Ce travail a été financé en partie par le National Institutes of Health (K08-DK073545 et NICHD parrainé par la recherche intellectuelle et une déficience intellectuelle Centre bourse de nouveau), La Fondation de Philadelphie, et l&#39;Université de Pennsylvanie McCabe attribution (MJF), ainsi que le Tristan Mullen Fonds (MJF et MY). Le contenu est uniquement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles des instituts nationaux de la santé.

<ol>
	<li>Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C. elegans: A practical approach. , (1999).</li><li>Dingley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiratory+chain+dysfunction+variably+increases+oxidant+stress+in+Caenorhabditis+elegans.">Mitochondrial respiratory chain dysfunction variably increases oxidant stress in Caenorhabditis elegans.</a> Mitochondrion. 10, 125-136 (2010).</li><li>Jones, B. N., Gilligan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=o-Phthaldialdehyde+precolumn+derivatization+and+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography+of+polypeptide+hydrolysates+and+physiological+fluids.">o-Phthaldialdehyde precolumn derivatization and reversed-phase high-performance liquid chromatography of polypeptide hydrolysates and physiological fluids.</a> Journal of chromatography. 266, 471-482 (1983).</li><li>Falk, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+pathway+profiling+of+mitochondrial+respiratory+chain+mutants+in+C.+elegans.">Metabolic pathway profiling of mitochondrial respiratory chain mutants in C. elegans.</a> Molecular genetics and metabolism. 93, 388-397 (2008).</li><li>Yudkoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+in+vivo+ureagenesis+with+stable+isotopes.">Measuring in vivo ureagenesis with stable isotopes.</a> Molecular genetics and metabolism. 100, 37-41 (2010).</li><li>Tsang, W. Y., Sayles, L. C., Grad, L. I., Pilgrim, D. B., Lemire, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiratory+chain+deficiency+in+Caenorhabditis+elegans+results+in+developmental+arrest+and+increased+life+span.">Mitochondrial respiratory chain deficiency in Caenorhabditis elegans results in developmental arrest and increased life span.</a> J Biol Chem. 276, 32240-32246 (2001).</li></ol>

En appliquant la spectrométrie de masse pour mesurer l&#39;abondance isotopique en métabolites intermédiaires offre une image merveilleusement détaillée des changements biochimiques essentielles 5. Ici, nous avons fourni des protocoles détaillés pour exploiter cette méthodologie très sensible et spécifique pour évaluer le flux métaboliques intermédiaire dans le modèle animal génétiquement polyvalent, C. elegans. En effet, l&#39;alimentation des animaux qui vivent avec des isotopes stables étiquetés précurseurs métaboliques (comme le 13 C-glucose) permet un nouvel aperçu du flux voie intermédiaire métaboliques lors de la mesure d&#39;enrichissement isotopique des métabolites en aval. Nous avons développé une méthodologie fiable pour obtenir une solide analyse des flux à travers la glycolyse, le métabolisme du pyruvate, et le cycle de Krebs. Ceci peut être réalisé à la fois chez les animaux nourris des isotopes stables du début des larves des stades de développement ou le début de la période post-mitotiques pour adultes. L&#39;enrichissement isotopique de différentes espèces métabolite peut être étudiée en collaboration avec le ver gratuitement toute profilage des acides aminés par chromatographie liquide à haute performance, comme décrit précédemment 4, afin de déterminer absolue enrichissement isotopique dans différentes espèces de l&#39;alanine vers libre, l&#39;aspartate, le glutamate et la glutamine. En effet, les modèles compatibles d&#39;enrichissement isotopique sont obtenus lorsque l&#39;on mesure des acides aminés et acides organiques dans les analytes aliquotes de 1.000 à 2.000 jeunes vers adultes synchrone. Cette méthodologie peut discriminer sensibilité anormale du flux d&#39;intermédiaire dans le nucléaire basé sur les gènes mitochondriaux des souches mutantes par rapport aux vers de type sauvage. Cette technique a une valeur pour enquêter sur des altérations spécifiques de flux dans les voies biochimiques de la pertinence par rapport aux communes des erreurs innées du métabolisme. En particulier, l&#39;utilisation du glucose marqué avec des isotopes stables informe le flux de carbone à travers le centre des voies métaboliques de la pertinence d&#39;une maladie mitochondriale. En effet, nos données suggèrent l&#39;application d&#39;une telle méthodologie peut discriminer sensibilité anormale du flux d&#39;intermédiaire dans un réacteur nucléaire à base génétique sous-unité du complexe III mitochondrial souche mutante (ISP-1 (qm150)) par rapport à vers de type sauvage. Il est important de reconnaître que depuis l&#39;exposition isotopique est terminée sur une période de un à plusieurs jours, quantifiés enrichissement isotopique représente une valeur &quot;état stationnaire&quot; enrichissement plutôt que de flux quantifiables sur une période de temps définie, tels que fixés dans la cellule à base de modèles exposés à des isotopes pour une période de minutes à plusieurs heures. Une autre limite potentielle d&#39;interroger le flux voie au cours du développement des nématodes se rapporte à différentes longueurs du développement larvaire qui se produisent, en particulier les souches mutantes. Par exemple, beaucoup de graves mutations mitochondriales sont connus pour provoquer un arrêt lors de la troisième (L3) stade larvaire 6. Ainsi, l&#39;analyse de l&#39;incorporation d&#39;isotopes que chez les animaux qui survivent à l&#39;âge adulte peut ne pas être représentatifs de toute la population mutante. Toutefois, cette méthodologie pourrait être adaptée afin d&#39;évaluer l&#39;incorporation isotopique en métabolites intermédiaires à un stade larvaire spécifique (comme L2) plutôt que d&#39;attendre que les animaux d&#39;atteindre le stade adulte. De même, les animaux qui entrent dans le stade alternatif connu sous le nom de larves dauer probablement considérablement modifié (probablement inférieur) métaboliques flux relatif aux animaux qui procèdent directement à travers les quatre stades larvaires. Les futures études pourraient également être réalisées pour évaluer directement l&#39;incorporation isotopique des animaux étape dauer des différents fonds génétiques. Exposer les animaux à des isotopes stables pour une période déterminée (ici, 24 à 48 heures) en commençant une fois les animaux ont atteint le stade adulte jeune (comme détaillé dans le Protocole B) élimine l&#39;impact de la variable de périodes de développement. Alors que 13 C-glucose interroge seule la glycolyse, le métabolisme du pyruvate et de flux cycle de l&#39;acide tricarboxylique, d&#39;autres traceurs isotopiques pourraient être évalués à interroger le flux voie biochimique par d&#39;autres voies d&#39;intérêt chez les nématodes. Par exemple, 15 N-glycine pourrait être utilisé pour évaluer le chiffre d&#39;affaires d&#39;acides aminés dans les nématodes. Une autre limite potentielle de cette approche est le niveau de sensibilité de la détection de métabolites. Notre expérience suggère un minimum de 500 nématodes adultes jeunes sont requises pour mener à quantifier l&#39;incorporation isotopique par les méthodes HPLC et GC / MS employé ici. L&#39;utilisation d&#39;instruments avec une plus grande sensibilité, comme la chromatographie liquide ultra (UPLC), peut permettre une nouvelle réduction du nombre d&#39;animaux étudiés, même si nous pensons que ce n&#39;est probablement pas pour permettre une quantification fiable de métabolites et d&#39;incorporation isotopique en espèces de vers métabolite unique. Nous avons étudié les populations de vers de 1000 animaux par expérience, que nous avons trouvé détecter de façon fiable métabolites de faible abondance dans chaque souche. Cependant, certains métabolites, tels que le GABA, ne peuvent être quantifiés de manière fiable dans des populations beaucoup plus de nématodes, de l&#39;ordre de1x10 6 animaux 4. En résumé, le profilage des isotopes stables fournit un non-invasive et sûre (non radioactif) approche qui a longtemps été utilisé pour étudier les erreurs innées du métabolisme. L&#39;application de cette méthodologie à C. elegans fournit la capacité nouvelle pour examiner in vivo et en temps réel, des altérations métaboliques qui se produisent au niveau de l&#39;animal entier, qui peuvent résulter de différents troubles génétiques et / ou expositions agent pharmacologique.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>S. basal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1 - page 59</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Cholesterol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C-8503</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>OP50 E. coli</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Protocols A and C</td>
</tr>
<tr>
<td>K12 E. coli</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>NGM agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Research Products INT</td>
<td>N81800-1000.0</td>
<td>Protocols A, B, and C</td>
</tr>
<tr>
<td>13C glucose (universally labeled)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cambridge Isotope labs</td>
<td>CLM-1396</td>
<td>Protocol A and C</td>
</tr>
<tr>
<td>13C glucose (1,6 labeled)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cambridge Isotope labs</td>
<td>CLM-2717</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>60% Perchloric acid (PCA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>MK2766500</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>&epsilon;-aminocaproic acid (Internal Standard)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A-2504</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>MTBSTFA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Regis</td>
<td>270243</td>
<td>Protocol E</td>
</tr>
<tr>
<td>Acetonitrile</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Regis</td>
<td>270010</td>
<td>Protocol E</td>
</tr>
<tr>
<td>AG 1-X8, 100-200, Chloride form resin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BIO-RAD</td>
<td>140-1441</td>
<td>Protocols A and B (organic acid extraction)</td>
</tr>
<tr>
<td>AG 50W-X8, 100-200, Hydrogen form resin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BIO-RAD</td>
<td>142-1441</td>
<td>Protocols A and B (amino acid extraction)</td>
</tr>
<tr>
<td>NaHCO3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S-8875</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>NaOH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S8045</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>3N HCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>320331</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>1N HCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>320331</td>
<td>Protocol A</td>
</tr>
<tr>
<td>0.1 N HCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>320331</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>4N NH4OH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>30501</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>4N KOH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>484016</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Deionized water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Milli Q Biocel</td>
<td>ZMQA60F01</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>Helium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Airgas</td>
<td>24001364</td>
<td>Protocol C2</td>
</tr>
<tr>
<td>SMZ-800 Zoom Stereo-Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NIKON</td>
<td>NI MNA41000</td>
<td>Protocols A, B, and C</td>
</tr>
<tr>
<td>pH meter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>S68167</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Table top centrifuge - 5804R</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>05-400-93</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Incubated platform shaker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New Brunswick</td>
<td>M1324-0004</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>Mini LabRoller Rotator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Labnet</td>
<td>H-5500</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Pestles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kontes</td>
<td>K749520-0090</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Drill</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kontes</td>
<td>K749540-0000</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>1 L glass beaker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>02-539P</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 L Erlenmeyer Flasks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>89000-368</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>25 mL Erlenmeyer Flasks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>89000-356</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>7ml round-bottom glass tubes + rubber stopper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>VT6431</td>
<td>Protocols A, B, and C1,C2</td>
</tr>
<tr>
<td>10 ml round-bottom glass tubes + rubber stopper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>VT6430</td>
<td>Protocol C2</td>
</tr>
<tr>
<td>Blue top tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Labco</td>
<td>438B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 ml conical plastic tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>14-959-49A</td>
<td>All protocols</td>
</tr>
<tr>
<td>1.5 ml microfuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>02-681-320</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Syringes (1 mL, 10 mL, 20 mL)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Medical</td>
<td>301025, 301029, 301031</td>
<td>Protocols C1 and C2</td>
</tr>
<tr>
<td>25 gauge needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>22-253-131</td>
<td>Protocols C1 and C2</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-Prep Chromatography Columns</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BIO-RAD</td>
<td>731-1550</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>Pasteur pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>14673-043</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>60mm Petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>25373-085</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass chamber (cut bottom of 1 L flask) fitted with grease-sealed 3-way stopcock</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom Made in Glass Shop</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>Optically transparent glass plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom Made in Glass Shop</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>Reacti-Vap III Evaporator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>18826</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>Cotton</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>14224-516</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>High Vacuum Grease</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>1597418</td>
<td>Protocol C1</td>
</tr>
<tr>
<td>Aluminum Foil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>01-213-18</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>Timer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ISC Bioexpress</td>
<td>T-2504-5</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>Gas-Ratio Mass Spectrometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermophinigan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>GC-MS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HP</td>
<td>5980/5971</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>GC-MS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>6980N/5973N</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>HPLC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Varian</td>
<td>9010</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

stable isotopic profiling of intermediary metabolic flux in developing and adult stage caenorhabditis elegans

Stable profilage isotopique a longtemps permis d&#39;enquêtes sensibles sur les conséquences métaboliques de mutations génétiques et / ou thérapies pharmacologiques dans des modèles cellulaires et de mammifères. Ici, nous décrivons des méthodes détaillées pour effectuer stables profilage isotopique du métabolisme intermédiaire et flux métaboliques dans le nématode Caenorhabditis elegans. Les méthodes sont décrites pour le profilage de l&#39;ensemble vis des acides aminés libres, le dioxyde de carbone marqué, étiqueté acides organiques et des acides aminés marqués chez les animaux exposés à des isotopes stables soit de développement précoce de croissance sur des plaques d&#39;agar nématodes ou le début que les jeunes adultes tandis exposée à divers traitements pharmacologiques en culture liquide. Acides aminés libres sont quantifiés par chromatographie liquide haute performance (CLHP) en aliquots ver toute extraction dans l&#39;acide perchlorique à 4%. Universellement étiqueté 13 C-glucose ou 1,6 - 13 C 2-glucose est utilisé comme le précurseur des isotopes stables de carbone dont l&#39;étiquette est tracée par spectrométrie de masse de dioxyde de carbone (à la fois l&#39;atmosphère et dissous) ainsi que des métabolites indicatif de flux à travers la glycolyse , le métabolisme du pyruvate, et le cycle de Krebs. Les résultats représentatifs sont inclus pour démontrer les effets du temps d&#39;exposition d&#39;isotopes, divers protocoles de compensation bactériennes, et les méthodes alternatives perturbations ver de type sauvage nématodes, ainsi que l&#39;ampleur relative de l&#39;incorporation isotopique dans mitochondriale vers le complexe III mutant (ISP-1 (qm150) ) par rapport au type sauvage vers. Application de profilage isotopique stable en présence de nématodes vivants offre une capacité nouvelle pour examiner l&#39;ensemble des altérations au niveau du métabolisme des animaux en temps réel qui sont causées par des troubles individuels génétiques et / ou thérapies pharmacologiques.

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Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable profilage isotopique par analyse spectrométrique de masse chromatographie en phase gazeuse du flux métabolique intermédiaire est décrite dans le nématode,<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt;. Les méthodes sont détaillées pour évaluer l&#39;enrichissement isotopique en dioxyde de carbone, des acides organiques, acides aminés après une exposition pendant le développement d&#39;isotopes soit sur gélose ou durant l&#39;âge adulte dans la culture liquide.

Stable profilage isotopique du flux métabolique intermédiaire dans la phase de développement et de l&#39;adulte Caenorhabditis elegans</em

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

stable-isotopic-profiling-intermediary-metabolic-flux-developing

Research

JoVE Journal

Biology

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

13.4K vues.  The Children's Hospital of Philadelphia. Stable profilage isotopique par analyse spectrométrique de masse chromatographie en phase gazeuse du flux métabolique intermédiaire est décrite dans le nématode, Caenorhabditis elegans. Les méthodes sont détaillées pour évaluer l'enrichissement isotopique en dioxyde de carbone, des acides organiques, acides aminés après une exposition pendant le développement d'isotopes soit sur gélose ou durant l'âge adulte dans la culture liquide...