZMQA60F01</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>Helium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Airgas</td>
<td>24001364</td>
<td>Protocol C2</td>
</tr>
<tr>
<td>SMZ-800 Zoom Stereo-Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NIKON</td>
<td>NI MNA41000</td>
<td>Protocols A, B, and C</td>
</tr>
<tr>
<td>pH meter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>S68167</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Table top centrifuge - 5804R</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>05-400-93</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Incubated platform shaker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New Brunswick</td>
<td>M1324-0004</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>Mini LabRoller Rotator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Labnet</td>
<td>H-5500</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Pestles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kontes</td>
<td>K749520-0090</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Drill</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kontes</td>
<td>K749540-0000</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>1 L glass beaker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>02-539P</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 L Erlenmeyer Flasks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>89000-368</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>25 mL Erlenmeyer Flasks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>89000-356</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>7ml round-bottom glass tubes + rubber stopper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>VT6431</td>
<td>Protocols A, B, and C1,C2</td>
</tr>
<tr>
<td>10 ml round-bottom glass tubes + rubber stopper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>VT6430</td>
<td>Protocol C2</td>
</tr>
<tr>
<td>Blue top tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Labco</td>
<td>438B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 ml conical plastic tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>14-959-49A</td>
<td>All protocols</td>
</tr>
<tr>
<td>1.5 ml microfuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>02-681-320</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Syringes (1 mL, 10 mL, 20 mL)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Medical</td>
<td>301025, 301029, 301031</td>
<td>Protocols C1 and C2</td>
</tr>
<tr>
<td>25 gauge needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>22-253-131</td>
<td>Protocols C1 and C2</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-Prep Chromatography Columns</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BIO-RAD</td>
<td>731-1550</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>Pasteur pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>14673-043</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>60mm Petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>25373-085</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass chamber (cut bottom of 1 L flask) fitted with grease-sealed 3-way stopcock</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom Made in Glass Shop</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>Optically transparent glass plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom Made in Glass Shop</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>Reacti-Vap III Evaporator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>18826</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>Cotton</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>14224-516</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>High Vacuum Grease</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>1597418</td>
<td>Protocol C1</td>
</tr>
<tr>
<td>Aluminum Foil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>01-213-18</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>Timer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ISC Bioexpress</td>
<td>T-2504-5</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>Gas-Ratio Mass Spectrometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermophinigan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>GC-MS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HP</td>
<td>5980/5971</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>GC-MS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>6980N/5973N</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>HPLC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Varian</td>
<td>9010</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

stable isotopic profiling of intermediary metabolic flux in developing and adult stage caenorhabditis elegans

Stabile profilazione isotopica è da tempo consentito indagini sensibile delle conseguenze metaboliche di mutazioni genetiche e / o terapie farmacologiche in modelli cellulari e mammiferi. Qui, descriviamo i metodi dettagliati per eseguire stabile profilazione isotopica del metabolismo intermedio e flusso metabolico nel nematode, Caenorhabditis elegans. I metodi sono descritti per il profiling intero verme amminoacidi liberi, anidride carbonica marcata, etichettato acidi organici, aminoacidi ed etichettato in animali esposti a isotopi stabili sia dal primo sviluppo su piastre di agar nematode terreni di coltura o dall&#39;inizio come giovani adulti, mentre esposti a vari trattamenti farmacologici in coltura liquida. Aminoacidi liberi sono quantificati mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) in aliquote verme estratto in tutto 4% acido perclorico. Universalmente etichettati 13 C-glucosio o 1,6 - 13 C 2-glucosio è utilizzato come precursore stabile isotopica di carbonio la cui etichetta è tracciata mediante spettrometria di massa di biossido di carbonio (sia atmosferiche e disciolti) così come in metaboliti indicativi del flusso attraverso la glicolisi , metabolismo del piruvato, e il ciclo degli acidi tricarbossilici. Risultati rappresentativi sono inclusi per dimostrare gli effetti del tempo isotopo esposizione, diversi protocolli di compensazione batterica, e di metodi alternativi interruzione verme nel wild-type nematodi, come pure l&#39;estensione relativa incorporazione isotopica nel complesso mitocondriale III vermi mutanti (isp-1 (qm150) ) rispetto al wild-type vermi. Applicazione di isotopi stabili profiling nei nematodi vivono fornisce una capacità nuova di indagare a livello di intero animale in tempo reale, alterazioni metaboliche che sono causati da malattie genetiche individuali e / o terapie farmacologiche.

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Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stabile mediante l&#39;analisi isotopica profilazione di massa gas-cromatografia spettrometria di flusso intermediario metabolica è descritto nel nematode,<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt;. I metodi sono specifici per la valutazione di arricchimento isotopico nel biossido di carbonio, acidi organici, aminoacidi e dopo l&#39;esposizione isotopo sia durante lo sviluppo su piastre di agar o durante l&#39;età adulta in coltura liquida.

Stabile Profiling isotopica di Flux Intermediario Metabolica in fase di sviluppo e per adulti Caenorhabditis elegans</em

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

stable-isotopic-profiling-intermediary-metabolic-flux-developing

Research

JoVE Journal

Biology

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

13.4K Views.  The Children's Hospital of Philadelphia. Stabile mediante l'analisi isotopica profilazione di massa gas-cromatografia spettrometria di flusso intermediario metabolica è descritto nel nematode, Caenorhabditis elegans. I metodi sono specifici per la valutazione di arricchimento isotopico nel biossido di carbonio, acidi organici, aminoacidi e dopo l'esposizione isotopo sia durante lo sviluppo su piastre di agar o durante l'età adulta in coltura liquida.