Dans cette expérience, cellules C2C12 myoblastes sont ensemencées à une densité donnée en plaques Seahorse culture cellulaire. La consommation d&#39;oxygène basale (OCR) et l&#39;acidification extracellulaire (ECAR) les taux sont mesurés pour établir les taux de base. 1. Injection cellules Les cellules sont métaboliquement perturbé par trois additions de composés différents (successivement) qui déplacent le profil bioénergétique de la cellule. Un groupe servira de témoin, avec les médias courir ajouté que le contrôle &quot;composés&quot;. <ol><li> La première injection est oligomycine. Oligomycine inhibe la synthèse d&#39;ATP par le blocage du canal à protons de la F o partie ATP synthase (complexe V). Dans la recherche des mitochondries, il est utilisé pour empêcher l&#39;état 3 (phosphorylation) la respiration. Avec les cellules, elle peut être utilisée pour distinguer le pourcentage de la consommation d&#39;O2 consacrée à la synthèse d&#39;ATP et le pourcentage de la consommation d&#39;O2 nécessaire pour surmonter la fuite de protons naturelles à travers la membrane mitochondriale interne. </li><li> La deuxième injection est FCCP. FCCP (carbonyl cyanure de p-trifluoromethoxyphenylhydrazone) est un ionophore qui est un transporteur d&#39;ions mobiles. C&#39;est un agent de découplage, car il perturbe la synthèse d&#39;ATP par le transport des ions d&#39;hydrogène à travers la membrane mitochondriale, au lieu du canal à protons de l&#39;ATP synthase (complexe V). Cet effondrement du potentiel de membrane mitochondriale conduit à une consommation rapide d&#39;énergie et d&#39;oxygène, sans générer de l&#39;ATP. Dans ce cas, les deux OCR et ECAR va augmenter, en raison de l&#39;OCR découplage, et ECAR que les cellules tentent de maintenir leur équilibre énergétique en utilisant la glycolyse pour produire l&#39;ATP. Le traitement FCCP peut être utilisé pour calculer la capacité de &quot;rechange&quot; respiratoire des cellules, qui est défini comme la différence quantitative entre maximal incontrôlée OCR et l&#39;initiale OCR basale. Il a été proposé que le maintien d&#39;une certaine capacité de réserve des voies respiratoires, même dans des conditions de stimulus physiologique ou physiopathologique maximale est un facteur majeur définissant la vitalité et / ou la survie des cellules. La capacité des cellules à répondre au stress dans des conditions de la demande accrue d&#39;énergie est en grande partie influencée par la capacité des mitochondries bioénergétique. Cette capacité bioénergétique est déterminée par plusieurs facteurs, y compris la capacité de la cellule de livrer substrat à la mitochondrie et la capacité fonctionnelle des enzymes impliquées dans le transport des électrons </li><li> Dans la troisième injection, la roténone, un inhibiteur complexe I, est ajouté aux cellules. Ce sera fermé respiration mitochondriale et permettre à la fois les fractions mitochondriale et non mitochondrial contribue à la respiration doit être calculé. On observera une diminution de la ROC en raison de la fonction mitochondriale altérée, avec une augmentation concomitante de l&#39;ECAR que la cellule se déplace vers un état plus glycolytique afin de maintenir son bilan énergétique La roténone est un inhibiteur mitochondrial qui empêche le transfert d&#39;électrons à partir du centre Fe-S dans le complexe I à l&#39;ubiquinone (coenzyme Q). Cette inhibition du complexe I empêche l&#39;énergie potentielle de NADH d&#39;être convertie en énergie utilisable sous forme d&#39;ATP. </li></ol> 2. Réactifs et matériaux <ol><li> Oligomycine, FCCP, et Solutions roténone (Hippocampe Mito Kit Stress Test) </li><li> DMEM Exécution du média (Hippocampe # 100965-000) </li><li> DMSO (Sigma D8418) </li><li> Eau distillée (Gibco 15230-170) </li><li> Tampon d&#39;étalonnage (Hippocampe Bioscience) </li></ol> 3. Milieu de croissance <ol><li> 500 ml de DMEM (Gibco 11965-092) </li><li> FBS à 10% (Hyclone SH90070.03) </li><li> 5 ml Penn / Strep (Gibco 15140-122) </li><li> 5 ml pyruvate de sodium (Sigma S8636) </li><li> 5 ml Glutamax (Gibco 35050-061) </li></ol> 4. Semis Protocole <ol><li> Les cellules sont ensemencées dans des cultures cellulaires XF96 plaques avec 10 000 cellules / puits dans 100 ul de milieu de croissance et placé en incubateur à 37 ° C avec 10% de CO 2. </li><li> Les cellules adhèrent à la plaque de culture cellulaire XF96 en 1 heure. </li><li> Cellules de dosage dans XF96 24 heures après l&#39;ensemencement. </li></ol> 5. Préparation du modèle Assay <ol><li> Utilisation de l&#39;Assistant Assay (Annexe I), de générer un modèle avec la mise en groupe suivant: <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Mise en figure 1. Grille de bien identifier les assignations de colonnes et de groupe </li></ol> 6. Préparation composé <ol><li> Préparer les composés suivants dans les milieux DMEM XF Assay comme suit: 10 oligomycine uM, 30,0 uM FCCP, 20,0 uM roténone, Ces concentrations représentent la dilution 10X qui sera faite lorsque les composés sont injectés dans le puits. Les concentrations de travail sont: 1 oligomycine uM, 3,0 uM FCCP, la roténone uM 2,0 </li></ol> 7. Changer les médias et la préparation cellulaire <ol&gt; <li> Placer la plaque de cellules sur la Station XF Prep </li><li> Réglez le volume final du milieu à 160 ul par puits. </li><li> Incuber à 37 ° C incubateur sans CO 2 pendant 60 minutes pour permettre aux cellules de pré-s&#39;équilibrer avec le milieu de dosage. </li></ol> 8. Chargement cartouche de capteur <ol><li> Composés chaude à 37 ° C avant le chargement de la cartouche du capteur et la charge des composés dans les ports d&#39;injection comme suit: <ol><li> Colonnes 1-4: Charge 16, 18, et 20 pi de XF Assay médias (DMEM) dans les ports A, B et C, respectivement. </li><li> Colonnes 5-12: Charge 16 uL d&#39;oligomycine dans les ports A Charge 18 uL d&#39;FCCP dans les ports B Charge 20 pl de la roténone dans les ports C </li></ol></li></ol> 9. Commandes du protocole <table border="1"><tbody><tr><td> Commande </td><td> Temps (min) </td><td> Port </td></tr><tr><td> Calibrer </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Équilibrer </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Boucle de départ </td><td> 3X </td><td></td></tr><tr><td> Mix </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Attendre </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Mesure </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Loop End </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Injecter </td><td></td><td> Une </td></tr><tr><td> Boucle de départ </td><td> 2X </td><td></td></tr><tr><td> Mix </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Attendre </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Mesure </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Injecter </td><td></td><td> B </td></tr><tr><td> Boucle de départ </td><td> 2X </td><td></td></tr><tr><td> Mix </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Attendre </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Mesure </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Injecter </td><td></td><td> C </td></tr><tr><td> Boucle de départ </td><td> 2X </td><td></td></tr><tr><td> Mix </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Attendre </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Mesure </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Fin </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 1. Commandes Protocole

<ol>
	<li>Choi, W. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+analysis+of+isolated+cerebrocortical+nerve+terminals+on+a+microgram+scale:+spare+respiratory+capacity+and+stochastic+mitochondrial+failure.">Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure.</a> J Neurochem. 109, 1179-1191 (2009).</li><li>Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+bioenergetic+reserve+capacity+in+response+to+cardiomyocyte+stress+induced+by+4-hydroxynonenal.">Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal.</a> Biochem J. 424, 99-107 (2009).</li><li>Liu, J., Cao, L., Chen, J., Song, S., Lee, I. H., Quijano, C., Liu, H., Keyvanfar, K., Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmi1+regulates+mitochondrial+function+and+the+DNA+damage+response+pathway.">Bmi1 regulates mitochondrial function and the DNA damage response pathway.</a> Nature. , 459-7245 (2009).</li><li>Malmgren, S., Nicholls, D. G., Taneera, J., Bacos, K., Koeck, T., Tamaddon, A., Wibom, R., Groop, L., Ling, C., Mulder, H., Sharoyko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+coupling+between+glucose+and+mitochondrial+metabolism+in+clonal+beta-cells+is+required+for+robust+insulin+secretion.">Tight coupling between glucose and mitochondrial metabolism in clonal beta-cells is required for robust insulin secretion.</a> J Biol Chem. 284, 32395-32404 (2009).</li><li>Dranka, B. P., Hill, B. G., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reserve+capacity+in+endothelial+cells:+The+impact+of+nitric+oxide+and+reactive+oxygen+species.">Mitochondrial reserve capacity in endothelial cells: The impact of nitric oxide and reactive oxygen species.</a> Free Radic Biol Med. 48, 905-914 (2010).</li><li>Perez, J., Hill, B. G., Benavides, G. A., Dranka, B. P., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cellular+bioenergetics+in+smooth+muscle+cell+proliferation+induced+by+platelet-derived+growth+factor.">Role of cellular bioenergetics in smooth muscle cell proliferation induced by platelet-derived growth factor.</a> Biochem J. 428, 255-267 (2010).</li><li>Mor&#225;n, M., Rivera, H., S&#225;nchez-Arag&#243;, M., Bl&#225;zquez, A., Merinero, B., Ugalde, C., Arenas, J., Cuezva, J. M., Mart&#237;n, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+bioenergetics+and+dynamics+interplay+in+complex+I-deficient+fibroblasts.">Mitochondrial bioenergetics and dynamics interplay in complex I-deficient fibroblasts.</a> Biochim Biophys Acta. , 1802-185 (2010).</li><li>C&#225;rdenas, C., Miller, R. A., Smith, I., Bui, T., Molg&#243;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+regulation+of+cell+bioenergetics+by+constitutive+InsP3+receptor+Ca2++transfer+to+mitochondria.">Essential regulation of cell bioenergetics by constitutive InsP3 receptor Ca2+ transfer to mitochondria.</a> Cell. , 142-142 (2010).</li></ol>

Min Wu, Per Bo Jensen, George W. Rogers, et David A. Ferrick sont des employés de Seahorse Bioscience, qui produit des réactifs et des instruments présentés dans cet article.

Ce test est dérivé de l&#39;expérience classique de sonder la fonction mitochondriale et sert de cadre qui permet de construire des expériences plus complexes visant à comprendre divers changements dans le métabolisme cellulaire, la fonction mitochondriale, et bioénergétique global. Tous les composés utilisés dans cette expérience doit être optimisé pour la concentration qui donne l&#39;effet maximal. Autrement dit, on doit effectuer des expériences de titration séparée de vérifier ces valeurs. Ceci est particulièrement important avec FCCP, comme la courbe de titrage tendance à être assez forte, et FCCP trop peut effectivement diminuer les réponses dans l&#39;OCR. Gammes typiques (concentrations finales) pour tester serait: <ul><li> 0,1 à 1,0 ug / ml de oligomycine </li><li> 0,1 à 5,0 uM FCCP </li><li> 0,1 à 1,0 uM roténone </li></ul> Notez que les réponses à chaque composé ci-dessus (surtout FCCP) sera influencée par la composition de dosage des médias (type de base, [glucose], [pyruvate], présence / absence de BSA, etc.) En outre, si le dosage des médias XF composition est modifiée, l&#39;optimisation devra être ré-exécuté. La présence et la concentration du pyruvate est particulièrement important dans l&#39;obtention de la capacité respiratoire maximale en raison de FCCP. Seahorse Bioscience a observé dans un certain nombre de lignes de cellules que l&#39;omission de la pyruvate abroge la capacité des cellules à répondre au maximum (au-dessus de base) à FCCP. Généralement, les concentrations de pyruvate 1-10 mm doivent être testés pour comprendre la concentration optimale de pyruvate pour obtenir la respiration maximale. Notez que [pyruvate] ET [glucose] peut être nécessaire de &quot;cross-titré&quot; pour obtenir les conditions optimales pour l&#39;expérience des médias. Les résultats typiques de cette expérience sont présentés ci-dessous un graphique montrant l&#39;OCR en fonction du temps et une autre montrant ECAR en fonction du temps: <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. OCR vs Temps <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. ECAR vs Temps Ici, nous avons observé les réponses attendues dans les OCR et ECAR que les cellules sont traitées avec chaque composé successives. Pour oligomycine, ROC diminue en raison du blocage de synthèse d&#39;ATP mitochondriale au Complexe V. Puisque les cellules sont incapables de synthétiser l&#39;ATP par OXPHOS, ils reviennent à la glycolyse pour répondre à leur demande de l&#39;ATP, ce que nous observons une augmentation de l&#39;ECAR. Comme indiqué précédemment, FCCP agit comme un agent de découplage. Puisque les cellules doivent désormais surmonter la fuite de protons à travers la membrane mitochondriale interne, ROC augmente de manière significative que plus d&#39;O2 est consommée pour pomper l&#39;excès de protons de retour à travers la membrane mitochondriale. Enfin, la roténone inhibe complexe mitochondrial I et complexe III, respectivement, ce qui provoque un flux d&#39;électrons à cesser de la chaîne de transport des électrons, et donc la consommation d&#39;O2 est drastiquement réduit. <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Respiration paramètres Au-delà des changements attendus dans la respiration et ECAR, un certain nombre de paramètres respiratoires peuvent être obtenus à partir de ces données. Ceci est résumé dans la figure ci-dessus: Ici, nous voyons que nous pouvons obtenir des renseignements au sujet de la respiration basale des cellules, la consommation d&#39;O2 pour cent de la production consacrée à l&#39;ATP ainsi que le montant consacré au maintien de la gradient de protons (ions H + en raison de fuites). En outre, nous pouvons obtenir la fréquence respiratoire maximale dans des conditions de la respiration découplée (parfois appelé capacité respiratoire comme pièce de rechange) et enfin, nous pouvons déterminer le montant de la consommation d&#39;O2 n&#39;est pas due à des processus mitochondriaux. Un nombre rapidement croissant d&#39;études employant ce profil mitochondrial pour évaluer la bioénergétique cellulaire, d&#39;identifier un dysfonctionnement mitochondrial et de prédire la capacité des cellules à répondre au stress et / ou des insultes. Pour de plus amples informations et détails sur cette méthode expérimentale et l&#39;idée de la capacité respiratoire de secours, s&#39;il vous plaît se référer à voir les publications suivantes 1-8.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Oligomycin, FCCP, Rotenone and Antimycin A Solutions</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Seahorse Bioscience</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Seahorse Mito Stress Test Kit</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM Running Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Seahorse Bioscience</td>
<td>100965-000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMSO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D8418</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Distilled Water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>15230-170</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Calibration buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Seahorse Bioscience</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

bioenergetic profile experiment using c2c12 myoblast cells

La capacité de mesurer le métabolisme cellulaire et comprendre la dysfonction mitochondriale, a permis aux scientifiques du monde entier pour faire avancer leurs recherches dans la compréhension du rôle de la fonction mitochondriale dans l&#39;obésité, la toxicité diabète, le vieillissement, le cancer, la fonction cardiovasculaire et de sécurité. Le métabolisme cellulaire est le processus d&#39;absorption du substrat, comme l&#39;oxygène, glucose, acides gras, et la glutamine, et la conversion d&#39;énergie subséquente à travers une série d&#39;oxydation enzymatique contrôlée et les réactions de réduction. Ces résultats biochimiques intracellulaires réactions dans la production d&#39;ATP, la libération des sous-produits de la chaleur et de produits chimiques, tels que le lactate et le CO 2 dans le milieu extracellulaire. Des informations précieuses sur l&#39;état physiologique des cellules, et l&#39;altération de l&#39;état de ces cellules, peuvent être acquises grâce à la mesure du taux d&#39;oxygène consommée par les cellules, un indicateur de la respiration mitochondriale - le taux de consommation d&#39;oxygène - ou OCR. Cellules aussi générer l&#39;ATP par la glycolyse, à savoir: la conversion du glucose en lactate, indépendant de l&#39;oxygène. Dans les puits de culture, le lactate est la principale source de protons. Mesure de l&#39;acide lactique produit indirectement via protons libérés dans le milieu extracellulaire entourant les cellules, ce qui provoque une acidification du milieu fournit la vitesse d&#39;acidification extra-cellulaires - ou de l&#39;ECAR. Dans cette expérience, cellules C2C12 myoblastes sont ensemencées à une densité donnée en plaques Seahorse culture cellulaire. La consommation d&#39;oxygène basale (OCR) et l&#39;acidification extracellulaire (ECAR) les taux sont mesurés pour établir les taux de base. Les cellules sont ensuite métaboliquement perturbé par trois additions de composés différents (successivement) qui déplacent le profil bioénergétique de la cellule. Ce test est dérivé d&#39;une expérience classique pour évaluer les mitochondries et sert de cadre qui permet de construire des expériences plus complexes visant à comprendre la fonction à la fois physiologiques et physiopathologiques de la mitochondrie et de prédire la capacité des cellules à répondre au stress et / ou des insultes.

Watch this Scientific Journal Video about Bioenergetic Profile Experiment using C2C12 Myoblast Cells at JoVE.com

Bioenergetic Profile Experiment using C2C12 Myoblast Cells

Une description d&#39;une méthode de profilage de la fonction mitochondriale dans les cellules est fournie. Le profil mitochondrial généré fournit quatre paramètres de la fonction mitochondriale qui peuvent être mesurées dans une expérience: le taux de respiration basale, l&#39;ATP lié respiration, fuite de protons, et la capacité de réserve.

Expérience profil bioénergétique utilisant cellules C2C12 de myoblastes

The ability to measure cellular metabolism and understand mitochondrial dysfunction, has enabled scientists worldwide to advance their research in ...

bioenergetic-profile-experiment-using-c2c12-myoblast-cells

Research

JoVE Journal

Biology

50.2K vues.  Novato, CA. Une description d'une méthode de profilage de la fonction mitochondriale dans les cellules est fournie. Le profil mitochondrial généré fournit quatre paramètres de la fonction mitochondriale qui peuvent être mesurées dans une expérience: le taux de respiration basale, l'ATP lié respiration, fuite de protons, et la capacité de réserve.

Vidéo: Bioenergetic Profile Experiment using C2C12 Myoblast Cells

Testing Nicotine Tolerance in Aphids Using an Artificial Diet Experiment

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well know to have insecticidal properties. One response of tobacco plants to herbivory, or being gnawed upon by insects, is to increase the production of this neurotoxic alkaloid. Here, we will demonstrate how to set up an experiment to address this question of whether a tobacco-adapted strain of the green peach aphid, Myzus persicae, can tolerate higher levels of nicotine than the a strain of this insect that does not infest tobacco in the field.

In this video and assay is demonstrated that tests the tolerance of nicotine to two types of aphids one that infests tobacco plants in the field and one that does not.

Vérification de la tolérance à la nicotine chez les pucerons Utiliser une alimentation artificielle Experiment

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well ...

Recherche

Biologie

Morris Water Maze Experiment

The Morris water maze is widely used to study spatial memory and learning. Animals are placed in a pool of water that is colored opaque with powdered non-fat milk or non-toxic tempera paint, where they must swim to a hidden escape platform. Because they are in opaque water, the animals cannot see the platform, and cannot rely on scent to find the escape route. Instead, they must rely on external/extra-maze cues. As the animals become more familiar with the task, they are able to find the platform more quickly. Developed by Richard G. Morris in 1984, this paradigm has become one of the "gold standards" of behavioral neuroscience.

The Morris water maze is a well-accepted tool used to document the involvement of the hippocampus in a behavioral task.

Expérience Morris Water Maze

The Morris water maze is widely used to study spatial memory and learning. Animals are placed in a pool of water that is colored opaque with powdered ...

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase or the elongation phase by a variety of cellular stresses such as amino acid starvation or growth factor withdrawal. Alternatively, translation of individual mRNAs can be regulated by mRNA localization or the presence of cognate microRNAs. Studies of protein synthesis frequently utilize polyribosome analysis to shed light on the mechanisms of translation regulation or defects in protein synthesis. In this assay, mRNA/ribosome complexes are isolated from eukaryotic cells.  A sucrose density gradient separates mRNAs bound to multiple ribosomes known as polyribosomes from mRNAs bound to a single ribosome or monosome. Fractionation of the gradients allows isolation and quantification of the different ribosomal populations and their associated mRNAs or proteins. Differences in the ratio of polyribosomes to monosomes under defined conditions can be indicative of defects in either translation initiation or elongation/termination. Examination of the mRNAs present in the polyribosome fractions can reveal whether the cohort of individual mRNAs being translated changes with experimental conditions. In addition, ribosome assembly can be monitored by analysis of the small and large ribosomal subunit peaks which are also separated by the gradient. In this video, we present a method for the preparation of crude ribosomal extracts from yeast cells, separation of the extract by sucrose gradient and interpretation of the results.  This procedure is readily adaptable to mammalian cells.

This article describes a protocol for the extraction of translating ribosomes from eukaryotic cells. Once extracted, ribosomes are separated into monosomes and polyribosomes by sucrose gradient fractionation to allow different ribosomal populations to be analyzed. As such, this method is the gold standard for examining the regulation of translation.

Eucaryotes Analyse du profil polyribosome

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Analyse du profil métabolique des embryons de poisson zèbre

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Induction et analyse des épithéliale à mésenchymateuses transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem cells of skeletal muscle, the myogenic precursor cells (MPCs), have proven indispensible to our understanding of mammalian skeletal muscle development and growth. Particularly among the basal taxa of Vertebrata, however, data are limited describing the molecular mechanisms controlling the self-renewal, proliferation, and differentiation of MPCs. Of particular interest are potential mechanisms that underlie the ability of basal vertebrates to undergo considerable postlarval skeletal myofiber hyperplasia (i.e.&#160;teleost fish) and full regeneration following appendage loss (i.e.&#160;urodele amphibians). Additionally, the use of cultured myoblasts could aid in the understanding of regeneration and the recapitulation of the myogenic program and the differences between them. To this end, we describe in detail a robust and efficient protocol (and variations therein) for isolating and maintaining MPCs and their progeny, myoblasts and immature myotubes, in cell culture as a platform for understanding the evolution of the myogenic program, beginning with the more basal vertebrates. Capitalizing on the model organism status of the zebrafish (Danio rerio), we report on the application of this protocol to small fishes of the cyprinid clade Danioninae. In tandem, this protocol can be utilized to realize a broader comparative approach by isolating MPCs from the Mexican axolotl (Ambystomamexicanum) and even laboratory rodents. This protocol is now widely used in studying myogenesis in several fish species, including rainbow trout, salmon, and sea bream1-4.

In vitro culture systems have proven indispensible to our understanding of vertebrate myogenesis. However, much remains to be learned about nonmammalian skeletal muscle development and growth, particularly in basal taxa. An efficient and robust protocol for isolating the adult stem cells of this tissue, the myogenic precursor cells (MPCs), and maintaining their self-renewal, proliferation, and differentiation in a primary culture setting allows for the identification of conserved and divergent regulatory mechanisms throughout the vertebrate lineages.

Préparation du primaire Myogenic précurseurs cellulaires / cultures de myoblastes de basales vertébrés lignées

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and composed of mature enterocytes, goblet cells and enteroendocrine cells; and crypts, residing proximal to the submucosa and the muscularis, harboring adult stem and progenitor cells and mature Paneth cells, as well as stromal and immune cells of the crypt microenvironment. Until the last few years, in vitro studies of small intestine was limited to cell lines derived from either benign or malignant tumors, and did not represent the physiology of normal intestinal epithelia and the influence of the microenvironment in which they reside. Here, we demonstrate a method adapted from Sato et al. (2009) for culturing primary mouse intestinal crypt organoids derived from C57BL/6 mice. In addition, we present the use of crypt organoid cultures to assay the crypt metabolic profile in real time by measurement of basal oxygen consumption, glycolytic rate, ATP production and respiratory capacity. Organoids maintain properties defined by their source and retain aspects of their metabolic adaptation reflected by oxygen consumption and extracellular acidification rates. Real time metabolic studies in this crypt organoid culture system are a powerful tool to study crypt organoid energy metabolism, and how it can be modulated by nutritional and pharmacological factors.

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Small intestinal crypt organoids cultured ex vivo provide a tissue culture system that recapitulates growth of crypts dependent on stem cells and their niche. We established a method to assay the metabolic profile in real time in primary mouse crypt organoids. We found organoids maintain physiological properties defined by their source.

Analyse en temps réel de profil métabolique dans<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultures souris intestinale Crypte organoïde

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC) are the recently discovered modified cytosine bases produced by enzymatic oxidation of 5mC, whose biological functions remain relatively obscure. A number of approaches ranging from biochemical to antibody based techniques have been employed to study the genomic distribution and global content of these modifications in various biological systems. Although some of these approaches can be useful for quantitative assessment of these modified forms of 5mC, most of these methods do not provide any spatial information regarding the distribution of these DNA modifications in different cell types, required for correct understanding of their functional roles. Here we present a highly sensitive method for immunochemical detection of the modified forms of cytosine. This method permits co-detection of these epigenetic marks with protein lineage markers and can be employed to study their nuclear localization, thus, contributing to deciphering their potential biological roles in different experimental contexts.

Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.

Détection des formes modifiées de Cytosine Utilisation Sensible immunohistochimie

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Une interface utilisateur graphique pour le suivi assisté par logiciel de la concentration de protéines dans les protrusions cellulaires dynamiques

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear positioning occurs during skeletal muscle differentiation. Muscle fibers (myofibers) are multinucleated cells formed by the fusion of muscle precursor cells (myoblasts) derived from muscle stem cells (satellite cells) that undergo proliferation and differentiation. Correct nuclear positioning within myofibers is required for the proper muscle regeneration and function. The common procedure to assess myoblast differentiation and myofiber formation relies on fixed cells analyzed by immunofluorescence, which impedes the study of nuclear movement and cell behavior over time. Here, we describe a method for the analysis of myoblast differentiation and myofiber formation by live cell imaging. We provide a software for automated nuclear tracking to obtain a high-throughput quantitative characterization of nuclear dynamics and myoblast behavior (i.e., the trajectory) during differentiation and fusion.

Skeletal muscle differentiation is a highly dynamic process, which particularly relies on nuclear positioning. Here, we describe a method to track nuclei movements by live cell imaging during myoblast differentiation and myotube formation and to perform a quantitative characterization of nuclei dynamics by extracting information from automatic tracking.

Exploitant imagerie direct aux noyaux de piste au cours de la différenciation des myoblastes et Fusion

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...