Os estudos atuais foram apoiados pelos Estados Unidos National Institutes of Health conceder R01-HL092188, R01-DK083385 e R01HL098294 e Fundação para a Educação Anestesia e Pesquisa (Faer) Subsídios para HKE, uma subvenção para Faer JYD e DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) de Pesquisa Fellowship (GR2121/1-1) para AG.

Observações gerais. Todas as operações devem ser realizadas em um microscópio de dissecação vertical (Leica) e usando um coagulador cirúrgico. Os ratos do grupo experimental devem ser combinados em idade e peso para garantir a comparabilidade dos resultados. Administração de temperatura, pressão arterial anestesia, e fluido deve ser estável e monitorados durante o experimento. 1. Anestesia e cirurgia <ol><li> Experimentos isquemia renal pode ser realizada com aplicação simultânea isquemia e reperfusão de ambos os rins, ou depois de nefrectomia único em combinação com o tratamento da isquemia do rim remanescente. Como o tratamento da isquemia bilateral dos dois rins é associado ao aumento de dificuldades técnicas, um cenário mais complexo e mais experimental da cirurgia, iremos realizar uma nefrectomia direita seguido de tratamento da isquemia do rim remanescente, utilizando um sistema de peso pendurado. Nós utilizamos este sistema de peso pendurado também para oclusão da artéria coronária no coração. No entanto, o procedimento é diferente, pois a artéria renal pode ser isolada do tecido circundante ao passo que a artéria coronária está dentro do músculo cardíaco. </li><li> Camundongos (8-14 semanas de idade, ambos os sexos) serão anestesiados com pentobarbital na dose de 70mg/kg. Vamos manter a anestesia com aprox. 10 mg de sódio / kg / h pentobarbital. Sobredosagem pode reduzir significativamente a pressão arterial e, portanto, pode alterar os resultados. Em nossos estudos iniciais, também utilizada cetamina e xilazina. No entanto, estes compostos induziram uma forte bradicardia (150 min /). Ao lado da bradicardia observada também há evidências de que ambos os compostos estão envolvidos em mecanismos de proteção durante condições de isquemia. Anestésicos voláteis não pode ser usado, quer devido à sua capacidade para induzir também a protecção renal e pressão arterial baixa. Portanto, nossa escolha final para a anestesia foi pentobarbital. Além disso, a quetamina e xilazina são excretados principalmente pelos rins. Nefrectomia e isquemia pode prolongar a anestesia cetamina. </li><li> Uma vez que os reflexos estão ausentes dor (testado apertando os dedos dos pés, com uma pinça) ratos serão colocados sobre uma mesa de aquecimento com temperatura controlada (RT, Effenberg, Munique, Alemanha, para manter a temperatura corporal de 37,0 ° C) em uma posição de decúbito lateral esquerdo. </li><li> Prenda as extremidades inferiores e superiores para a tabela usando fita. </li><li> Para não-sobrevivência cirurgias, como mostrado no vídeo de demonstração, cobrir a área da incisão com óleo mineral para evitar a inalação de cabelo de rato, cortando a pele e, assim, evitar o risco de alergias cabelo mouse. Em caso de experimentos própria sobrevivência técnicas assépticas, incluindo corte de cabelo, a desinfecção da pele com iodóforos (Betadine, por exemplo), manuseio de instrumentos estéreis autoclavado e usando máscaras de uma luvas estéreis para o cirurgião são obrigatórios. Óleo mineral não é utilizado em cirurgias de sobrevivência. Para cirurgias de sobrevivência NaCl estéril é usada </li><li> Incisão flanco direito será feita com uma tesoura e um eletrodo de coagulação (Erbe, ICC50, Alemanha) para prevenir sangramento de músculos e vasos da pele. Em contraste com os rins acessando via laparotomia mediana, esta técnica não requer acesso à cavidade peritoneal. </li><li> O pedículo renal, incluindo artéria renal e veia renal são ligados com uma sutura 4 / 0 de seda e do rim direito serão cortadas com uma tesoura sem interferir com os vasos supra-renais. </li><li> A ferida cirúrgica é fechada com sutura contínua (dois pontos) da parede muscular e da pele com uma sutura 4 / 0. </li><li> Os animais são então colocados em uma posição de decúbito lateral direito e de uma incisão flanco esquerdo será executada. </li><li> O rim esquerdo é cuidadosamente removida do tecido conjuntivo, evitando a glândula adrenal e vasos. </li><li> Em seguida, o rim está ligado com o lado ventral para baixo em um copo de acrílico. O copo de acrílico devem ser esterilizados para cirurgias de sobrevivência. O pólo do rim é cuidadosamente empurrado para dentro do copo de acrílico, segurando o tecido circundante, com uma pinça. Posteriormente, a pole é cuidadosamente empurrado para dentro do copo de acrílico com uma pinça. O rim será mantido molhado e quente com um cotonete molhado encharcado com água a 37,0 ° C. </li><li> Após a exposição do rim esquerdo e colocação em um copo de acrílico o titular do rim é contido ventralmente ter tensão sobre os vasos renais. A restrição suficiente é importante para uma colocação bem sucedida da sutura sob a artéria renal. Posteriormente, o titular do rim é fixo e da artéria renal pode ser facilmente identificada como ele roda em cima da veia renal. </li><li> A artéria renal é dissecado dos tecidos adjacentes, perto de sua decolagem a partir da aorta abdominal com uma pinça fina. A artéria é dissecada da veia subjacente com uma pinça curva no topo. </li><li> Uma sutura 8 / 0 seda (Ethicon, Norderstedt, Alemanha) é colocado sob a artéria renal usandoum fórceps como um guia de liderança. Esta técnica permite a interrupção do fluxo sanguíneo apenas o arterial para o rim sem compressão da veia renal, em comparação a fixação do pedículo renal. </li><li> A sutura é colocada sobre um poste pequeno (pode ser um pino de segurança elaborados) e um peso de aprox. 1g está ligado a cada extremidade (tubo eppendorf). O peso pode ser adaptado para o tamanho dos rins, retirando ou acrescentando água nos tubos eppendorf. No entanto, a artéria deve ser um pouco puxado para cima, de modo que nenhum sangue está correndo através da artéria, mas sem esticar importante sobre a artéria. Estresse estiramento importante na artéria pode causar danos parede do vaso com espessamento da parede arterial e reperfusão reduzida. </li><li> Enquanto os pesos não são suportados, a artéria renal é imediatamente ocluído. Em contraste, quando os pesos são suportados, o fluxo sanguíneo é restaurado imediatamente ao órgão. Oclusão bem sucedida é confirmada por uma mudança de cor de vermelho para branco. </li><li> Tempo de isquemia diferentes podem ser realizadas, conforme exigido pelo experimento. A reperfusão completa terá lugar, dependendo da duração do tempo de isquemia. Tempo de isquemia de até 45 minutos permitem lesão renal recuperável. Em nosso meio experimental foram utilizados 20 a 30 minutos de isquemia com uma lesão renal médio que nos permite ver a melhoria, bem como diminuição da lesão renal, dependendo da estirpe do mouse e do tratamento. </li><li> Após a reperfusão completa do rim pode ser substituído para fora do copo de acrílico. Portanto, o rim é titular não fixada ea tensão sobre o rim é liberado. O pólo cranial é gentilmente removido para fora do copo com uma pinça branda eo pólo caudal segue imediatamente. </li><li> A fixação (fitas) do mouse pode ser liberado eo mouse pode ser colocado em posição supina para a depuração de inulina por exemplo, FITC-rotulados. </li><li> Em subconjuntos de experiências, pressão arterial e freqüência cardíaca pode ser registada ao longo do procedimento cirúrgico. Medidas de pressão arterial são obtidos de forma contínua através de um cateter da artéria carótida. Em resumo, a artéria carótida é exposta através de dissecção romba da musculatura paratraqueal. Após a exposição ainda mais cuidado e prevenção de trauma tecidual (particular do nervo vago), um cateter é inserido dentro do vaso usando duas suturas e uma pinça pequena. A pressão arterial é medida com um elemento Statham (WK 280, WKK, Kaltbrunn, Suíça). </li><li> Para FITC marcado clearance de inulina de um cateter tem que ser colocado na veia jugular esquerda para infusão de cloreto de sódio e inulina FITC-rotulados. Além disso, uma sonda vesical tem que ser inserido para a coleta de urina de forma dependente do tempo, conforme explicado abaixo em detalhe. </li></ol> 2. Medição de lesão renal <ol><li> Em geral: Os parâmetros de resultados a seguir são recomendados para determinar lesão renal após isquemia renal: Executar FITC marcado clearance de inulina para avaliar a taxa de filtração glomerular (TFG). Como uma alternativa determinar o clearance de creatinina ea creatinina sérica através de investigação gaiola metabólica 24 horas após a lesão renal. Executar renal coloração H &amp; E e um mieloperoxidase (MPO) ELISA para determinar o dano renal e inflamação 24 horas após a isquemia renal. </li><li> Metabólica investigações gaiola: <ol><li> Após isquemia do rim esquerdo está ligado de volta para a posição retroperitoneal ea ferida é fechada, como descrito acima. </li><li> No final da cirurgia os ratos recebem 0,3 ml salina IP normal e recuperar durante 2 horas sob uma lâmpada de aquecimento. </li><li> Posteriormente, os ratos serão colocados em gaiolas metabólicas (Tecniplast Deutschland, Hohenpeissenberg, Alemanha) para determinação de parâmetros funcionais renais por 2 tempos de 24 horas. </li><li> A ingestão de água de cada rato tem de ser determinada por pesagem do frasco vazio e encheu com água antes do fornecimento para o mouse e de 24 horas depois pesando a garrafa cheia novamente. O peso do mouse tem que ser determinado bem. </li><li> Depois de 24 horas aproximadamente 75μl de sangue são retirados do plexo venoso por trás do olho através de um tubo capilar sob anestesia isoflorane curto. </li><li> Função renal é avaliada através da medida plasmática e creatinina de urina de 24 horas após isquemia renal usando um método comercialmente disponível colorimtric acordo com o fabricante `s de protocolo (LT-SYS, Trabalho + Technik, Berlim, Alemanha). As concentrações plasmáticas e urina de Na +, K + são determinadas com um fotómetro de emissão de chama (ELEX 6361, Eppendorf AG, Hamburg, Germany). Excretor renal e hemodinâmica valores são calculados usando fórmulas padrão 15-17. </li></ol></li><li> Inulina clearance: experimentos FITC-clearance de inulina será realizada após isquemia renal. <ol><li> A veia jugular esquerda é canulada para i contínuanfusion. Depois de dissecar a veia do tecido adjacente com uma tesoura de preparação (Dumont, WPI) colocar duas suturas (4 / 0) em torno da veia. Coloque uma braçadeira na veia antes da sutura proximale para parar o fluxo de sangue. Depois disso feche o nó distal e colocar um peso em uma das extremidades da sutura distal à tensão tensão na veia. Isto é muito importante para obter o cateter na veia. Use um micro-tesoura para cortar uma pequena abertura na veia. Segure a abertura com uma pinça fina (Dumont, WPI) e colocar o cateter na veia. Para avançar o cateter assumir a braçadeira fora. Certifique-se que não há tensão no cateter de modo que você pode colocá-lo para baixo, sem segurá-lo. Posteriormente, fechar a segunda sutura proximal sobre a veia eo cateter. </li><li> Um cateter é colocado na bexiga urinária para cronometrado coleta de urina. Portanto você cortar uma incisão pequena na pele sobre a bexiga. Remova cuidadosamente a bexiga através do orifício na pele. Corrigir a bexiga com um lenço molhado. Coloque uma sutura preparado sobre a bexiga (4 / 0). </li><li> Corte um pequeno pedaço de um cateter (1,5 cm) e calor no fim de obter um anel ao redor do cateter que torna mais fácil para corrigi-lo na bexiga. </li><li> Corte um buraco na bexiga em seu topo. Fazer o corte entre os vasos para evitar sangramento. Insira a extremidade grande do cateter na bexiga e perto da sutura sobre o cateter ea bexiga. </li><li> Todos os animais recebem um bolus de solução 0,85% de cloreto de sódio em uma quantidade igual a 20% do peso corporal. Infusão contínua é mantida a uma taxa de 800ul/h/25g peso corporal e FITC-inulina é adicionado à infusão para a avaliação de toda a taxa de filtração glomerular renal (TFG). Após a estabilização dos animais durante 20 min, 20 min coleções temporizados de urina são realizados (quatro vezes) para determinação da taxa de fluxo urinário e FITC-inulina. O sangue é obtido no meio de cada período para a medição de FITC-inulina. </li><li> Ao iniciar os períodos de coleta por 20 minutos usar um timer. Coletar a urina, colocando a extremidade do cateter da bexiga em um tubo eppendorf de pequeno porte. Medir o peso do tubo antes e depois da coleta de urina para que você possa determinar a quantidade de urina. Amostras de sangue são tomadas através de retro-orbitária forma de coleta de sangue do plexo venoso através de tubos capilares no meio de cada período de coleta. </li></ol></li><li> Sangue e os rins podem ser recolhidos após cada procedimento para análise mais aprofundada, por exemplo MPO ELISA, citocina EISA, histologia. </li></ol> 3. Resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2549/2549fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1 Modelo de um sistema de suspensão de peso-para isquemia renal:. Um sistema de suspensão de peso foi criado para induzir isquemia renal do rim esquerdo. Portanto, um fio de náilon 8,0 foi colocado sob a artéria renal e no final de cada sutura um peso pequeno (1g) foi anexado. Este projeto experimental permite a oclusão reversível da artéria renal através da aplicação e liberar a carga de peso.

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	<li>Abuelo, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normotensive+ischemic+acute+renal+failure.">Normotensive ischemic acute renal failure.</a> N Engl J Med. 357, 797-805 (2007).</li><li>Thadhani, R., Pascual, M., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+renal+failure.">Acute renal failure.</a> N Engl J Med. 334, 448-460 (1996).</li><li>Lameire, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathophysiology+of+acute+renal+failure.">The pathophysiology of acute renal failure.</a> Crit Care Clin. 21, 197-210 (2005).</li><li>Gelman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathophysiology+of+aortic+cross-clamping+and+unclamping.">The pathophysiology of aortic cross-clamping and unclamping.</a> Anesthesiology. 82, 1026-1060 (1995).</li><li>Yalavarthy, R., Edelstein, C. L., Teitelbaum, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+renal+failure+and+chronic+kidney+disease+following+liver+transplantation.">Acute renal failure and chronic kidney disease following liver transplantation.</a> Hemodial Int. 11, S7-S12 (2007).</li><li>Schrier, R. W., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+renal+failure+and+sepsis.">Acute renal failure and sepsis.</a> N Engl J Med. 351, 159-169 (2004).</li><li>Grenz, A., Osswald, H., Eckle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Reno-Vascular+A2B+Adenosine+Receptor+Protects+the+Kidney+from+Ischemia.">The Reno-Vascular A2B Adenosine Receptor Protects the Kidney from Ischemia.</a> PLoS Medicine. 5, e137-e137 (2008).</li><li>Grenz, A., Zhang, H., Hermes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+E-NTPDase1+(CD39)+to+renal+protection+from+ischemia-reperfusion+injury.">Contribution of E-NTPDase1 (CD39) to renal protection from ischemia-reperfusion injury.</a> FASEB J. 21, 2863-2873 (2007).</li><li>Grenz, A., Zhang, H., Eckle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+role+of+ecto-5'-nucleotidase+(CD73)+in+renal+ischemia.">Protective role of ecto-5'-nucleotidase (CD73) in renal ischemia.</a> J Am Soc Nephrol. 18, 833-845 (2007).</li><li>Akcay, A., Nguyen, Q., Edelstein, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediators+of+inflammation+in+acute+kidney+injury.">Mediators of inflammation in acute kidney injury.</a> Mediators Inflamm. , 137072-137072 (2009).</li><li>Faubel, S., Ljubanovic, D., Poole, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+CD4+T-cell+depletion+is+not+sufficient+to+prevent+ischemic+acute+renal+failure.">Peripheral CD4 T-cell depletion is not sufficient to prevent ischemic acute renal failure.</a> Transplantation. 80, 643-649 (2005).</li><li>Wei, Q., Bhatt, K., He, H. Z., Mi, Q. S., Haase, V. H., Dong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+deletion+of+Dicer+from+proximal+tubules+protects+against+renal+ischemia-reperfusion+injury.">Targeted deletion of Dicer from proximal tubules protects against renal ischemia-reperfusion injury.</a> J Am Soc Nephrol. 21, 756-761 (2010).</li><li>Joo, J. D., Kim, M., Horst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+and+delayed+renal+protection+against+renal+ischemia+and+reperfusion+injury+with+A1+adenosine+receptors.">Acute and delayed renal protection against renal ischemia and reperfusion injury with A1 adenosine receptors.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 293, F1847-F1857 (2007).</li><li>Grenz, A., Eckle, T., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+hanging-weight+system+for+isolated+renal+artery+occlusion+during+ischemic+preconditioning+in+mice.">Use of a hanging-weight system for isolated renal artery occlusion during ischemic preconditioning in mice.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 292, F475-F485 (2007).</li><li>Qi, Z., Whitt, I., Mehta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+determination+of+glomerular+filtration+rate+in+conscious+mice+using+FITC-inulin+clearance.">Serial determination of glomerular filtration rate in conscious mice using FITC-inulin clearance.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 286, 590-596 (2004).</li><li>Lorenz, J. N., Gruenstein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+nonradioactive+method+for+evaluating+single-nephron+filtration+rate+using+FITC-inulin.">A simple, nonradioactive method for evaluating single-nephron filtration rate using FITC-inulin.</a> Am J Physiol. 276, 172-177 (1999).</li><li>Lorenz, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+evaluating+cardiovascular,+renal,+and+pulmonary+function+in+mice.">A practical guide to evaluating cardiovascular, renal, and pulmonary function in mice.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 282, 1565-1582 (2002).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Em resumo, o presente estudo descreve uma nova técnica para a realização de isquemia renal em um modelo murino usando um sistema de suspensão de peso para oclusão da artéria renal. De fato, este estudo demonstra lesão altamente reprodutíveis, minimizando assim a variabilidade associada com pinçamento do pedículo renal.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> Pentobarbital sódico </td><td> Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd </td><td> VPL 9372 </td><td> 4mg/ml em solução salina </td></tr><tr><td> Sutura, de seda 4,0 </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 517698 </td><td></td></tr><tr><td> Sutura, Prolene 8,0 </td><td> Ethicon, EUA </td><td> M8739 </td><td> reutilizáveis </td></tr><tr><td> microscópio de dissecação </td><td> Leica </td><td> n / a </td><td> considerar a distância de trabalho generosa </td></tr><tr><td> Tabela de aquecimento </td><td> Rt, Effenberger, Alemanha </td><td> n / a </td><td> único fornecedor e único </td></tr><tr><td> Instrumentos cirúrgicos </td><td> WPI, Dumont </td><td></td><td> uma tesoura fina microvascular </td></tr></tbody></table>

use of a hanging-weight system for isolated renal artery occlusion

Em pacientes hospitalizados, mais de 50% dos casos de lesão renal aguda (IRA) são causados ​​por isquemia renal 1-3. Um estudo recente de pacientes hospitalizados revelou que apenas um aumento moderado nos níveis de creatinina sérica (0,3 a 0,4 mg / dl) é associada a um risco 70% maior de morte do que em pessoas sem qualquer aumento de 1. Ao longo destas linhas, procedimentos cirúrgicos que exigem de pinçamento da aorta e vasos renais estão associadas com uma taxa de insuficiência renal de até 30% 4. Da mesma forma, AKI após cirurgia cardíaca ocorre em mais de 10% dos pacientes em circunstâncias normais e está associado com aumentos dramáticos na mortalidade. AKI também são complicações comuns após o transplante hepático. Pelo menos 8-17% dos pacientes acabam necessitando de terapia de substituição renal 5. Além disso, a função tardia do enxerto devido à lesão de células tubulares durante transplante renal é freqüentemente relacionados à isquemia-associados AKI 6. Além disso, AKI ocorre em aproximadamente 20% dos pacientes que sofrem de sepse 6. A ocorrência de lesão renal aguda está associada com um aumento dramático de morbidade e mortalidade 1. Abordagens terapêuticas são muito limitados ea maioria dos ensaios de intervenção no AKI falharam em seres humanos. Portanto, modalidades terapêuticas adicionais para evitar lesões de isquemia renal são urgentemente necessários 3, 7-9. Para elucidar os mecanismos de lesão renal por isquemia e possíveis estratégias terapêuticas modelos murinos são intensamente necessários 7-13. Modelos de ratos oferecem a possibilidade de utilizar diferentes modelos genéticos, incluindo gene-alvo ratos e tecidos específicos do gene-alvo camundongos (cre-flox sistema). No entanto, isquemia renal murino é tecnicamente desafiadora e detalhes experimentais influenciar significativamente os resultados. Foi realizada uma avaliação sistemática de um novo modelo de oclusão da artéria renal isolado em ratos, o que especificamente evita o uso de fixação ou sutura dos 14 pedículo renal. Este modelo requer uma nefrectomia do rim direito desde a isquemia pode ser realizada somente em um rim devido à configuração experimental. Na verdade, usando um sistema de suspensão peso, a artéria renal é apenas instrumentados vez durante todo o procedimento cirúrgico. Além disso, nenhuma obstrução venosa ou uretral ocorre com esta técnica. Poderíamos demonstrar tempo de dose-dependente e altamente reprodutível lesão renal com isquemia através da medição da creatinina sérica. Além disso, quando se compara com este novo modelo convencional de fixação do conjunto de proteção, pedículo renal por pré-condicionamento isquêmico é mais profunda e mais confiável. Portanto, sua nova técnica pode ser útil para outros pesquisadores que estão trabalhando no campo da lesão renal aguda.

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Use of a Hanging-weight System for Isolated Renal Artery Occlusion

Um modelo murino precisa de lesão renal aguda (IRA) devido à isquemia é uma ferramenta importante para investigar lesão renal aguda e, eventualmente, encontrar ferramentas terapêuticas para tratar a lesão renal. O sistema de suspensão de peso oferece uma ferramenta para a oclusão da artéria renal imediata e confiável e reperfusão sem causar congestão renal.

Uso de um sistema de suspensão de peso para oclusão da artéria renal isolada

In hospitalized patients, over 50% of cases of acute kidney injury (AKI) are caused by renal ischemia 1-3. A recent study of hospitalized patients ...

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15.9K visualizações.  University of Colorado. Um modelo murino precisa de lesão renal aguda (IRA) devido à isquemia é uma ferramenta importante para investigar lesão renal aguda e, eventualmente, encontrar ferramentas terapêuticas para tratar a lesão renal. O sistema de suspensão de peso oferece uma ferramenta para a oclusão da artéria renal imediata e confiável e reperfusão sem causar congestão renal.

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Modeling Stroke in Mice - Middle Cerebral Artery Occlusion with the Filament Model

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are very limited. To meet the need for novel therapeutic approaches, experimental stroke research frequently employs rodent models of focal cerebral ischaemia. Most researchers use permanent or transient occlusion of the middle cerebral artery (MCA) in mice or rats.
Proximal occlusion of the middle cerebral artery (MCA) via the intraluminal suture technique (so called filament or suture model) is probably the most frequently used model in experimental stroke research. The intraluminal MCAO model offers the advantage of inducing reproducible transient or permanent ischaemia of the MCA territory in a relatively non-invasive manner. Intraluminal approaches interrupt the blood flow of the entire territory of this artery. Filament occlusion thus arrests flow proximal to the lenticulo-striate arteries, which supply the basal ganglia. Filament occlusion of the MCA results in reproducible lesions in the cortex and striatum and can be either permanent or transient. In contrast, models inducing distal (to the branching of the lenticulo-striate arteries) MCA occlusion typically spare the striatum and primarily involve the neocortex. In addition these models do require craniectomy. In the model demonstrated in this article, a silicon coated filament is introduced into the common carotid artery and advanced along the internal carotid artery into the Circle of Willis, where it blocks the origin of the middle cerebral artery. In patients, occlusions of the middle cerebral artery are among the most common causes of ischaemic stroke. Since varying ischemic intervals can be chosen freely in this model depending on the time point of reperfusion, ischaemic lesions with varying degrees of severity can be produced. Reperfusion by removal of the occluding filament at least partially models the restoration of blood flow after spontaneous or therapeutic (tPA) lysis of a thromboembolic clot in humans.
In this video we will present the basic technique as well as the major pitfalls and confounders which may limit the predictive value of this model.

Filamentous occlusion of the Middle cerebral artery is a common model for studying ischemic stroke in mice.

Curso de modelagem em Ratos - Oclusão da Artéria Cerebral Média com o modelo de Filamento

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are ...

Medicina

Use of a Hanging Weight System for Coronary Artery Occlusion in Mice

Murine studies of acute injury are an area of intense investigation, as knockout mice for different genes are becoming increasingly available 1-38. Cardioprotection by ischemic preconditioning (IP) remains an area of intense investigation. To further elucidate its molecular basis, the use of knockout mouse studies is particularly important 7, 14, 30, 39. Despite the fact that previous studies have already successfully performed cardiac ischemia and reperfusion in mice, this model is technically very challenging. Particularly, visual identification of the coronary artery, placement of the suture around the vessel and coronary occlusion by tying off the vessel with a supported knot is technically difficult. In addition, re-opening the knot for intermittent reperfusion of the coronary artery during IP without causing surgical trauma adds additional challenge. Moreover, if the knot is not tied down strong enough, inadvertent reperfusion due to imperfect occlusion of the coronary may affect the results. In fact, this can easily occur due to the movement of the beating heart.
Based on potential problems associated with using a knotted coronary occlusion system, we adopted a previously published model of chronic cardiomyopathy based on a hanging weight system for intermittent coronary artery occlusion during IP 39. In fact, coronary artery occlusion can thus be achieved without having to occlude the coronary by a knot. Moreover, reperfusion of the vessel can be easily achieved by supporting the hanging weights which are in a remote localization from cardiac tissues.
We tested this system systematically, including variation of ischemia and reperfusion times, preconditioning regiments, body temperature and genetic backgrounds39. In addition to infarct staining, we tested cardiac troponin I (cTnI)
as a marker of myocardial infarction in this model. In fact, plasma levels of cTnI correlated with infarct sizes (R2=0.8). Finally, we could show in several studies that this technique yields highly reproducible infarct sizes during murine IP and myocardial infarction6, 8, 30, 40, 41. Therefore, this technique may be helpful for researchers who pursue molecular mechanisms involved in cardioprotection by IP using a genetic approach in mice with targeted gene deletion. Further studies on cardiac IP using transgenic mice may consider this technique.

A murine model for myocardial ischemia and ischemic preconditioning is an important tool study cardioprotective mechanisms in vivo. Here, we report an easy applicable in situ model for cardiac IP using a hanging-weight system for coronary artery occlusion.

Uso de um Sistema de Peso de suspensão para oclusão da artéria coronária em ratos

Murine studies of acute injury are an area of intense investigation, as knockout mice for different genes are becoming increasingly available 1-38. ...

Use of a Hanging-weight System for Liver Ischemia in Mice

Acute liver injury due to ischemia can occur during several clinical procedures e.g. liver transplantation, hepatic tumor resection or trauma repair and can result in liver failure which has a high mortality rate1-2. Therefore murine studies of hepatic ischemia have become an important field of research by providing the opportunity to utilize pharmacological and genetic studies3-9. Specifically, conditional mice with tissue specific deletion of a gene (cre, flox system) provide insights into the role of proteins in particular tissues10-13 . Because of the technical difficulty associated with manually clamping the portal triad in mice, we performed a systematic evaluation using a hanging-weight system for portal triad occlusion which has been previously described3. By using a hanging-weight system we place a suture around the left branch of the portal triad without causing any damage to the hepatic lobes, since also the finest clamps available can cause hepatic tissue damage because of the close location of liver tissue to the vessels. Furthermore, the right branch of the hepatic triad is still perfused thus no intestinal congestion occurs with this technique as blood flow to the right hepatic lobes is preserved. Furthermore, the portal triad is only manipulated once throughout the entire surgical procedure. As a result, procedures like pre-conditioning, with short times of ischemia and reperfusion, can be easily performed. Systematic evaluation of this model by performing different ischemia and reperfusion times revealed a close correlation of hepatic ischemia time with liver damage as measured by alanine (ALT) and aspartate (AST) aminotransferase serum levels3,9. Taken together, these studies confirm highly reproducible liver injury when using the hanging-weight system for hepatic ischemia and intermittent reperfusion. Thus, this technique might be useful for other investigators interested in liver ischemia studies in mice. Therefore the video clip provides a detailed step-by-step description of this technique.

We established a novel murine model of a hanging weight system for portal triad occlusion. This technique may be useful for future investigations of ischemia in murine hepatic models.

A utilização de uma suspensão do sistema de peso para isquemia hepática em ratos

Acute liver injury due to ischemia can occur during several clinical procedures e.g. liver transplantation, hepatic tumor resection or trauma repair and ...

Mouse Model of Middle Cerebral Artery Occlusion

Stroke is the most common fatal neurological disease in the United States 1. The majority of strokes (88%) result from blockage of blood vessels in the brain (ischemic stroke) 2. Since most ischemic strokes (~80%) occur in the territory of middle cerebral artery (MCA) 3, many animal stroke models that have been developed have focused on this artery. The intraluminal monofilament model of middle cerebral artery occlusion (MCAO) involves the insertion of a surgical filament into the external carotid artery and threading it forward into the internal carotid artery (ICA) until the tip occludes the origin of the MCA, resulting in a cessation of blood flow and subsequent brain infarction in the MCA territory 4. The technique can be used to model permanent or transient occlusion 5. If the suture is removed after a certain interval (30 min, 1 h, or 2 h), reperfusion is achieved (transient MCAO); if the filament is left in place (24 h) the procedure is suitable as a model of permanent MCAO. This technique does not require craniectomy, a neurosurgical procedure to remove a portion of skull, which may affect intracranial pressure and temperature 6. It has become the most frequently used method to mimic permanent and transient focal cerebral ischemia in rats and mice 7,8. To evaluate the extent of cerebral infarction, we stain brain slices with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) to identify ischemic brain tissue 9. In this video, we demonstrate the MCAO method and the determination of infarct size by TTC staining.

We demonstrate in the video a method for producing a middle cerebral artery occlusion in adult mice using an intraluminal monofilament. We also show how to evaluate the extent of cerebral infarction by 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining.

Modelo do rato de Oclusão da Artéria Cerebral Média

Stroke is the most common fatal neurological disease in the United States 1. The majority of strokes (88%) result from blockage of blood vessels in the ...

Use of Animal Model of Sepsis to Evaluate Novel Herbal Therapies

Sepsis refers to a systemic inflammatory response syndrome resulting from a microbial infection. It has been routinely simulated in animals by several techniques, including infusion of exogenous bacterial toxin (endotoxemia) or bacteria (bacteremia), as well as surgical perforation of the cecum by cecal ligation and puncture (CLP)1-3. CLP allows bacteria spillage and fecal contamination of the peritoneal cavity, mimicking the human clinical disease of perforated appendicitis or diverticulitis. The severity of sepsis, as reflected by the eventual mortality rates, can be controlled surgically by varying the size of the needle used for cecal puncture2. In animals, CLP induces similar, biphasic hemodynamic cardiovascular, metabolic, and immunological responses as observed during the clinical course of human sepsis3. Thus, the CLP model is considered as one of the most clinically relevant models for experimental sepsis1-3.
Various animal models have been used to elucidate the intricate mechanisms underlying the pathogenesis of experimental sepsis. The lethal consequence of sepsis is attributable partly to an excessive accumulation of early cytokines (such as TNF, IL-1 and IFN-&gamma;)4-6 and late proinflammatory mediators (e.g., HMGB1)7. Compared with early proinflammatory cytokines, late-acting mediators have a wider therapeutic window for clinical applications. For instance, delayed administration of HMGB1-neutralizing antibodies beginning 24 hours after CLP, still rescued mice from lethality8,9, establishing HMGB1 as a late mediator of lethal sepsis. The discovery of HMGB1 as a late-acting mediator has initiated a new field of investigation for the development of sepsis therapies using Traditional Chinese Herbal Medicine. In this paper, we describe a procedure of CLP-induced sepsis, and its usage in screening herbal medicine for HMGB1-targeting therapies.

Sepsis refers to a systemic inflammatory response syndrome resulting from a microbial infection, and can be simulated by a surgical technique termed cecal ligation and puncture (CLP). Here we describe a method to use CLP-induced animal model to screen medicinal herbs for therapeutic agents.

Uso de Modelo Animal de Sepse para avaliar novas terapias à base de plantas

Sepsis refers to a systemic inflammatory response syndrome resulting from a microbial infection. It has been routinely simulated in animals by several ...

Utilizing a Cranial Window to Visualize the Middle Cerebral Artery During Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion

Creation of a cranial window is a method that allows direct visualization of structures on the cortical surface of the brain1-3. This technique can be performed in many locations overlying the rat cerebrum, but is most easily carried out by creating a craniectomy over the readily accessible frontal or parietal bones. Most frequently, we have used this technique in combination with the endothelin-1 middle cerebral artery occlusion model of ischemic stroke to quantify the changes in middle cerebral artery vessel diameter that occur with injection of endothelin-1 into the brain parenchyma adjacent to the proximal MCA4, 5. In order to visualize the proximal portion of the MCA during endothelin -1 induced MCAO, we use a technique to create a cranial window through the temporal bone on the lateral aspect of the rat skull (Figure 1). Cerebral arteries can be visualized either with the dura intact or with the dura incised and retracted. Most commonly, we leave the dura intact during visualization since endothelin-1 induced MCAO involves delivery of the vasoconstricting peptide into the brain parenchyma. This bypasses the need to incise the dura directly over the visualized vessels for drug delivery. This protocol will describe how to create a cranial window to visualize cerebral arteries in a step-wise fashion, as well as how to avoid many of the potential pitfalls pertaining to this method.

This article describes a method for visualizing rat cerebral arteries through a cranial window using temporal craniectomy in order to view proximal portions of the middle cerebral artery (Figure 1). This versatile method can be combined with various techniques of drug delivery to measure cerebral artery reactivity in vivo.

Utilizando uma janela craniana para Visualizar a artéria cerebral média Durante endotelina 1 Induzida por oclusão da artéria cerebral média

Creation of a cranial window is a method that allows direct visualization of structures on the cortical surface of the brain1-3. This technique can be ...

Optimized System for Cerebral Perfusion Monitoring in the Rat Stroke Model of Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion

The translational potential of pre-clinical stroke research depends on the accuracy of experimental modeling. Cerebral perfusion monitoring in animal models of acute ischemic stroke allows to confirm successful arterial occlusion and exclude subarachnoid hemorrhage. Cerebral perfusion monitoring can also be used to study intracranial collateral circulation, which is emerging as a powerful determinant of stroke outcome and a possible therapeutic target. Despite a recognized role of Laser Doppler perfusion monitoring as part of the current guidelines for experimental cerebral ischemia, a number of technical difficulties exist that limit its widespread use. One of the major issues is obtaining a secure and prolonged attachment of a deep-penetration Laser Doppler probe to the animal skull. In this video, we show our optimized system for cerebral perfusion monitoring during transient middle cerebral artery occlusion by intraluminal filament in the rat. We developed in-house a simple method to obtain a custom made holder for twin-fibre (deep-penetration) Laser Doppler probes, which allow multi-site monitoring if needed. A continuous and prolonged monitoring of cerebral perfusion could easily be obtained over the intact skull.

Cerebral perfusion monitoring has been demonstrated to improve accuracy in ischemic stroke models. Technical difficulties often limit the use of this essential tool for cerebrovascular research. In this video, an optimized system is shown to obtain a single or multi-site hemodynamic monitoring during intraluminal middle cerebral artery occlusion in rats.

Sistema otimizado para Monitorização de perfusão cerebral no modelo do rato do curso de oclusão da artéria cerebral média intraluminal

The translational potential of pre-clinical stroke research depends on the accuracy of experimental modeling. Cerebral perfusion monitoring in animal ...

An Isolated Working Heart System for Large Animal Models

Since its introduction in the late 19th century, the Langendorff isolated heart perfusion apparatus, and the subsequent development of the working heart model, have been invaluable tools for studying cardiovascular function and disease1-15. Although the Langendorff heart preparation can be used for any mammalian heart, most studies involving this apparatus use small animal models (e.g., mouse, rat, and rabbit) due to the increased complexity of systems for larger mammals1,3,11. One major difficulty is ensuring a constant coronary perfusion pressure over a range of different heart sizes &#8211; a key component of any experiment utilizing this device1,11. By replacing the classic hydrostatic afterload column with a centrifugal pump, the Langendorff working heart apparatus described below allows for easy adjustment and tight regulation of perfusion pressures, meaning the same set-up can be used for various species or heart sizes. Furthermore, this configuration can also seamlessly switch between constant pressure or constant flow during reperfusion, depending on the user&#8217;s preferences. The open nature of this setup, despite making temperature regulation more difficult than other designs, allows for easy collection of effluent and ventricular pressure-volume data.

Most studies involving the Langendorff apparatus use small animal models due to the increased complexity of systems for larger mammals. We describe a Langendorff system for large animal models that allows for use across a range of species, including humans, and relatively easy data acquisition.

Um Sistema de coração isolado para Grandes Modelos Animais

Since its introduction in the late 19th century, the Langendorff isolated heart perfusion apparatus, and the subsequent development of the working heart ...

Surgical Approach for Middle Cerebral Artery Occlusion and Reperfusion Induced Stroke in Mice

Stroke is a leading cause of death worldwide and continues to be one of the major causes of long-term adult disabilities. About 87% of strokes are ischemic in origin and occur in the territory of the middle cerebral artery (MCA). Currently the only Food and Drug Administration (FDA) approved drug for the treatment of this devastating disease is tissue plasminogen activator (tPA). However, tPA has a small therapeutic window for administration (3 - 6 hr), and is only effective in 4% of the patients who actually receive it. Current research focuses on understanding the pathophysiology of stroke in order to find potential therapeutic targets. Thus, reliable models are crucial, and the MCA occlusion (MCAo) model (also termed the intraluminal filament or suture model) is deemed to be the most clinically relevant surgical model of ischemic stroke, and is fairly non-invasive and easily reproducible. Typically the MCAo model is used with rodents, especially with mice due to all the genetic variations available for this species. Here we describe (and present in the video) how to successfully perform the MCAo model (with reperfusion) in mice to generate reliable and reproducible data.

In order to understand the pathophysiology of stroke, it is important to use reliable models. This paper will describe one of the most frequently used stroke models in mice, termed the middle cerebral artery occlusion (MCAo) model (also termed the intraluminal filament or suture model) with reperfusion.

Abordagem cirúrgica para oclusão da artéria cerebral média e reperfusão induzida por acidente vascular cerebral em ratos

Stroke is a leading cause of death worldwide and continues to be one of the major causes of long-term adult disabilities. About 87% of strokes are ...

Middle Cerebral Artery Occlusion Allowing Reperfusion via Common Carotid Artery Repair in Mice

The ischemic stroke is a major cause of adult long-term disability and death worldwide. The current treatments available are limited, with only tissue plasminogen activator (tPA) as an approved drug treatment to target ischemic strokes. Current research in the field of ischemic stroke focuses on better understanding the pathophysiology of stroke, to develop and investigate novel pharmaceutical targets. Reliable experimental stroke models are crucial for the progression of potential treatments. The middle cerebral artery occlusion (MCAO) model is clinically relevant and the most frequently used surgical model of ischemic stroke in rodents. However, the outcomes of this model, such as lesion volume, are associated with high levels of variability, particularly in mice. The alternative MCAO model described here allows the reperfusion of the common carotid artery (CCA) and the increased perfusion of the middle cerebral artery (MCA) territory, using a tissue pad with fibrinogen-based sealant to repair the vessel, and the improved welfare of the mice by avoiding external carotid artery (ECA) ligation. This reduces the reliance on the Circle of Willis, which is known to be highly anatomically variable in mice. Representative data show that using this alternative surgical approach decreases the variability in lesion volumes between the traditional MCAO approach and the alternative approach described here.

Intraluminal filament occlusion of the middle cerebral artery is the most frequently used in vivo model of experimental stroke in rodents. An alternative surgical approach to allow common carotid artery repair is performed here, which allows the reperfusion of the common carotid artery and a full reperfusion to the middle cerebral artery territory.

Oclusão de artéria Cerebral média, permitindo a reperfusão através de reparação de artéria carótida comum em ratos

The ischemic stroke is a major cause of adult long-term disability and death worldwide. The current treatments available are limited, with only tissue ...