이 작품은 국립 보건원 (K08 - DK073545 및 NICHD 후원 지적 및 발달 장애 연구 센터 새로운 탐정 수상), 필라델피아 재단, 그리고 펜실베니아 맥카베 수상 대학 (MJF)뿐만 아니라 트리스탄에 의해 일부 자금되었습니다 멀런 기금 (MJF과 내). 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 대변하지 않습니다.

<ol>
	<li>Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C. elegans: A practical approach. , (1999).</li><li>Dingley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiratory+chain+dysfunction+variably+increases+oxidant+stress+in+Caenorhabditis+elegans.">Mitochondrial respiratory chain dysfunction variably increases oxidant stress in Caenorhabditis elegans.</a> Mitochondrion. 10, 125-136 (2010).</li><li>Jones, B. N., Gilligan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=o-Phthaldialdehyde+precolumn+derivatization+and+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography+of+polypeptide+hydrolysates+and+physiological+fluids.">o-Phthaldialdehyde precolumn derivatization and reversed-phase high-performance liquid chromatography of polypeptide hydrolysates and physiological fluids.</a> Journal of chromatography. 266, 471-482 (1983).</li><li>Falk, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+pathway+profiling+of+mitochondrial+respiratory+chain+mutants+in+C.+elegans.">Metabolic pathway profiling of mitochondrial respiratory chain mutants in C. elegans.</a> Molecular genetics and metabolism. 93, 388-397 (2008).</li><li>Yudkoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+in+vivo+ureagenesis+with+stable+isotopes.">Measuring in vivo ureagenesis with stable isotopes.</a> Molecular genetics and metabolism. 100, 37-41 (2010).</li><li>Tsang, W. Y., Sayles, L. C., Grad, L. I., Pilgrim, D. B., Lemire, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiratory+chain+deficiency+in+Caenorhabditis+elegans+results+in+developmental+arrest+and+increased+life+span.">Mitochondrial respiratory chain deficiency in Caenorhabditis elegans results in developmental arrest and increased life span.</a> J Biol Chem. 276, 32240-32246 (2001).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

중간 metabolites의 원소 풍요로움을 측정하기 위하여 질량 분광법을 적용하는 것은 중요한 생화 학적 변화 5 멋지고 상세한 내용을 파악할 수 있었죠. 여기, 우리는 유전적으로 다양한 모델 동물, C.의 중간 대사 유량을 평가하기 위해이 매우 민감하고 구체적인 방법론을 악용에 대한 자세한 절차를 제공 엘레간스. 사실, 안정 동위 원소 살아있는 동물을 먹이면 하류 metabolites의 원소 농축을 측정하면 신진 대사 엽 성의 전구 물질 (예 : C - 포도당 13 등) 중간 대사 경로 유량에 소설 통찰력을 허용 레이블. 우리는 작용, pyruvate 신진 대사 및 tricarboxylic 산성 순환 유량의 강력한 분석을 얻으려면 신뢰할 수있는 방법론을 개발했습니다. 이것은 초기 발달 단계에서 애벌레 안정 동위 원소를 먹은 동물이나 사후 mitotic 성인 시대의 시작을 모두 얻을 수 있습니다. 이전에 무료로 웜 알라닌, aspartate, 글루 탐 산염과 글루타민의 다른 수종에 절대 원소 농축을 결정하기 위해, 4 설명된대로 다른 신진 대사 종의 원소 농축은 고성능 액체 크로마 토그래피에 의해 전체 벌레 무료 아미노산 프로파일과 함께 공부하실 수 있습니다. 1000 2000 젊은 성인 동기 웜의 aliquots에서 아미노산과 유기산 analytes를 측정하면 실제로, 원소 농축의 일관된 패턴이 얻을 수 있습니다. 이러한 방법론 sensitively 야생 타입의 웜을 상대 핵 유전자 기반 mitochondrial 돌연변이 계통에 이상 중간 유량을 구별하실 수 있습니다. 이 기술은 일반적인 대사 타고난 오류 관련의 특정 생화 학적 경로의 유량 변경을 조사할 가치를 보유하고 있습니다. 특히, 안정 동위 원소와 함께 레이블 포도당의 이용은 mitochondrial 질병에 관련 중앙 대사 경로를 통해 탄소 유량을 알려줍니다. 사실, 우리의 데이터는 이러한 방법의 응용 프로그램이 sensitively 야생 형 웜을 상대 핵 유전자 기반 mitochondrial 복잡한 III subunit의 돌연변이 스트레인 (ISP - 1 (qm150))의 비정상적인 중간 유량을 구별 할 수 것이 좋습니다. 원소 노출이 며칠 하나의 기간 동안 완료 이후 그것은 셀 기반의 모델로 결정 수도로 계량 원소 농축 시간 정의된 기간 동안 &quot;정상 상태&quot;농축 가치보다는 같지는 유량을 대표 그렇게 인식하는 것이 중요합니다 시간 분 동안 동위 원소에 노출. 선충류 개발의 과정을 통해 경로 유량을 심문의 또 다른 잠재적인 제한은 특정 돌연변이 계통에서 발생하는 애벌레 개발의 길이를 서로 다른 관련이 있습니다. 예를 들어, 많은 심각한 mitochondrial 돌연변이가 세 번째 (L3) 애벌레 단계 6에서 체포를 일으키는 것으로 알려져 있습니다. 그러므로, 오직 성체로 생존 동물의 동위 원소의 설립 분석은 전체 인구의 돌연변이 대표되지 않을 수 있습니다. 그러나이 방법은 특정 애벌레 단계 (예 : L2 등)보다는 동물이 성인 무대에 도달하는 대기의 중간 metabolites의 원소 정관을 평가하기 위해 적응 수 있습니다. 마찬가지로, 가능성 dauer로 알려진 대체 애벌레 단계를 입력 동물 크게 네 개의 애벌레 단계를 통해 직접 진행 동물에 상대 (가능성이 낮은) 대사 플럭스 변경했습니다. 미래 연구는 직접 다른 유전 배경 dauer 단계 동물의 원소 정관을 평가하기 위해 수행 수 있습니다. 동물들이 젊은 성인 단계에 도달 한 번 시작 고정 기간 (여기서, 24-48시간)에 대한 안정 동위 원소에 동물을 노출하면 (같은 프로토콜 B에 설명된) 변수 발달 기간의 영향을 제거합니다. 13 C - 포도당은 해당 작용, 신진 대사 및 pyruvate tricarboxylic 산성주기 유량을 interrogates 있지만, 다른 원소 추적기는 잠재적 nematodes에 대한 관심의 다른 경로를 통해 생화 학적 경로 유량을 심문하러 평가 수 있습니다. 예를 들어, 15 N - 글리신은 nematodes의 아미노산 회전율을 평가하기 위해 활용 수 있습니다. 이 접근법의 또 다른 잠재적인 제한은 신진 대사의 검출 감도의 레벨입니다. 우리의 경험은 500 젊은 성인 nematodes 최소가 성공적으로 여기에 사용된 HPLC 및 GC / MS 방법으로 원소 정관를 정할 필요합니다 제안합니다. 같은 울트라 성능 액체 크로마 토그래피 (UPLC)와 같은 큰 감도와 악기를 사용, 우리는 이것이 하나의 벌레의 신진 대사 종에 metabolites과 원소 정관의 신뢰성 quantitation을 허용하지 않을 수 있습니다 예상하지만, 공부 동물 번호 더욱 감소를 허용 수 있습니다. 우리는 각 변형이 적은 어번던스 metabolites을 안정적으로 검출하는 것으로 실험 1,000 동물의 벌레 인구를 공부했습니다. 그러나, GABA 같은 metabolites는 단 안정의 순서에 nematodes의 훨씬 더 큰 인구에 계량 수1x10 6 동물 4. 요약, 안정 동위 원소 프로 파일링 오래 대사 타고난 오류를 공부하고 활용되어 비침습 및 안전 (비 방사성) 접근 방식을 제공합니다. C.이 방법의 응용 엘레간스 개별 유전자 장애 및 / 또는 pharmacologic 에이전트 노출에서 발생할 수 있습니다 생체내, 전체 동물 수준에서 발생하는 실시간 대사 변경에 조사를 소설 용량을 제공합니다.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>S. basal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1 - page 59</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Cholesterol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C-8503</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>OP50 E. coli</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Protocols A and C</td>
</tr>
<tr>
<td>K12 E. coli</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>NGM agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Research Products INT</td>
<td>N81800-1000.0</td>
<td>Protocols A, B, and C</td>
</tr>
<tr>
<td>13C glucose (universally labeled)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cambridge Isotope labs</td>
<td>CLM-1396</td>
<td>Protocol A and C</td>
</tr>
<tr>
<td>13C glucose (1,6 labeled)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cambridge Isotope labs</td>
<td>CLM-2717</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>60% Perchloric acid (PCA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>MK2766500</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>&epsilon;-aminocaproic acid (Internal Standard)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A-2504</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>MTBSTFA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Regis</td>
<td>270243</td>
<td>Protocol E</td>
</tr>
<tr>
<td>Acetonitrile</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Regis</td>
<td>270010</td>
<td>Protocol E</td>
</tr>
<tr>
<td>AG 1-X8, 100-200, Chloride form resin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BIO-RAD</td>
<td>140-1441</td>
<td>Protocols A and B (organic acid extraction)</td>
</tr>
<tr>
<td>AG 50W-X8, 100-200, Hydrogen form resin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BIO-RAD</td>
<td>142-1441</td>
<td>Protocols A and B (amino acid extraction)</td>
</tr>
<tr>
<td>NaHCO3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S-8875</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>NaOH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S8045</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>3N HCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>320331</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>1N HCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>320331</td>
<td>Protocol A</td>
</tr>
<tr>
<td>0.1 N HCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>320331</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>4N NH4OH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>30501</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>4N KOH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>484016</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Deionized water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Milli Q Biocel</td>
<td>ZMQA60F01</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>Helium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Airgas</td>
<td>24001364</td>
<td>Protocol C2</td>
</tr>
<tr>
<td>SMZ-800 Zoom Stereo-Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NIKON</td>
<td>NI MNA41000</td>
<td>Protocols A, B, and C</td>
</tr>
<tr>
<td>pH meter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>S68167</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Table top centrifuge - 5804R</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>05-400-93</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Incubated platform shaker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New Brunswick</td>
<td>M1324-0004</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>Mini LabRoller Rotator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Labnet</td>
<td>H-5500</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Pestles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kontes</td>
<td>K749520-0090</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Drill</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kontes</td>
<td>K749540-0000</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>1 L glass beaker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>02-539P</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 L Erlenmeyer Flasks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>89000-368</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>25 mL Erlenmeyer Flasks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>89000-356</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>7ml round-bottom glass tubes + rubber stopper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>VT6431</td>
<td>Protocols A, B, and C1,C2</td>
</tr>
<tr>
<td>10 ml round-bottom glass tubes + rubber stopper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>VT6430</td>
<td>Protocol C2</td>
</tr>
<tr>
<td>Blue top tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Labco</td>
<td>438B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 ml conical plastic tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>14-959-49A</td>
<td>All protocols</td>
</tr>
<tr>
<td>1.5 ml microfuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>02-681-320</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Syringes (1 mL, 10 mL, 20 mL)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Medical</td>
<td>301025, 301029, 301031</td>
<td>Protocols C1 and C2</td>
</tr>
<tr>
<td>25 gauge needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>22-253-131</td>
<td>Protocols C1 and C2</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-Prep Chromatography Columns</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BIO-RAD</td>
<td>731-1550</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>Pasteur pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>14673-043</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>60mm Petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>25373-085</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass chamber (cut bottom of 1 L flask) fitted with grease-sealed 3-way stopcock</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom Made in Glass Shop</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>Optically transparent glass plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom Made in Glass Shop</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>Reacti-Vap III Evaporator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>18826</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>Cotton</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>14224-516</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>High Vacuum Grease</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>1597418</td>
<td>Protocol C1</td>
</tr>
<tr>
<td>Aluminum Foil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>01-213-18</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>Timer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ISC Bioexpress</td>
<td>T-2504-5</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>Gas-Ratio Mass Spectrometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermophinigan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>GC-MS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HP</td>
<td>5980/5971</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>GC-MS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>6980N/5973N</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>HPLC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Varian</td>
<td>9010</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

stable isotopic profiling of intermediary metabolic flux in developing and adult stage caenorhabditis elegans

안정 원소 프로파일 오래 유전 변이 및 / 또는 세포와 포유 동물 모델 pharmacologic 요법의 대사 결과 민감한 조사를 허용하고 있습니다. 여기서 우리는 선충류, Caenorhabditis 엘레간스의 중간 신진 대사와 신진 대사 플럭스 안정 원소 프로파일을 수행하는 자세한 방법을 설명합니다. 방법은 다양한 pharmacologic 치료에 노출하는 동안 젊은 성인과 같은 선충류 성장 미디어 한천 플레이트 또는 시작에 초기 개발에서 두 안정 동위 원소에 노출 동물에서 전체 벌레 무료 아미노산, 표시 이산화탄소, 라벨 유기 지방산, 그리고 라벨 아미노산을 프로파일에 대해 설명되어 있습니다 액체 문화 인치 무료 아미노산은 4퍼센트 perchloric 산이 추출한 전체 웜 aliquots에서 고성능 액체 크로마 토그래피 (HPLC)에 의해 계량입니다. 보편적으로 13 C - 포도당 또는 1,6 표시 - 13 C 2 - 포도당은 누구의 표시 탄소 이산화탄소의 질량 분석계 (대기 및 해산 모두)뿐만 아니라 작용을 통해 흐름을 나타내는 metabolites으로 추적할 수있는 안정 원소 전구체로 사용된다 , pyruvate 신진 대사 및 tricarboxylic 산성주기. 대표 결과 (ISP - 1 (qm150) mitochondrial 복잡한 III 돌연변이 벌레의 원소 법인뿐만 아니라 상대적인 범위, 야생 타입 nematodes의 동위 원소 노출 시간의 효과, 각종 세균의 거래 프로토콜 및 대체 웜 중단 방법을 보여주는 포함되어 있습니다 ) 야생 형 벌레에 대한 상대. 생활 nematodes 안정 원소 프로파일 링의 응용 프로그램이 개별 유전자 장애 및 / 또는 pharmacologic 치료로 인해 발생하는 모든 동물 레벨 실시간 신진 대사 변경에 조사를 소설 용량을 제공합니다.

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Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

중간 신진 대사 유량의 가스 크로마 토그래피 질량 spectrometric 분석하여 안정 원소 프로파일은 선충류에 설명되어 있습니다<em&gt; Caenorhabditis 엘레간스</em&gt;. 방법은 이산화탄소, 유기 지방산과 한천 플레이트의 개발 중 또는 액체 문화에서 성인 중에 하나 동위 원소 노출에 따라 아미노산의 원소 농축을 평가에 대한 자세한 있습니다.

개발하고 성인 단계에서 중개 신진 대사 플럭스 안정 원소 프로파일 Caenorhabditis 엘레간스</em

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

stable-isotopic-profiling-intermediary-metabolic-flux-developing

Research

JoVE Journal

Biology

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

13.4K 조회수.  The Children's Hospital of Philadelphia. 중간 신진 대사 유량의 가스 크로마 토그래피 질량 spectrometric 분석하여 안정 원소 프로파일은 선충류에 설명되어 있습니다 Caenorhabditis 엘레간스. 방법은 이산화탄소, 유기 지방산과 한천 플레이트의 개발 중 또는 액체 문화에서 성인 중에 하나 동위 원소 노출에 따라 아미노산의 원소 농축을 평가에 대한 자세한 있습니다.