في هذه التجربة ، هي خلايا المصنف myoblast C2C12 في مناطق ذات كثافة معينة في لوحات فرس البحر ثقافة الخلية. ويتم قياس استهلاك الأوكسجين القاعدية (OCR) وخارج الخلية تحمض المعدلات (ECAR) لتحديد معدلات الأساس. 1. حقن الخلايا هي عملية الأيض في الخلايا بالقلق قبل ثلاثة الإضافات للمركبات مختلفة (على التوالي) التي تحول ملف الطاقة البيولوجية للخلية. ومجموعة واحدة بمثابة السيطرة ، مع تشغيل وسائل الاعلام وأضاف بأنه &quot;مركبات&quot; السيطرة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحقنة الأولى oligomycin. Oligomycin يثبط تخليق ATP عن طريق منع القناة من بروتون سينسيز فهرنهايت بطولة الجزء (V مجمع). في مجال البحوث الميتوكوندريا ، يتم استخدامه لمنع الدولة 3 (phosphorylating) التنفس. مع الخلايا ، ويمكن استخدامه للتمييز بين نسبة استهلاك O2 المكرسة لتركيب ATP ونسبة استهلاك O2 المطلوبة للتغلب على تسرب بروتون الطبيعي عبر غشاء الميتوكوندريا الداخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> والثاني هو حقن FCCP. FCCP (الكربونيل السيانيد - P - trifluoromethoxyphenylhydrazone) هو ionophore التي هي الناقل أيون المحمول. وهي وكيل لأنه يعطل uncoupling التجميعي للاعبي التنس المحترفين عن طريق نقل أيونات الهيدروجين عبر الغشاء الميتوكوندريا بدلا من قناة بروتون من سينسيز اعبي التنس المحترفين (V مجمع). هذا الانهيار المحتمل للغشاء الميتوكوندريا يؤدي الى استهلاك سريع للطاقة والأوكسجين دون توليد ATP. في هذه الحالة ، سيقوم كل من التعرف الضوئي على الحروف وECAR الزيادة ، بسبب uncoupling OCR ، وكما ECAR الخلايا محاولة للحفاظ على التوازن في مجال الطاقة باستخدام تحلل لتوليد ATP. ويمكن استخدام العلاج FCCP لحساب &quot;غيار&quot; قدرة الجهاز التنفسي من الخلايا التي يتم تعريفها على أنها الفرق بين الكمية القصوى غير المنضبط OCR التعرف الضوئي على الحروف الأولية والقاعدية. وقد اقترح أن المحافظة على القدرات التنفسية بعض الغيار حتى في ظل ظروف القصوى التحفيز الفيزيولوجية المرضية في جسم المريض ، أو هو أحد العوامل الرئيسية التي تحدد حيوية و / أو البقاء على قيد الحياة من الخلايا. قدرة الخلايا على الاستجابة للإجهاد في ظل ظروف من زيادة الطلب على الطاقة هو في جزء كبير تتأثر قدرة الطاقة البيولوجية من الميتوكوندريا. هذه القدرة هي ردع الطاقة البيولوجية ، الذي تستخرجه عدة عوامل ، بما في ذلك قدرة الخلايا على توفير الركيزة إلى الميتوكوندريا والقدرة الفنية للأنزيمات تشارك في نقل الإلكترون </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حقن الثالثة ، يضاف روتينون ، مثبط أنا المعقدة ، إلى الخلايا. هذا وسوف تغلق التنفس الميتوكوندريا وتمكين كل من الكسور الميتوكوندريا الميتوكوندريا وعدم المساهمة في التنفس يتم حسابها. وسوف نلاحظ واحدة انخفاضا في OCR بسبب ضعف وظيفة الميتوكوندريا ، مع ما يصاحب ذلك زيادة في ECAR باعتبارها الخلية تتحول إلى حالة أكثر في حال السكر من أجل الحفاظ على التوازن في مجال الطاقة روتينون الميتوكوندريا هو المانع الذي يحول دون انتقال الإلكترونات من وسط الحديد - S في مجمع يوبيكوينون الأول (الإنزيم س). هذا تثبيط مجمع ابن يمنع الطاقة الكامنة في NADH من تحويلها الى طاقة قابلة للاستخدام في شكل ATP. </li></ol> 2. الكواشف والمواد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Oligomycin ، FCCP ، والحلول روتنون (فرس البحر اختبار الإجهاد ميتو كيت) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DMEM تشغيل الوسائط (فرس البحر # 100965-000) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DMSO (سيغما D8418) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماء المقطر (Gibco 15230-170) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معايرة العازلة (فرس البحر العلوم البيولوجية) </li></ol> 3. نمو متوسطة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 500 مل DMEM (Gibco 11965-092) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 ٪ FBS (Hyclone SH90070.03) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 مل بنسلفانيا / بكتيريا (Gibco 15140-122) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 مل البيروفات الصوديوم (سيغما S8636) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 مل Glutamax (Gibco 35050-061) </li></ol> 4. بذر البروتوكول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هي المصنفة الخلايا في خلية XF96 الثقافات مع لوحات 10000 خلية / ميكرولتر جيدا في 100 متوسطة النمو وضعت في الحاضنة 37 درجة مئوية مع ثاني أكسيد الكربون بنسبة 10 ٪ 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسوف تلتزم الخلايا إلى لوحة خلية ثقافة XF96 في حدود 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مقايسة الخلايا في ال 24 ساعة XF96 بعد البذر. </li></ol> 5. إعداد قالب الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفحص باستخدام معالج (الملحق الأول) ، إنشاء قالب مع تخطيط المجموعة التالية : <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. تخطيط الشبكة حسنا تحديد العمود ومجموعة تعيينات </li></ol> 6. مجمع التحضير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعداد المركبات التالية في الفحص XF DMEM الإعلام على النحو التالي : 10 Oligomycin UM ، UM FCCP 30.0 ، 20.0 روتنون ميكرومتر ، وتمثل هذه التركيزات التخفيف 10X أنه سيتم بذل عندما يتم حقن هذه المركبات في البئر. تركيزات العمل هي : 1 Oligomycin UM ، 3.0 أوقية FCCP ، 2.0 ميكرومتر روتنون </li></ol> 7. وسائل الإعلام ، وإعداد تغيير الخلية <oل&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان لوحة الخلية في المحطة الاعدادية XF </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين الحجم النهائي من المتوسط ​​إلى 160 ميكرولتر لكل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان في 37 درجة مئوية دون حاضنة CO 2 لمدة 60 دقيقة للسماح للخلايا مع فحص ما قبل يوازن المتوسطة. </li></ol> 8. تحميل خرطوشة الاستشعار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المركبات الحارة الى 37 درجة مئوية قبل التحميل خرطوشة استشعار وتحميل المركبات في منافذ حاقن على النحو التالي : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأعمدة 1-4 : تحميل 16 ، 18 ، و 20 ميكرولتر من XF الفحص وسائل الإعلام (DMEM) إلى منافذ A ، B و C ، على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أعمدة 5-12 : تحميل 16 ميكرولتر من Oligomycin في الموانئ A تحميل 18 ميكرولتر من FCCP باء في الموانئ تحميل 20 ميكرولتر من روتنون في الموانئ C </li></ol></li></ol> 9. أوامر بروتوكول <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> أمر </td><td> الوقت (دقيقة) </td><td> المنفذ </td></tr><tr><td> معايرة </td><td></td><td></td></tr><tr><td> وازن </td><td></td><td></td></tr><tr><td> حلقة ابدأ </td><td> 3X </td><td></td></tr><tr><td> مزيج </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> انتظر </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> قياس </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> نهاية الحلقة </td><td></td><td></td></tr><tr><td> حقن </td><td></td><td> A </td></tr><tr><td> حلقة ابدأ </td><td> 2X </td><td></td></tr><tr><td> مزيج </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> انتظر </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> قياس </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> حقن </td><td></td><td> B </td></tr><tr><td> حلقة ابدأ </td><td> 2X </td><td></td></tr><tr><td> مزيج </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> انتظر </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> قياس </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> حقن </td><td></td><td> C </td></tr><tr><td> حلقة ابدأ </td><td> 2X </td><td></td></tr><tr><td> مزيج </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> انتظر </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> قياس </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> نهاية </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> الجدول 1. أوامر البروتوكول

<ol>
	<li>Choi, W. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+analysis+of+isolated+cerebrocortical+nerve+terminals+on+a+microgram+scale:+spare+respiratory+capacity+and+stochastic+mitochondrial+failure.">Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure.</a> J Neurochem. 109, 1179-1191 (2009).</li><li>Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+bioenergetic+reserve+capacity+in+response+to+cardiomyocyte+stress+induced+by+4-hydroxynonenal.">Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal.</a> Biochem J. 424, 99-107 (2009).</li><li>Liu, J., Cao, L., Chen, J., Song, S., Lee, I. H., Quijano, C., Liu, H., Keyvanfar, K., Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmi1+regulates+mitochondrial+function+and+the+DNA+damage+response+pathway.">Bmi1 regulates mitochondrial function and the DNA damage response pathway.</a> Nature. , 459-7245 (2009).</li><li>Malmgren, S., Nicholls, D. G., Taneera, J., Bacos, K., Koeck, T., Tamaddon, A., Wibom, R., Groop, L., Ling, C., Mulder, H., Sharoyko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+coupling+between+glucose+and+mitochondrial+metabolism+in+clonal+beta-cells+is+required+for+robust+insulin+secretion.">Tight coupling between glucose and mitochondrial metabolism in clonal beta-cells is required for robust insulin secretion.</a> J Biol Chem. 284, 32395-32404 (2009).</li><li>Dranka, B. P., Hill, B. G., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reserve+capacity+in+endothelial+cells:+The+impact+of+nitric+oxide+and+reactive+oxygen+species.">Mitochondrial reserve capacity in endothelial cells: The impact of nitric oxide and reactive oxygen species.</a> Free Radic Biol Med. 48, 905-914 (2010).</li><li>Perez, J., Hill, B. G., Benavides, G. A., Dranka, B. P., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cellular+bioenergetics+in+smooth+muscle+cell+proliferation+induced+by+platelet-derived+growth+factor.">Role of cellular bioenergetics in smooth muscle cell proliferation induced by platelet-derived growth factor.</a> Biochem J. 428, 255-267 (2010).</li><li>Mor&#225;n, M., Rivera, H., S&#225;nchez-Arag&#243;, M., Bl&#225;zquez, A., Merinero, B., Ugalde, C., Arenas, J., Cuezva, J. M., Mart&#237;n, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+bioenergetics+and+dynamics+interplay+in+complex+I-deficient+fibroblasts.">Mitochondrial bioenergetics and dynamics interplay in complex I-deficient fibroblasts.</a> Biochim Biophys Acta. , 1802-185 (2010).</li><li>C&#225;rdenas, C., Miller, R. A., Smith, I., Bui, T., Molg&#243;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+regulation+of+cell+bioenergetics+by+constitutive+InsP3+receptor+Ca2++transfer+to+mitochondria.">Essential regulation of cell bioenergetics by constitutive InsP3 receptor Ca2+ transfer to mitochondria.</a> Cell. , 142-142 (2010).</li></ol>

مين وو ، لكل جنسن بو ، جورج دبليو روجرز ، وديفيد Ferrick ألف من العاملين في العلوم البيولوجية فرس البحر ، والتي تنتج الأجهزة والكواشف واردة في هذه المقالة.

ويستمد هذا الاختبار من التجربة الكلاسيكية للتحقيق في وظيفة الميتوكوندريا ويخدم كإطار التي لبناء تجارب أكثر تعقيدا تهدف إلى فهم مختلف التغيرات في التمثيل الغذائي للخلية ، وظيفة الميتوكوندريا والطاقة الحيوية بشكل عام. وينبغي أن يكون الأمثل جميع المركبات المستخدمة في هذه التجربة من أجل التركيز الذي يوفر تأثير القصوى. وهذا هو ، يجب على المرء أن إجراء تجارب للتأكد من معايرة منفصلة هذه القيم. وهذا أمر مهم خصوصا مع FCCP ، ومنحنى المعايرة يميل إلى أن يكون حادا جدا ، والكثير من FCCP يمكن أن تقلل في الواقع الردود في التعرف الضوئي على الحروف. ويتراوح نموذجي (تركيزات النهائي) لاختبار ما يلي : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0،1-1،0 ميكروغرام / مل من Oligomycin </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0،1-5،0 UM FCCP </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0،1-1،0 روتنون UM </li></ul> علما أنه سيتم أثرت في الردود على كل مجمع أعلاه (وخاصة FCCP) من قبل وسائل الاعلام مقايسة التكوين (النوع الأساسي ، [الجلوكوز] ، [البيروفات] ، وجود / غياب جيش صرب البوسنة ، الخ). علاوة على ذلك ، إذا تم تغيير التركيبة XF مقايسة وسائل الاعلام ، وسوف تحتاج إلى التحسين يعاد تنفيذها. وجود وتركيز البيروفات مهم بشكل خاص في الحصول على القدرات التنفسية القصوى بسبب FCCP. وقد لاحظ فرس البحر العلوم البيولوجية في عدد من خطوط الخلايا التي إغفال البيروفات يلغي قدرة الخلايا على الاستجابة إلى الحد الأقصى (فوق خط الأساس) لFCCP. عادة ، يجب اختبار تركيزات البيروفات ملي 10-10 لفهم تركيز الأمثل للحصول على التنفس البيروفات القصوى. علما بأن [البيروفات] و [الجلوكوز] قد تحتاج إلى أن يكون &quot;عبر معاير&quot; للحصول على أفضل الشروط وسائل الاعلام عن التجربة. وتعرض نتائج هذه التجربة النموذجية أدناه في الرسم البياني يظهر OCR مقابل مرة وآخر مرة يظهر مقابل ECAR : <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2 دوام مقابل OCR <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3 دوام مقابل ECAR لاحظ هنا أننا الردود المتوقعة في التعرف الضوئي على الحروف وECAR كما يتم التعامل مع الخلايا مع كل مجمع المتعاقبة. لoligomycin ، OCR النقصان نتيجة لعرقلة التوليف اعبي التنس المحترفين في مجمع الميتوكوندريا خامسا منذ الخلايا غير قادرة على تجميع ATP عبر OXPHOS ، فإنها تعود إلى تحلل لتلبية مطلبهم لاعبي التنس المحترفين ، وبالتالي فإننا نلاحظ زيادة في ECAR. كما هو موضح سابقا ، FCCP كوكيل uncoupling. منذ الآن يجب أن تتغلب على الخلايا تسرب بروتون عبر غشاء الميتوكوندريا الداخلية ، والتعرف الضوئي على الحروف بشكل ملحوظ كما استهلكت أكثر O2 ضخ البروتونات الزائدة عبر غشاء الميتوكوندريا. أخيرا ، أنا روتينون يمنع مجمع مجمع الميتوكوندريا والثالث ، على التوالي ، والذي يسبب تدفق الالكترونات توقف في سلسلة نقل الإلكترون ، وبذلك يتم خفض كبير في استهلاك O2. <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4. التنفس المعلمات ما وراء التغيرات المتوقعة في التنفس وECAR ، قد حصلت على عدد من المعلمات الجهاز التنفسي من هذه البيانات. وتتلخص هذه في الشكل أعلاه : هنا نرى أننا قد الحصول على معلومات حول التنفس القاعدية من الخلايا ، في المئة من استهلاك O2 المكرسة لإنتاج ATP فضلا عن المبلغ المخصص لصيانة التدرج بروتون (بسبب تسرب + H). كذلك ، قد نحصل على معدل التنفس في ظل الظروف القصوى للتنفس uncoupled (يشار إليه أحيانا على القدرات التنفسية كما الغيار) ، وأخيرا ، يمكننا تحديد كمية استهلاك O2 لا يرجع الى عمليات الميتوكوندريا. وهناك عدد متزايد من الدراسات وبسرعة توظيف هذا الملف الميتوكوندريا لتقييم الطاقة الحيوية الخلوية ، وتحديد الخلل الميتوكوندريا والتنبؤ قدرة الخلايا على الاستجابة للإجهاد و / أو الشتائم. لمزيد من المعلومات والتفاصيل حول هذا الأسلوب التجريبي وفكرة قدرة الجهاز التنفسي الغيار ، يرجى الرجوع إلى رؤية المنشورات التالية 1-8.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Oligomycin, FCCP, Rotenone and Antimycin A Solutions</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Seahorse Bioscience</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Seahorse Mito Stress Test Kit</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM Running Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Seahorse Bioscience</td>
<td>100965-000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMSO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D8418</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Distilled Water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>15230-170</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Calibration buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Seahorse Bioscience</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

bioenergetic profile experiment using c2c12 myoblast cells

وقد أتاح القدرة على قياس وفهم الأيض الخلوي الخلل الميتوكوندريا ، والعلماء في جميع أنحاء العالم لتطوير الأبحاث في فهم دور وظيفة الميتوكوندريا في البدانة ، والسكري ، والشيخوخة والسرطان والقلب والأوعية الدموية وظيفة سلامة السمية. الأيض الخلوي هو عملية امتصاص الركيزة ، مثل الأوكسجين والجلوكوز والأحماض الدهنية ، والجلوتامين ، وبعد تحويل الطاقة من خلال سلسلة من الأكسدة وردود الفعل للرقابة إنزيمي التخفيض. هذه الخلايا نتيجة التفاعلات الكيميائية الحيوية في إنتاج ATP ، والإفراج عن الحرارة والمشتقات الكيميائية ، مثل اللاكتات وCO 2 في البيئة خارج الخلية. معرفة ثاقبة الحالة الفسيولوجية للخلايا ، وتغيير للدولة من تلك الخلايا ، ويمكن المكتسبة من خلال قياس نسبة الأوكسجين المستهلكة من قبل الخلايا ، وهو مؤشر للتنفس الميتوكوندريا -- معدل استهلاك الأوكسجين -- أو OCR. توليد الخلايا أيضا من خلال تحلل ATP ، أي : تحويل الجلوكوز لاكتات ومستقلة من الأوكسجين. مثقف في الآبار ، اللاكتات هي المصدر الرئيسي للبروتونات. قياس حامض اللبنيك المنتجة غير مباشر عن طريق البروتونات التي يتم إطلاقها في المتوسط ​​خارج الخلية التي تحيط الخلايا ، والذي يسبب تحمض على المديين المتوسط ​​ويوفر معدل التحمض خارج الخلوي -- أو ECAR. في هذه التجربة ، هي خلايا المصنف myoblast C2C12 في مناطق ذات كثافة معينة في لوحات فرس البحر ثقافة الخلية. ويتم قياس استهلاك الأوكسجين القاعدية (OCR) وخارج الخلية تحمض المعدلات (ECAR) لتحديد معدلات الأساس. ثم يتم التمثيل الغذائي للخلايا بالقلق قبل ثلاثة الإضافات للمركبات مختلفة (على التوالي) التي تحول ملف الطاقة البيولوجية للخلية. ويستمد هذا الاختبار من التجربة الكلاسيكية لتقييم الميتوكوندريا ويخدم كإطار التي لبناء تجارب أكثر تعقيدا تهدف إلى فهم وظيفة كل من فيزيولوجي والفسيولوجية المرضية من الميتوكوندريا والتنبؤ قدرة الخلايا على الاستجابة للإجهاد و / أو الشتائم.

Watch this Scientific Journal Video about Bioenergetic Profile Experiment using C2C12 Myoblast Cells at JoVE.com

Bioenergetic Profile Experiment using C2C12 Myoblast Cells

وتقدم وصفا لطريقة لتوصيف وظيفة الميتوكوندريا في الخلايا. ملف الميتوكوندريا ولدت يوفر أربعة معلمات وظيفة الميتوكوندريا التي يمكن قياسها في تجربة واحدة : القاعدية معدل التنفس ، والتنفس ATP المرتبطة ، تسرب بروتون ، وقدرة احتياطية.

الطاقة البيولوجية التجربة الملف باستخدام الخلايا Myoblast C2C12

The ability to measure cellular metabolism and understand mitochondrial dysfunction, has enabled scientists worldwide to advance their research in ...

bioenergetic-profile-experiment-using-c2c12-myoblast-cells

Research

JoVE Journal

Biology

50.2K Views.  Novato, CA. وتقدم وصفا لطريقة لتوصيف وظيفة الميتوكوندريا في الخلايا. ملف الميتوكوندريا ولدت يوفر أربعة معلمات وظيفة الميتوكوندريا التي يمكن قياسها في تجربة واحدة : القاعدية معدل التنفس ، والتنفس ATP المرتبطة ، تسرب بروتون ، وقدرة احتياطية.

Video: Bioenergetic Profile Experiment using C2C12 Myoblast Cells

Testing Nicotine Tolerance in Aphids Using an Artificial Diet Experiment

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well know to have insecticidal properties. One response of tobacco plants to herbivory, or being gnawed upon by insects, is to increase the production of this neurotoxic alkaloid. Here, we will demonstrate how to set up an experiment to address this question of whether a tobacco-adapted strain of the green peach aphid, Myzus persicae, can tolerate higher levels of nicotine than the a strain of this insect that does not infest tobacco in the field.

In this video and assay is demonstrated that tests the tolerance of nicotine to two types of aphids one that infests tobacco plants in the field and one that does not.

اختبار تسامح النيكوتين في المن باستخدام تجربة حمية الاصطناعي

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well ...

Morris Water Maze Experiment

The Morris water maze is widely used to study spatial memory and learning. Animals are placed in a pool of water that is colored opaque with powdered non-fat milk or non-toxic tempera paint, where they must swim to a hidden escape platform. Because they are in opaque water, the animals cannot see the platform, and cannot rely on scent to find the escape route. Instead, they must rely on external/extra-maze cues. As the animals become more familiar with the task, they are able to find the platform more quickly. Developed by Richard G. Morris in 1984, this paradigm has become one of the "gold standards" of behavioral neuroscience.

The Morris water maze is a well-accepted tool used to document the involvement of the hippocampus in a behavioral task.

موريس تجربة المتاهة المائية

The Morris water maze is widely used to study spatial memory and learning. Animals are placed in a pool of water that is colored opaque with powdered ...

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase or the elongation phase by a variety of cellular stresses such as amino acid starvation or growth factor withdrawal. Alternatively, translation of individual mRNAs can be regulated by mRNA localization or the presence of cognate microRNAs. Studies of protein synthesis frequently utilize polyribosome analysis to shed light on the mechanisms of translation regulation or defects in protein synthesis. In this assay, mRNA/ribosome complexes are isolated from eukaryotic cells.  A sucrose density gradient separates mRNAs bound to multiple ribosomes known as polyribosomes from mRNAs bound to a single ribosome or monosome. Fractionation of the gradients allows isolation and quantification of the different ribosomal populations and their associated mRNAs or proteins. Differences in the ratio of polyribosomes to monosomes under defined conditions can be indicative of defects in either translation initiation or elongation/termination. Examination of the mRNAs present in the polyribosome fractions can reveal whether the cohort of individual mRNAs being translated changes with experimental conditions. In addition, ribosome assembly can be monitored by analysis of the small and large ribosomal subunit peaks which are also separated by the gradient. In this video, we present a method for the preparation of crude ribosomal extracts from yeast cells, separation of the extract by sucrose gradient and interpretation of the results.  This procedure is readily adaptable to mammalian cells.

This article describes a protocol for the extraction of translating ribosomes from eukaryotic cells. Once extracted, ribosomes are separated into monosomes and polyribosomes by sucrose gradient fractionation to allow different ribosomal populations to be analyzed. As such, this method is the gold standard for examining the regulation of translation.

حقيقية النواة التحليل الشخصي Polyribosome

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

الأيض تحليل الملف من الأجنة الزرد

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

الاستقراء وتحليل الظهارية الوسيطة الانتقالية ل

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem cells of skeletal muscle, the myogenic precursor cells (MPCs), have proven indispensible to our understanding of mammalian skeletal muscle development and growth. Particularly among the basal taxa of Vertebrata, however, data are limited describing the molecular mechanisms controlling the self-renewal, proliferation, and differentiation of MPCs. Of particular interest are potential mechanisms that underlie the ability of basal vertebrates to undergo considerable postlarval skeletal myofiber hyperplasia (i.e.&#160;teleost fish) and full regeneration following appendage loss (i.e.&#160;urodele amphibians). Additionally, the use of cultured myoblasts could aid in the understanding of regeneration and the recapitulation of the myogenic program and the differences between them. To this end, we describe in detail a robust and efficient protocol (and variations therein) for isolating and maintaining MPCs and their progeny, myoblasts and immature myotubes, in cell culture as a platform for understanding the evolution of the myogenic program, beginning with the more basal vertebrates. Capitalizing on the model organism status of the zebrafish (Danio rerio), we report on the application of this protocol to small fishes of the cyprinid clade Danioninae. In tandem, this protocol can be utilized to realize a broader comparative approach by isolating MPCs from the Mexican axolotl (Ambystomamexicanum) and even laboratory rodents. This protocol is now widely used in studying myogenesis in several fish species, including rainbow trout, salmon, and sea bream1-4.

In vitro culture systems have proven indispensible to our understanding of vertebrate myogenesis. However, much remains to be learned about nonmammalian skeletal muscle development and growth, particularly in basal taxa. An efficient and robust protocol for isolating the adult stem cells of this tissue, the myogenic precursor cells (MPCs), and maintaining their self-renewal, proliferation, and differentiation in a primary culture setting allows for the identification of conserved and divergent regulatory mechanisms throughout the vertebrate lineages.

إعداد الابتدائية عضلي السلائف الخلية / ثقافات Myoblast من بصل الفقارية الأنساب

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and composed of mature enterocytes, goblet cells and enteroendocrine cells; and crypts, residing proximal to the submucosa and the muscularis, harboring adult stem and progenitor cells and mature Paneth cells, as well as stromal and immune cells of the crypt microenvironment. Until the last few years, in vitro studies of small intestine was limited to cell lines derived from either benign or malignant tumors, and did not represent the physiology of normal intestinal epithelia and the influence of the microenvironment in which they reside. Here, we demonstrate a method adapted from Sato et al. (2009) for culturing primary mouse intestinal crypt organoids derived from C57BL/6 mice. In addition, we present the use of crypt organoid cultures to assay the crypt metabolic profile in real time by measurement of basal oxygen consumption, glycolytic rate, ATP production and respiratory capacity. Organoids maintain properties defined by their source and retain aspects of their metabolic adaptation reflected by oxygen consumption and extracellular acidification rates. Real time metabolic studies in this crypt organoid culture system are a powerful tool to study crypt organoid energy metabolism, and how it can be modulated by nutritional and pharmacological factors.

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Small intestinal crypt organoids cultured ex vivo provide a tissue culture system that recapitulates growth of crypts dependent on stem cells and their niche. We established a method to assay the metabolic profile in real time in primary mouse crypt organoids. We found organoids maintain physiological properties defined by their source.

تحليل الوقت الحقيقي ايض الملف في<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; الثقافات ماوس المعوية سرداب عضي

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

سم كلوي حقن مكروي في الزرد لنموذج قصور كلوي حاد

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC) are the recently discovered modified cytosine bases produced by enzymatic oxidation of 5mC, whose biological functions remain relatively obscure. A number of approaches ranging from biochemical to antibody based techniques have been employed to study the genomic distribution and global content of these modifications in various biological systems. Although some of these approaches can be useful for quantitative assessment of these modified forms of 5mC, most of these methods do not provide any spatial information regarding the distribution of these DNA modifications in different cell types, required for correct understanding of their functional roles. Here we present a highly sensitive method for immunochemical detection of the modified forms of cytosine. This method permits co-detection of these epigenetic marks with protein lineage markers and can be employed to study their nuclear localization, thus, contributing to deciphering their potential biological roles in different experimental contexts.

Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.

الكشف عن أشكال معدلة من السيتوزين عن طريق الحساسة المناعية

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

واجهة المستخدم الرسومية لتتبع بمساعدة برنامج تركيز البروتين في النتوءات الخلوية الديناميكية

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...