En este experimento, las células C2C12 mioblastos se sembraron a una densidad dada en placas de cultivo celular Seahorse. El consumo de oxígeno basal (OCR) y las tasas de acidificación extracelular (ECAR) se miden para determinar las tasas de referencia. 1. Inyección de células Las células son metabólicamente perturbada por tres adiciones de diferentes compuestos (en la sucesión) que cambian el perfil bioenergético de la célula. Un grupo será el control, con el funcionamiento de los medios de comunicación añadido como el control de &quot;compuestos&quot;. <ol><li> La primera inyección se oligomicina. Oligomicina inhibe la síntesis de ATP por el bloqueo del canal de protones de la parte F sintetasa o ATP (complejo V). En la investigación mitocondrial, que se utiliza para prevenir el estado 3 (fosforilación) la respiración. Con las células, que puede ser utilizado para distinguir el porcentaje de consumo de O2 dedicado a la síntesis de ATP y el porcentaje de consumo de O2 necesarios para superar la pérdida natural de protones a través de la membrana mitocondrial interna. </li><li> La segunda inyección se FCCP. FCCP (cianuro de carbonilo-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone) es un ionóforo que es un portador de iones móviles. Se trata de un agente de desacoplamiento, ya que altera la síntesis de ATP por el transporte de iones de hidrógeno a través de la membrana mitocondrial en lugar del canal de protones de la ATP sintasa (complejo V). Este colapso del potencial de membrana mitocondrial conduce a un rápido consumo de energía y oxígeno sin la generación de ATP. En este caso, tanto OCR y ECAR aumentará, debido al desacoplamiento de OCR, y ECAR como el intento de las células para mantener su balance de energía mediante el uso de la glucólisis para generar ATP. FCCP tratamiento se puede utilizar para calcular el &quot;repuesto&quot; la capacidad respiratoria de las células que se define como la diferencia cuantitativa entre el máximo y el OCR no controlada inicial OCR basal. Se ha propuesto que el mantenimiento de cierta capacidad respiratoria, incluso en condiciones de máxima estímulo fisiológico o fisiopatológico es un factor importante que define la vitalidad y / o supervivencia de las células. La capacidad de las células a responder al estrés en las condiciones de la demanda de energía se incrementa en gran parte influenciada por la capacidad bioenergética de la mitocondria. Esta capacidad bioenergética es determinada por varios factores, incluyendo la capacidad de la célula para ofrecer soporte a la mitocondria y la capacidad funcional de las enzimas implicadas en el transporte de electrones </li><li> En la tercera inyección, la rotenona, un inhibidor de Complejo I, se añade a las células. Esto se apagará la respiración mitocondrial y permitirá a ambas las fracciones mitocondrial y no mitocondrial-que contribuyen a la respiración que se calcula. Se observará una disminución de la OCR, debido a la función mitocondrial alterada, con un aumento concomitante de la ECAR que la célula se desplaza hacia un estado más glucolítico con el fin de mantener su balance energético La rotenona es un inhibidor mitocondrial que impide la transferencia de electrones desde el centro Fe-S en el Complejo I de la ubiquinona (coenzima Q). Esta inhibición del complejo I evita que la energía potencial de NADH se convierte en energía utilizable en forma de ATP. </li></ol> 2. Reactivos y materiales <ol><li> Oligomicina, FCCP, y las soluciones de rotenona (Seahorse Estrés Mito Test Kit) </li><li> Ejecución de los medios DMEM (Seahorse # 100965-000) </li><li> DMSO (Sigma D8418) </li><li> Agua destilada (Gibco 15230-170) </li><li> Tampón de calibración (Seahorse Bioscience) </li></ol> 3. El crecimiento medio <ol><li> 500 ml de DMEM (Gibco 11965-092) </li><li> 10% de SFB (Hyclone SH90070.03) </li><li> 5 ml Penn / estreptomicina (Gibco 15140-122) </li><li> 5 ml de piruvato de sodio (Sigma S8636) </li><li> 5 ml Glutamax (Gibco 35050-061) </li></ol> 4. La siembra de Protocolo <ol><li> Se siembran las células en cultivos de células XF96 placas con 10.000 células / pocillo en 100 L de medio de cultivo y se coloca en 37 ° C incubadora con 10% de CO 2. </li><li> Las células se adhieren a la placa de la célula XF96 cultura dentro de 1 hora. </li><li> Las células de ensayo en XF96 24 horas después de la siembra. </li></ol> 5. Preparación de la plantilla de ensayo <ol><li> Utilizando el Asistente de ensayo (Anexo I), generar una plantilla con el diseño del siguiente grupo: <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Cuadrícula de diseño bien la identificación de las asignaciones de columna y el grupo </li></ol> 6. Preparación de compuestos <ol><li> Preparar los siguientes compuestos en XF DMEM ensayo medios de comunicación de la siguiente manera: 10 oligomicina uM, 30,0 uM FCCP, 20,0 M rotenona, Estas concentraciones representan la dilución de 10 veces que se hizo cuando los compuestos se inyecta en el pozo. Las concentraciones de trabajo son: 1 oligomicina uM, 3,0 uM FCCP, rotenona 2.0 M </li></ol> 7. Medios de cambio y de preparación de células <ol&gt; <li> Coloque la placa de la célula en la Estación de preparación XF </li><li> Ajuste el volumen final del medio a 160 l por pocillo. </li><li> Incubar a 37 ° C incubadora sin CO 2 durante 60 minutos para permitir que las células pre-equilibrio con el medio de ensayo. </li></ol> 8. Sensor de carga del cartucho <ol><li> Compuestos caliente a 37 ° C antes de la carga del cartucho del sensor y la carga de los compuestos en los puertos de inyección de la siguiente manera: <ol><li> Columnas 1-4: Cargar 16, 18 y 20 l de XF ensayo medios de comunicación (DMEM) en los puertos A, B y C, respectivamente. </li><li> Columnas 5-12: Carga de 16 l de oligomicina en los puertos de A Cargar 18 L de FCCP en los puertos B Carga de 20 l de la rotenona en los puertos C </li></ol></li></ol> 9. Comandos del Protocolo <table border="1"><tbody><tr><td> Comando </td><td> Tiempo (min) </td><td> Puerto </td></tr><tr><td> Calibrar </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Equilibrar </td><td></td><td></td></tr><tr><td> De inicio de bucle </td><td> 3X </td><td></td></tr><tr><td> Mezcla </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Esperar </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Medida </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Loop End </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Inyectar </td><td></td><td> A </td></tr><tr><td> De inicio de bucle </td><td> 2X </td><td></td></tr><tr><td> Mezcla </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Esperar </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Medida </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Inyectar </td><td></td><td> B </td></tr><tr><td> De inicio de bucle </td><td> 2X </td><td></td></tr><tr><td> Mezcla </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Esperar </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Medida </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Inyectar </td><td></td><td> C </td></tr><tr><td> De inicio de bucle </td><td> 2X </td><td></td></tr><tr><td> Mezcla </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Esperar </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Medida </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Final </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 1. Protocolo de comandos

<ol>
	<li>Choi, W. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+analysis+of+isolated+cerebrocortical+nerve+terminals+on+a+microgram+scale:+spare+respiratory+capacity+and+stochastic+mitochondrial+failure.">Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure.</a> J Neurochem. 109, 1179-1191 (2009).</li><li>Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+bioenergetic+reserve+capacity+in+response+to+cardiomyocyte+stress+induced+by+4-hydroxynonenal.">Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal.</a> Biochem J. 424, 99-107 (2009).</li><li>Liu, J., Cao, L., Chen, J., Song, S., Lee, I. H., Quijano, C., Liu, H., Keyvanfar, K., Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmi1+regulates+mitochondrial+function+and+the+DNA+damage+response+pathway.">Bmi1 regulates mitochondrial function and the DNA damage response pathway.</a> Nature. , 459-7245 (2009).</li><li>Malmgren, S., Nicholls, D. G., Taneera, J., Bacos, K., Koeck, T., Tamaddon, A., Wibom, R., Groop, L., Ling, C., Mulder, H., Sharoyko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+coupling+between+glucose+and+mitochondrial+metabolism+in+clonal+beta-cells+is+required+for+robust+insulin+secretion.">Tight coupling between glucose and mitochondrial metabolism in clonal beta-cells is required for robust insulin secretion.</a> J Biol Chem. 284, 32395-32404 (2009).</li><li>Dranka, B. P., Hill, B. G., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reserve+capacity+in+endothelial+cells:+The+impact+of+nitric+oxide+and+reactive+oxygen+species.">Mitochondrial reserve capacity in endothelial cells: The impact of nitric oxide and reactive oxygen species.</a> Free Radic Biol Med. 48, 905-914 (2010).</li><li>Perez, J., Hill, B. G., Benavides, G. A., Dranka, B. P., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cellular+bioenergetics+in+smooth+muscle+cell+proliferation+induced+by+platelet-derived+growth+factor.">Role of cellular bioenergetics in smooth muscle cell proliferation induced by platelet-derived growth factor.</a> Biochem J. 428, 255-267 (2010).</li><li>Mor&#225;n, M., Rivera, H., S&#225;nchez-Arag&#243;, M., Bl&#225;zquez, A., Merinero, B., Ugalde, C., Arenas, J., Cuezva, J. M., Mart&#237;n, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+bioenergetics+and+dynamics+interplay+in+complex+I-deficient+fibroblasts.">Mitochondrial bioenergetics and dynamics interplay in complex I-deficient fibroblasts.</a> Biochim Biophys Acta. , 1802-185 (2010).</li><li>C&#225;rdenas, C., Miller, R. A., Smith, I., Bui, T., Molg&#243;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+regulation+of+cell+bioenergetics+by+constitutive+InsP3+receptor+Ca2++transfer+to+mitochondria.">Essential regulation of cell bioenergetics by constitutive InsP3 receptor Ca2+ transfer to mitochondria.</a> Cell. , 142-142 (2010).</li></ol>

Min Wu, por Bo Jensen, George W. Rogers, y David A. Ferrick son empleados de Seahorse Bioscience, que produce los reactivos y los instrumentos que aparecen en este artículo.

Este ensayo se deriva del experimento clásico para probar la función mitocondrial y sirve como marco de referencia para crear experimentos más complejos destinados a comprender los diversos cambios en el metabolismo celular, la función mitocondrial, y la bioenergética en general. Todos los compuestos utilizados en este experimento deben ser optimizados para la concentración que proporciona el máximo efecto. Es decir, uno debe llevar a cabo experimentos separados de valoración para determinar estos valores. Esto es especialmente importante con FCCP, como la curva de valoración tiende a ser bastante fuerte, y FCCP demasiado en realidad puede disminuir las respuestas de OCR. Rangos típicos (concentraciones finales) para poner a prueba sería la siguiente: <ul><li> 0,1 a 1,0 ug / ml de oligomicina </li><li> 0,1 a 5,0 uM FCCP </li><li> 0,1 a 1,0 uM rotenona </li></ul> Tenga en cuenta que las respuestas a cada compuesto anterior (especialmente FCCP) se verá influido por la composición de ensayo de los medios de comunicación (tipo base, [glucosa], [piruvato], la presencia / ausencia de BSA, etc.) Además, si el ensayo de los medios de comunicación XF composición se modifica la optimización será necesario volver a realizar. La presencia y concentración de piruvato es especialmente importante en la obtención de la capacidad respiratoria máxima debido a FCCP. Seahorse Bioscience ha observado en una serie de líneas de células que la omisión de piruvato anula la capacidad de las células a responder al máximo (por encima de línea de base) para FCCP. Por lo general, las concentraciones de piruvato 1-10 mm debe ser probado para entender la concentración óptima de piruvato para obtener la respiración máxima. Tenga en cuenta que [piruvato] Y [glucosa] puede ser necesario &quot;cross-titulada&quot; para obtener las condiciones óptimas para los medios de comunicación el experimento. Los resultados típicos de este experimento se presentan a continuación en un gráfico que muestra OCR en función del tiempo y otra que muestra el tiempo frente a ECAR: <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. OCR frente a tiempo <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. ECAR frente a tiempo Aquí observamos las respuestas esperadas en OCR y ECAR ya que las células se tratan con cada compuesto sucesivas. Para oligomicina, OCR disminuye como resultado de bloqueo de la síntesis de ATP mitocondrial en el Complejo V. Dado que las células son incapaces de sintetizar ATP a través de la fosforilación oxidativa, vuelven a la glicólisis para satisfacer su demanda de ATP, por lo que se observa un aumento de la ECAR. Como se indica anteriormente, FCCP actúa como un agente de desacoplamiento. Dado que las células deben ahora superar la pérdida de protones a través de la membrana mitocondrial interna, OCR aumenta significativamente a medida que más se consume O2 para bombear el exceso de protones al otro lado de la membrana mitocondrial. Por último, la rotenona inhibe la mitocondria del complejo I y III Complex, respectivamente, lo que hace que el flujo de electrones a cesar en la cadena de transporte de electrones, y por lo tanto el consumo de O2 se reduce drásticamente. <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Respiración parámetros Más allá de los cambios esperados en la respiración y la ECAR, una serie de parámetros respiratorios pueden ser obtenidos a partir de estos datos. Esto se resume en la figura anterior: Aquí vemos que podemos obtener información acerca de la respiración basal de las células, el porcentaje de consumo de O2 dedicada a la producción de ATP, así como el monto destinado a mantener el gradiente de protones (H + debido a la fuga). Además, podemos obtener el máximo de la frecuencia respiratoria en condiciones de respiración desacoplada (a veces conocido como la capacidad respiratoria de repuesto) y, finalmente, podemos determinar la cantidad de consumo de O2 no se debe a los procesos de las mitocondrias. Un creciente número de estudios que utilizan este perfil mitocondrial para evaluar la bioenergética celular, identificar la disfunción mitocondrial y para predecir la capacidad de las células a responder al estrés y / o insultos. Para más información y detalles acerca de este método experimental y la idea de la capacidad respiratoria de repuesto, consulte refieren a las siguientes publicaciones 1-8.

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Oligomycin, FCCP, Rotenone and Antimycin A Solutions</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Seahorse Bioscience</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Seahorse Mito Stress Test Kit</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM Running Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Seahorse Bioscience</td>
<td>100965-000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMSO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D8418</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Distilled Water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>15230-170</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Calibration buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Seahorse Bioscience</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

bioenergetic profile experiment using c2c12 myoblast cells

La capacidad de medir el metabolismo celular y comprender la disfunción mitocondrial, ha permitido a los científicos de todo el mundo para avanzar en su investigación en la comprensión del papel de la función mitocondrial en la obesidad, la toxicidad de la diabetes, el envejecimiento, el cáncer, la función cardiovascular y la seguridad. El metabolismo celular es el proceso de asimilación del sustrato, tales como oxígeno, glucosa, ácidos grasos, y la glutamina, y la conversión de energía posterior a través de una serie de oxidación enzimática controlada y las reacciones de reducción. Estos resultados reacciones bioquímicas intracelulares en la producción de ATP, la liberación de los subproductos de calor y productos químicos, como el lactato y CO 2 en el medio extracelular. Información valiosa sobre el estado fisiológico de las células, y la alteración del estado de las células, se puede obtener a través de la medición de la tasa de oxígeno consumido por las células, un indicador de la respiración mitocondrial - La tasa de consumo de oxígeno - o OCR. Las células también generar ATP a través de la glucólisis, es decir: la conversión de glucosa a lactato, independiente de oxígeno. En los pozos de cultivo, el lactato es la principal fuente de protones. La medición del ácido láctico producido indirectamente a través de los protones liberados en el medio extracelular que rodea las células, lo que provoca la acidificación del medio proporciona la velocidad de acidificación extracelular - o ECAR. En este experimento, las células C2C12 mioblastos se sembraron a una densidad dada en placas de cultivo celular Seahorse. El consumo de oxígeno basal (OCR) y las tasas de acidificación extracelular (ECAR) se miden para determinar las tasas de referencia. Las células son metabólicamente perturbada por tres adiciones de diferentes compuestos (en la sucesión) que cambian el perfil bioenergético de la célula. Este ensayo se deriva de un experimento clásico para evaluar las mitocondrias y sirve como un marco con el cual construir experimentos más complejos destinados a comprender la función tanto fisiológicas y fisiopatológicas de la mitocondria y para predecir la capacidad de las células a responder al estrés y / o insultos.

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Bioenergetic Profile Experiment using C2C12 Myoblast Cells

Una descripción de un método para crear perfiles de la función mitocondrial en las células se proporciona. El perfil de las mitocondrias generan proporciona cuatro parámetros de la función mitocondrial que se puede medir en un experimento: la tasa de respiración basal, la respiración ATP-linked, fuga de protones, y la capacidad de reserva.

Experimento perfil bioenergético utilizando células C2C12 mioblastos

The ability to measure cellular metabolism and understand mitochondrial dysfunction, has enabled scientists worldwide to advance their research in ...

bioenergetic-profile-experiment-using-c2c12-myoblast-cells

Research

JoVE Journal

Biology

50.2K vistas.  Novato, CA. Una descripción de un método para crear perfiles de la función mitocondrial en las células se proporciona. El perfil de las mitocondrias generan proporciona cuatro parámetros de la función mitocondrial que se puede medir en un experimento: la tasa de respiración basal, la respiración ATP-linked, fuga de protones, y la capacidad de reserva.

Video: Bioenergetic Profile Experiment using C2C12 Myoblast Cells

Testing Nicotine Tolerance in Aphids Using an Artificial Diet Experiment

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well know to have insecticidal properties. One response of tobacco plants to herbivory, or being gnawed upon by insects, is to increase the production of this neurotoxic alkaloid. Here, we will demonstrate how to set up an experiment to address this question of whether a tobacco-adapted strain of the green peach aphid, Myzus persicae, can tolerate higher levels of nicotine than the a strain of this insect that does not infest tobacco in the field.

In this video and assay is demonstrated that tests the tolerance of nicotine to two types of aphids one that infests tobacco plants in the field and one that does not.

Prueba de tolerancia a la nicotina en los áfidos El uso de un experimento de una dieta artificial

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well ...

Investigación

Biología

Morris Water Maze Experiment

The Morris water maze is widely used to study spatial memory and learning. Animals are placed in a pool of water that is colored opaque with powdered non-fat milk or non-toxic tempera paint, where they must swim to a hidden escape platform. Because they are in opaque water, the animals cannot see the platform, and cannot rely on scent to find the escape route. Instead, they must rely on external/extra-maze cues. As the animals become more familiar with the task, they are able to find the platform more quickly. Developed by Richard G. Morris in 1984, this paradigm has become one of the "gold standards" of behavioral neuroscience.

The Morris water maze is a well-accepted tool used to document the involvement of the hippocampus in a behavioral task.

Agua Morris laberinto Experimento

The Morris water maze is widely used to study spatial memory and learning. Animals are placed in a pool of water that is colored opaque with powdered ...

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase or the elongation phase by a variety of cellular stresses such as amino acid starvation or growth factor withdrawal. Alternatively, translation of individual mRNAs can be regulated by mRNA localization or the presence of cognate microRNAs. Studies of protein synthesis frequently utilize polyribosome analysis to shed light on the mechanisms of translation regulation or defects in protein synthesis. In this assay, mRNA/ribosome complexes are isolated from eukaryotic cells.  A sucrose density gradient separates mRNAs bound to multiple ribosomes known as polyribosomes from mRNAs bound to a single ribosome or monosome. Fractionation of the gradients allows isolation and quantification of the different ribosomal populations and their associated mRNAs or proteins. Differences in the ratio of polyribosomes to monosomes under defined conditions can be indicative of defects in either translation initiation or elongation/termination. Examination of the mRNAs present in the polyribosome fractions can reveal whether the cohort of individual mRNAs being translated changes with experimental conditions. In addition, ribosome assembly can be monitored by analysis of the small and large ribosomal subunit peaks which are also separated by the gradient. In this video, we present a method for the preparation of crude ribosomal extracts from yeast cells, separation of the extract by sucrose gradient and interpretation of the results.  This procedure is readily adaptable to mammalian cells.

This article describes a protocol for the extraction of translating ribosomes from eukaryotic cells. Once extracted, ribosomes are separated into monosomes and polyribosomes by sucrose gradient fractionation to allow different ribosomal populations to be analyzed. As such, this method is the gold standard for examining the regulation of translation.

Análisis eucariotas perfil Polyribosome

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Análisis del perfil metabólico de embriones de pez cebra

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Inducción y Análisis de epitelial a mesenquimal de transición

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem cells of skeletal muscle, the myogenic precursor cells (MPCs), have proven indispensible to our understanding of mammalian skeletal muscle development and growth. Particularly among the basal taxa of Vertebrata, however, data are limited describing the molecular mechanisms controlling the self-renewal, proliferation, and differentiation of MPCs. Of particular interest are potential mechanisms that underlie the ability of basal vertebrates to undergo considerable postlarval skeletal myofiber hyperplasia (i.e.&#160;teleost fish) and full regeneration following appendage loss (i.e.&#160;urodele amphibians). Additionally, the use of cultured myoblasts could aid in the understanding of regeneration and the recapitulation of the myogenic program and the differences between them. To this end, we describe in detail a robust and efficient protocol (and variations therein) for isolating and maintaining MPCs and their progeny, myoblasts and immature myotubes, in cell culture as a platform for understanding the evolution of the myogenic program, beginning with the more basal vertebrates. Capitalizing on the model organism status of the zebrafish (Danio rerio), we report on the application of this protocol to small fishes of the cyprinid clade Danioninae. In tandem, this protocol can be utilized to realize a broader comparative approach by isolating MPCs from the Mexican axolotl (Ambystomamexicanum) and even laboratory rodents. This protocol is now widely used in studying myogenesis in several fish species, including rainbow trout, salmon, and sea bream1-4.

In vitro culture systems have proven indispensible to our understanding of vertebrate myogenesis. However, much remains to be learned about nonmammalian skeletal muscle development and growth, particularly in basal taxa. An efficient and robust protocol for isolating the adult stem cells of this tissue, the myogenic precursor cells (MPCs), and maintaining their self-renewal, proliferation, and differentiation in a primary culture setting allows for the identification of conserved and divergent regulatory mechanisms throughout the vertebrate lineages.

Preparación de Primaria Myogenic precursor de célula / cultivos de mioblastos de basales Vertebrados Linajes

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and composed of mature enterocytes, goblet cells and enteroendocrine cells; and crypts, residing proximal to the submucosa and the muscularis, harboring adult stem and progenitor cells and mature Paneth cells, as well as stromal and immune cells of the crypt microenvironment. Until the last few years, in vitro studies of small intestine was limited to cell lines derived from either benign or malignant tumors, and did not represent the physiology of normal intestinal epithelia and the influence of the microenvironment in which they reside. Here, we demonstrate a method adapted from Sato et al. (2009) for culturing primary mouse intestinal crypt organoids derived from C57BL/6 mice. In addition, we present the use of crypt organoid cultures to assay the crypt metabolic profile in real time by measurement of basal oxygen consumption, glycolytic rate, ATP production and respiratory capacity. Organoids maintain properties defined by their source and retain aspects of their metabolic adaptation reflected by oxygen consumption and extracellular acidification rates. Real time metabolic studies in this crypt organoid culture system are a powerful tool to study crypt organoid energy metabolism, and how it can be modulated by nutritional and pharmacological factors.

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Small intestinal crypt organoids cultured ex vivo provide a tissue culture system that recapitulates growth of crypts dependent on stem cells and their niche. We established a method to assay the metabolic profile in real time in primary mouse crypt organoids. We found organoids maintain physiological properties defined by their source.

Bienes Análisis Tiempo de perfil metabólico en<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culturas ratón intestinal Cripta organoides

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nefrotoxina Microinyección en pez cebra para modelar la lesión renal aguda

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC) are the recently discovered modified cytosine bases produced by enzymatic oxidation of 5mC, whose biological functions remain relatively obscure. A number of approaches ranging from biochemical to antibody based techniques have been employed to study the genomic distribution and global content of these modifications in various biological systems. Although some of these approaches can be useful for quantitative assessment of these modified forms of 5mC, most of these methods do not provide any spatial information regarding the distribution of these DNA modifications in different cell types, required for correct understanding of their functional roles. Here we present a highly sensitive method for immunochemical detection of the modified forms of cytosine. This method permits co-detection of these epigenetic marks with protein lineage markers and can be employed to study their nuclear localization, thus, contributing to deciphering their potential biological roles in different experimental contexts.

Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.

La detección de formas modificadas de la citosina Uso Sensitive Inmunohistoquímica

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Una interfaz gráfica de usuario para el seguimiento asistido por software de la concentración de proteínas en protones dinámicos celulares

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...