Diese Arbeit wurde zum Teil durch die National Institutes of Health (K08-DK073545 und NICHD geförderten Geistiges und Developmental Disabilities Research Center New Investigator Award), The Philadelphia Foundation und der University of Pennsylvania McCabe award (MJF), sowie die Tristan finanziert Mullen Fund (MJF und MY). Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Meinung von den National Institutes of Health.

<ol>
	<li>Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C. elegans: A practical approach. , (1999).</li><li>Dingley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiratory+chain+dysfunction+variably+increases+oxidant+stress+in+Caenorhabditis+elegans.">Mitochondrial respiratory chain dysfunction variably increases oxidant stress in Caenorhabditis elegans.</a> Mitochondrion. 10, 125-136 (2010).</li><li>Jones, B. N., Gilligan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=o-Phthaldialdehyde+precolumn+derivatization+and+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography+of+polypeptide+hydrolysates+and+physiological+fluids.">o-Phthaldialdehyde precolumn derivatization and reversed-phase high-performance liquid chromatography of polypeptide hydrolysates and physiological fluids.</a> Journal of chromatography. 266, 471-482 (1983).</li><li>Falk, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+pathway+profiling+of+mitochondrial+respiratory+chain+mutants+in+C.+elegans.">Metabolic pathway profiling of mitochondrial respiratory chain mutants in C. elegans.</a> Molecular genetics and metabolism. 93, 388-397 (2008).</li><li>Yudkoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+in+vivo+ureagenesis+with+stable+isotopes.">Measuring in vivo ureagenesis with stable isotopes.</a> Molecular genetics and metabolism. 100, 37-41 (2010).</li><li>Tsang, W. Y., Sayles, L. C., Grad, L. I., Pilgrim, D. B., Lemire, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiratory+chain+deficiency+in+Caenorhabditis+elegans+results+in+developmental+arrest+and+increased+life+span.">Mitochondrial respiratory chain deficiency in Caenorhabditis elegans results in developmental arrest and increased life span.</a> J Biol Chem. 276, 32240-32246 (2001).</li></ol>

Die Anwendung der Massenspektrometrie zur Isotopenhäufigkeit in Vermittler Metaboliten zu messen bietet ein wunderbar detailliertes Bild der kritischen biochemischen Veränderungen 5. Hier haben wir ausführliche Protokolle für die Nutzung dieses hochsensitive und spezifische Methode zur Vermittlung Stoffwechselflusses in den genetisch vielseitige Modell Tier, C. Beurteilung zur Verfügung gestellt elegans. In der Tat, Fütterung lebenden Tieren mit stabilen Isotopen markierte metabolischen Vorstufen (z. B. 13 C-Glucose) ermöglicht neuartige Einblicke in Vermittler Stoffwechselweg flux bei der Messung von Isotopen-Anreicherung in Downstream-Metaboliten. Wir haben zuverlässige Methode entwickelt, um robuste Analyse der Fluss durch die Glykolyse, Pyruvat-Metabolismus und der Tricarbonsäurezyklus erhalten. Dies kann sowohl in Tieren, die stabilen Isotope von Anfang larvalen Entwicklungsstadien oder Anfang in der post-mitotischen Erwachsenen Zeitraum erreicht werden. Isotopen-Anreicherung in verschiedenen Metaboliten Arten können in Verbindung mit ganzen Wurm freie Aminosäure Profilierung durch Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie untersucht werden, wie zuvor 4 beschrieben, um absolute Isotopenanreicherung in verschiedene Arten von freien Wurm Alanin, Aspartat, Glutamat und Glutamin zu bestimmen. In der Tat sind übereinstimmende Muster von Isotopen-Anreicherung erzielt, wenn die Messung Aminosäure und einer organischen Säure Analyten in Aliquots von 1.000 bis 2.000 junge Erwachsene synchrone Würmer. Diese Methodik kann sensibel diskriminieren abnormal Vermittler Fluss im nuklearen Gen-basierte mitochondrialen Mutanten gegenüber Wildtyp-Würmer. Diese Technik hält Wert flux Veränderungen in bestimmten biochemischen Stoffwechselwege von Relevanz zu untersuchen, um gemeinsame angeborene Stoffwechselstörungen. Insbesondere informiert die Verwertung von Glukose mit stabilen Isotopen markierte Kohlenstoffflusses durch zentrale Stoffwechselwege von Relevanz für mitochondriale Erkrankungen. In der Tat weisen unsere Daten Anwendung dieser Methodik können sensibel diskriminieren abnormal Vermittler flux in ein nukleares Gen-basierte mitochondrialen Komplex III-Untereinheit Mutante (isp-1 (qm150)) relativ zum Wildtyp-Würmer. Es ist wichtig zu erkennen, dass da Isotopen Exposition über einen Zeitraum von einem bis zu mehreren Tagen abgeschlossen ist, quantifiziert Isotopenanreicherung stellt einen &quot;steady state&quot; Bereicherung Wert als quantifizierbare Fluß über einen definierten Zeitraum als in zellbasierten Modellen ermittelt werden könnte ausgesetzt Isotop für einen Zeitraum von Minuten bis Stunden. Eine weitere mögliche Einschränkung der Abfrage Weg Fluss im Laufe der Nematoden Entwicklung betrifft die unterschiedlichen Längen der Entwicklung der Larven, die in bestimmten Mutanten auftreten. Zum Beispiel sind viele schwere mitochondriale Mutationen bekannt, Verhaftung in der dritten (L3) Larvenstadium 6 zu bewirken. So kann die Analyse von Isotopen-Satzung nur bei Tieren, die bis ins Erwachsenenalter überleben nicht repräsentativ für die gesamte Bevölkerung mutierte werden. Allerdings könnte diese Methodik angepasst Isotopen Einbindung in Vermittler Metaboliten zu untersuchen in einem bestimmten Larvenstadium (wie L2), anstatt zu warten für die Tiere der erwachsenen Stadium erreicht zu sein. Ebenso haben Tiere, die die alternative Larvenstadium als dauer bekannt geben dürfte wesentlich verändert (wahrscheinlich weniger) Stoffwechselflusses gegenüber Tieren, die direkt vor durch die vier Larvenstadien. Zukünftige Studien könnten auch durchgeführt werden, um direkt zu bewerten Isotopen Einbindung in dauer der Bühne Tiere verschiedener genetischer Herkunft sein. Offenlegen von Tieren zu stabilen Isotopen für einen festen Zeitraum (hier 24 bis 48 Stunden) zu Beginn einmal Tiere erreichten die jungen erwachsenen Stadium (wie in Protokoll B detailliert) beseitigt die Auswirkungen der variable Entwicklungszeiten. Während 13 C-Glucose nur fragt Glykolyse, Pyruvat-Metabolismus und Tricarbonsäurezyklus Fluss, könnten auch andere Isotopen-Tracer potenziell beurteilt zu biochemischen Weg Fluss durch andere Wege des Interesses in Nematoden verhören werden. Zum Beispiel könnte 15 N-Glycin verwendet werden, um Aminosäure Umsatz in Nematoden zu beurteilen. Eine weitere mögliche Einschränkung dieses Ansatzes ist der Grad der Empfindlichkeit der Metabolit-Erkennung. Unsere Erfahrung zeigt, ein Minimum von 500 jungen Erwachsenen Nematoden notwendig sind, um erfolgreich zu quantifizieren Isotopen Einbau durch die HPLC und GC / MS-Verfahren hier beschäftigt. Einsatz von Instrumenten mit höherer Empfindlichkeit, wie Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC), können gestatten, weitere Reduzierung der Anzahl Tiere untersucht, obwohl wir erwarten, dass dies unwahrscheinlich ist, um zuverlässige Quantifizierung von Metaboliten und Isotopen-Einbau in Metabolit Arten von einzelnen Würmern ermöglichen. Wir untersuchten Wurm Populationen von 1.000 Tiere pro Versuch, das fanden wir zuverlässig zu erkennen geringer Menge Metaboliten in jedem Stamm. Allerdings können manche Metaboliten, wie GABA, zuverlässig nur in viel größeren Populationen von Nematoden quantifiziert werden, in der Größenordnung von1x10 6 Tiere 4. Zusammenfassend liefert stabile Isotop Profilierung eine nicht-invasive und sichere (nicht-radioaktive) Ansatz, der seit langem eingesetzt, um angeborene Stoffwechselstörungen zu untersuchen. Die Anwendung dieser Methode auf C. elegans wurden die neuen Kapazitäten in vivo, in Echtzeit, metabolische Veränderungen, die auf das ganze Tier-Ebene auftreten, die von einzelnen genetisch bedingten Erkrankungen und / oder pharmakologischen Wirkstoff Engagements führen kann untersucht werden.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>S. basal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1 - page 59</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Cholesterol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C-8503</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>OP50 E. coli</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Protocols A and C</td>
</tr>
<tr>
<td>K12 E. coli</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>NGM agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Research Products INT</td>
<td>N81800-1000.0</td>
<td>Protocols A, B, and C</td>
</tr>
<tr>
<td>13C glucose (universally labeled)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cambridge Isotope labs</td>
<td>CLM-1396</td>
<td>Protocol A and C</td>
</tr>
<tr>
<td>13C glucose (1,6 labeled)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cambridge Isotope labs</td>
<td>CLM-2717</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>60% Perchloric acid (PCA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>MK2766500</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>&epsilon;-aminocaproic acid (Internal Standard)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A-2504</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>MTBSTFA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Regis</td>
<td>270243</td>
<td>Protocol E</td>
</tr>
<tr>
<td>Acetonitrile</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Regis</td>
<td>270010</td>
<td>Protocol E</td>
</tr>
<tr>
<td>AG 1-X8, 100-200, Chloride form resin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BIO-RAD</td>
<td>140-1441</td>
<td>Protocols A and B (organic acid extraction)</td>
</tr>
<tr>
<td>AG 50W-X8, 100-200, Hydrogen form resin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BIO-RAD</td>
<td>142-1441</td>
<td>Protocols A and B (amino acid extraction)</td>
</tr>
<tr>
<td>NaHCO3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S-8875</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>NaOH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S8045</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>3N HCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>320331</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>1N HCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>320331</td>
<td>Protocol A</td>
</tr>
<tr>
<td>0.1 N HCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>320331</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>4N NH4OH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>30501</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>4N KOH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>484016</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Deionized water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Milli Q Biocel</td>
<td>ZMQA60F01</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>Helium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Airgas</td>
<td>24001364</td>
<td>Protocol C2</td>
</tr>
<tr>
<td>SMZ-800 Zoom Stereo-Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NIKON</td>
<td>NI MNA41000</td>
<td>Protocols A, B, and C</td>
</tr>
<tr>
<td>pH meter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>S68167</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Table top centrifuge - 5804R</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>05-400-93</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Incubated platform shaker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New Brunswick</td>
<td>M1324-0004</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>Mini LabRoller Rotator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Labnet</td>
<td>H-5500</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Pestles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kontes</td>
<td>K749520-0090</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Drill</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kontes</td>
<td>K749540-0000</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>1 L glass beaker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>02-539P</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 L Erlenmeyer Flasks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>89000-368</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>25 mL Erlenmeyer Flasks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>89000-356</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>7ml round-bottom glass tubes + rubber stopper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>VT6431</td>
<td>Protocols A, B, and C1,C2</td>
</tr>
<tr>
<td>10 ml round-bottom glass tubes + rubber stopper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>VT6430</td>
<td>Protocol C2</td>
</tr>
<tr>
<td>Blue top tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Labco</td>
<td>438B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 ml conical plastic tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>14-959-49A</td>
<td>All protocols</td>
</tr>
<tr>
<td>1.5 ml microfuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>02-681-320</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Syringes (1 mL, 10 mL, 20 mL)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Medical</td>
<td>301025, 301029, 301031</td>
<td>Protocols C1 and C2</td>
</tr>
<tr>
<td>25 gauge needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>22-253-131</td>
<td>Protocols C1 and C2</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-Prep Chromatography Columns</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BIO-RAD</td>
<td>731-1550</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>Pasteur pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>14673-043</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>60mm Petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>25373-085</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass chamber (cut bottom of 1 L flask) fitted with grease-sealed 3-way stopcock</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom Made in Glass Shop</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>Optically transparent glass plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom Made in Glass Shop</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>Reacti-Vap III Evaporator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>18826</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>Cotton</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>14224-516</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>High Vacuum Grease</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>1597418</td>
<td>Protocol C1</td>
</tr>
<tr>
<td>Aluminum Foil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>01-213-18</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>Timer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ISC Bioexpress</td>
<td>T-2504-5</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>Gas-Ratio Mass Spectrometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermophinigan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>GC-MS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HP</td>
<td>5980/5971</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>GC-MS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>6980N/5973N</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>HPLC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Varian</td>
<td>9010</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

stable isotopic profiling of intermediary metabolic flux in developing and adult stage caenorhabditis elegans

Stabile Isotope Profiling ist seit langem sensitive Untersuchungen des metabolischen Konsequenzen der genetischen Mutationen und / oder pharmakologische Therapien in der Zell-und Säugetier-Modellen erlaubt. Hier beschreiben wir ausführlich Methoden zur stabilen Isotopen Profilierung der intermediären Stoffwechsel und Stoffwechselflusses in dem Fadenwurm Caenorhabditis elegans ausführen. Es werden Methoden zur Profilierung ganze Wurm freien Aminosäuren, markierte Kohlendioxid, markierten organischen Säuren und markierten Aminosäuren in Tiere ausgesetzt stabilen Isotopen entweder von der frühen Entwicklung von Nematoden Nährmedien Agarplatten oder Anfang als junge Erwachsene, während verschiedene pharmakologische Behandlungen ausgesetzt beschrieben in flüssiger Kultur. Freie Aminosäuren werden durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) in ganzen Wurm Aliquots in 4% iger Perchlorsäure extrahiert quantifiziert. Universell gekennzeichnet 13 C-Glucose-oder 1,6 - 13 C 2-Glucose als stabile Isotopen-Vorläufer, deren Bezeichnung Kohlenstoff wird durch Massenspektrometrie in Kohlendioxid (sowohl atmosphärisch und gelöst) sowie in Metaboliten bezeichnend für Fluss durch die Glykolyse zurückzuführen genutzt , Pyruvatstoffwechsels und die Tricarbonsäurezyklus. Repräsentative Ergebnisse sind enthalten, um Auswirkungen von Isotop Belichtungszeit, verschiedene bakterielle Clearing-Protokolle und alternative Wurm Aufschlussverfahren in Wildtyp-Nematoden zu demonstrieren, wie auch das relative Ausmaß der Isotopen-Aufnahme in der mitochondrialen Komplex III-Mutante Würmer (isp-1 (qm150) ) bezogen auf Wildtyp-Würmer. Anwendung von stabilen Isotopen Profilierung in lebenden Nematoden stellt eine neuartige Fähigkeit, auf das ganze Tier-Ebene in Echtzeit Stoffwechselveränderungen, die von einzelnen genetisch bedingten Erkrankungen und / oder pharmakologische Therapien verursacht wurden, sind zu untersuchen.

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Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stabile Isotope Profilierung mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie des Vermittlers Stoffwechselflusses ist in dem Fadenwurm beschrieben,<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt;. Es werden Methoden zur Beurteilung Isotopenanreicherung in Kohlendioxid, organische Säuren und Aminosäuren folgenden Isotop Exposition entweder während der Entwicklung auf Agarplatten oder im Erwachsenenalter in flüssiger Kultur beschrieben.

Stabilen Isotopen Profiling von Intermediary Metabolic Flux in Entwicklungs-und Erwachsenen-Stadium Caenorhabditis elegans</em

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

stable-isotopic-profiling-intermediary-metabolic-flux-developing

Research

JoVE Journal

Biology

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

13.4K Aufrufe.  The Children's Hospital of Philadelphia. Stabile Isotope Profilierung mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie des Vermittlers Stoffwechselflusses ist in dem Fadenwurm beschrieben, Caenorhabditis elegans. Es werden Methoden zur Beurteilung Isotopenanreicherung in Kohlendioxid, organische Säuren und Aminosäuren folgenden Isotop Exposition entweder während der Entwicklung auf Agarplatten oder im Erwachsenenalter in flüssiger Kultur beschrieben.