Esta investigación es apoyada por la Fundación Nacional de Ciencias otorgado a JOD (OCE-0623475), SPC (OCE-0623534 y 0727544), y JHC (OCE-0727587 y 0623508 OCE), y por la Oficina de Investigación Naval otorgado a JHC ( N000140810654). KK es apoyado por el Programa de becas postdoctorales en la Institución Oceanográfica Woods Hole, con fondos aportados por la Fundación de Devonshire.

<ol><li> Para iniciar este procedimiento, nos aseguramos de que todos los componentes de SCUVA tendrá energía suficiente, la cinta de grabación (para la alta definición o una cámara de vídeo de alta definición), y funcionar correctamente. En función de los flujos a medir, seleccionar la resolución de la cámara de vídeo y velocidad de fotogramas que producen los mejores resultados para la velocimetría digital de imágenes de partículas (DPIV) 1,2. </li><li> Prepare las viviendas láser y cámara para su uso por la limpieza de las ranuras de la junta tórica y las juntas tóricas con una toalla limpia o limpie. Fabricante de propagación siempre o-anillo de la grasa de manera uniforme en las juntas tóricas y vuelva a colocar en las ranuras de la vivienda. Además, limpiar las aberturas de la vivienda con láser y la cámara para evitar la deformación láser hoja y marcas en la lente de carcasa de la cámara. </li><li> Revise los empaques de anillo o-mediante la colocación de dos viviendas vacías en una bañera llena de agua. Objetos ponderada tendrá que ser colocado en la parte superior de las viviendas para sumergirlos ya que las viviendas flotan cuando están vacíos. Después de 5 a 10 minutos, retire las cubiertas de la tina y t seque con una toallaque fuera. Compruebe si hay alguna humedad en el interior de la carcasa. También considerar el uso de tiras desechables, la humedad del papel durante la prueba de presión para indicar si hay humedad en las viviendas después de la prueba. </li><li> Después de las cajas de pasar la prueba de presión, colocar los componentes en el interior del SCUVA viviendas. </li><li> Adjuntar descarga de alta intensidad (HID) las vainas ligeras, a la carcasa de la cámara. Asegúrese de que las luces están orientados de tal manera que iluminen la zona justo delante de la cámara y el operador, y no interfieren con el mantenimiento de agarre en las asas y el funcionamiento de los controles de la cámara. </li><li> En un entorno con poca luz, asegúrese de que el rayo láser está alineada con respecto a la lente óptica instalada en la carcasa del láser. Cuando está bien alineado, la combinación de láser / objetivo se creará una lámina vertical de la luz que está orientado perpendicular a la carcasa de la cámara. Por razones de seguridad, use una hoja sensibles a la temperatura de trabajo para determinar la orientación láser hoja. </li&gt; <li> Uso de archivos adjuntos SCUVA y el brazo rígido, prorrogable, conecte la carcasa del láser y la carcasa de la cámara a la otra. Asegúrese de que las viviendas están conectados firmemente y que las viviendas no se puede girar con respecto a la otra. Es muy importante que la hoja de láser sigue siendo orientado perpendicular al campo de la cámara de vista a través de la medición. </li><li> Debido a las capacidades actuales de SCUVA, inmersiones medida sólo puede llevarse a cabo en lugares de poca luz o por la noche para evitar la interferencia de la luz natural con la hoja de láser. Por lo tanto, se recomienda esperar hasta la noche o más tarde, antes de entrar al agua. </li><li> A su vez en la carcasa de la cámara antes de entrar al agua. La carcasa de la cámara tiene un sensor integrado de humedad electrónico que proporciona avisos visuales (luces LED) en el caso de la humedad en la carcasa de la cámara. El sensor sólo funciona cuando la carcasa de la cámara está encendida. </li><li> Sumergir en agua SCUVA y conecte el aparato a ti mismo utilizandouna línea. Una vez conectado el aparato, en comunicado de SCUVA para determinar la flotabilidad del dispositivo. Dependiendo de las características de flotabilidad, coloque espuma de flotabilidad o llevar pesos a uno o viviendas, tanto para garantizar una flotabilidad neutra y evitar la rotación del aparato en el agua. </li><li> A continuación, encender el láser y mantener los aparatos fijos. La posición del láser con el brazo extensible suficientemente lejos del buzo para reducir al mínimo la medición de los diver-inducida por los flujos. Cualquier medida de buzo inducida fluye cerca de la meta de introducir un error y no se utilizan para su posterior análisis. Ajustar el zoom de la cámara hasta que el campo de los marcos de vista el objetivo y el líquido circundante. </li><li> Mientras se mantiene el aparato parado, el enfoque de la cámara de video en la hoja de láser hasta que las partículas aparecen nítidas y en foco. Una vez que el avión de hoja de láser es enfocado, conecte la cámara al modo de enfoque manual. Esto evitará que la cámara de volver a centrarse en los objetos que aparecen en el campo de lavista durante la medición, resultando en partículas borrosa en la hoja de láser. </li><li> Para calibrar SCUVA, coloque un objeto de dimensiones conocidas en la hoja de láser dentro del campo de la cámara de vídeo de vista. Registro durante varios segundos. Después de la inmersión, la imagen se puede extraer de esta secuencia de vídeo para determinar una constante de calibración que convierte el campo visual de las unidades de píxeles cm. Si en algún momento el operador ajusta el campo visual se vuelva a la posición del brazo extensible o cambiar el zoom de la cámara durante la inmersión, los pasos 12 y 13 tendrá que ser repetido. </li><li> Comenzar la inmersión al descender a la profundidad de trabajo. Al encontrar un objetivo, las propiedades de mayor caudal ambiental debe ser determinada. Si está presente, la dirección de la corriente dictará aparatos y posicionamiento en relación con el buzo blanco durante las mediciones. La dirección del flujo de masa que rodea el objetivo se puede inferir al observar burbujas exhalado por el buceador y observando su movimiento lateral. EnAdemás de burbujas, una pequeña cantidad de colorante fluorescente (es decir, la fluoresceína) puede ser liberado para determinar la dirección de la corriente. Desde diversidad generó un flujo puede ser una fuente de errores de medición DPIV, el saltador no debe estar ubicado aguas arriba de la meta. Además, la hoja de láser debe ser colocado en paralelo a la dirección de la corriente con el fin de maximizar el tiempo de residencia de las partículas dentro de la hoja de láser, lo que minimiza los errores DPIV. Sin embargo, si hay flujo de corriente o la mayor parte está presente, buceo y posicionamiento de SCUVA en relación con el objetivo no tienen restricciones. </li><li> Posición de SCUVA para iluminar y registrar el movimiento del fluido que rodea un objetivo. Si intenta registrar el flujo alrededor de un objetivo en movimiento primero predecir la ubicación de la meta, y luego SCUVA posición a la ubicación prevista, mientras que permanecer inmóvil. Como el objetivo se mueve a través del campo de la cámara de vista, comenzar a grabar. Si el objetivo no se mueve, marco el objetivo y el líquido que rodea la cámara de vídeo y# X2019; s de campo de vista y empezar a grabar sin dejar de ser inmóvil. El operador debe abstenerse de movimientos de rotación y fuera de plano durante la grabación de vídeo, ya que estos movimientos en consecuencia resultados erróneos DPIV. Por lo tanto, las medidas recogidas en rotación y fuera del plano de movimientos buzo no serán utilizados para análisis de datos. </li><li> Una vez que la colección de vídeo se ha completado, apague todos los componentes de SCUVA y restaurar el brazo láser para su posición retraída. Quitar SCUVA del agua y desconectar la cámara y el láser de viviendas en el brazo. Enjuague o sumerja el aparato en agua dulce antes de su secado para evitar la oxidación de los aparatos. Una vez que las viviendas se han secado, eliminar los componentes de las viviendas, y la recarga de baterías y reemplazar si es necesario para una nueva inmersión. </li><li> Conecte la cámara de vídeo a un ordenador y el extracto de vídeo desde la cinta de alta definición mediante el uso de un vídeo de alta definición paquete de software (por ejemplo, Adobe Premiere Pro o iMovie). Después de que el vídeo se extrae, determinar el rango dede vídeo a convertir en una serie de imágenes para el análisis DPIV. Asegúrese de que las relaciones de aspecto de píxeles y tamaños de imágenes extraídas coinciden con la configuración de vídeo HD. </li><li> Estas imágenes se importan a un programa de procesamiento de DPIV (es decir, Davis o MatPIV). Después de la selección adecuada de la constante de calibración y los parámetros de captura de imágenes, que se le pide desde el paquete de software DPIV, campos de velocidad pueden ser generados a partir de imágenes de partículas consecutivos. Adicionales de procesamiento de los pasos posteriores, en función de la calidad y el tipo de medidas, también se pueden aplicar 3. </li></ol> Los resultados representativos: Cuando el protocolo se hace correctamente, las imágenes de partículas que rodea el objetivo es clara y fácil de distinguir. Utilizando los campos de las partículas capturadas in situ por la cámara de vídeo SCUVA (Figura 1A) y un paquete de procesamiento de DPIV software, los campos de velocidades de flujo que rodea el objetivo (fig. 1B) se dará a conocer. Vectores en el Velocidad de campo indican la magnitud y la dirección de la velocidad de flujo local. Si el vídeo se recogen suficientes para proporcionar una serie temporal de imágenes, una serie temporal de los campos de la velocidad también se puede determinar. <img src="/files/ftp_upload/2615/2615fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1 Medido en los campos de partículas in situ (A) en torno a Aurelia labiata. Campo de velocidades correspondiente (B) con los vectores de color amarillo que indica la dirección del flujo y la magnitud. <img src="/files/ftp_upload/2615/2615fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2 En los campos de partículas in situ alrededor Mastigias sp. Y Solmissus sp. (A y B, respectivamente). Una flecha roja indica en una región de alta reflectividad, lo que se traduce en la saturación de la imagen, por lo que es difícil distinguir entre las partículas y el objetivo. Flecha roja en la B indica una región de rayas que se produce cuando el caudal esno muestreadas a una frecuencia lo suficientemente alta.

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	<li>Adrian, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-imaging+techniques+for+experimental+fluid+mechanics.">Particle-imaging techniques for experimental fluid mechanics.</a> Ann. Rev. Fluid Mech. 23, 261-304 (1991).</li><li>Willert, C. E., Gharib, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+particle+image+velocimetry.">Digital particle image velocimetry.</a> Exp. Fluids. 10, 181-193 (1991).</li><li>Raffel, M., Willert, C., Wereley, S., Kompenhans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Particle Image Velocimetry: A Practical Guide. , (2007).</li><li>Agrawal, Y. C., Pottsmith, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+diffraction+particle+sizing+in+STRESS.">Laser diffraction particle sizing in STRESS.</a> Cont. Shelf Res. 14, 1101-1121 (1994).</li><li>Katz, J., Donaghay, P. L., Zhang, J., King, S., Russell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submersible+holocamera+for+detection+of+particle+characteristics+and+motions+in+the+ocean.">Submersible holocamera for detection of particle characteristics and motions in the ocean.</a> Deep Sea Res. 46, 1455-1481 (1999).</li><li>Katija, K., Dabiri, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+field+measurements+of+aquatic+animal-fluid+interactions+using+a+self-contained+underwater+velocimetry+apparatus+(SCUVA).">In situ field measurements of aquatic animal-fluid interactions using a self-contained underwater velocimetry apparatus (SCUVA).</a> Limnol. Oceanogr.-Meth. 6, 162-171 (2008).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Una limitación potencial en el campo es la necesidad de que las partículas en el flujo, que son necesarios para implementar la velocimetría digital de imágenes de partículas (DPIV). En las aguas costeras, las partículas en suspensión presenta los tamaños del orden de 10 micras de diámetro y las concentraciones entre 0,002 y 10 por mm 3. 4 estudios adicionales utilizando un holocamera sumergibles para la detección de partículas confirmar la presencia suficiente de la siembra de partículas para realizar DPIV en el agua del océano. Durante 5 mar y el buceo océano costero, hemos encontrado que las densidades de las partículas y las medidas no son un obstáculo para llevar a cabo in situ DPIV. Aparte de las densidades de las partículas y tamaños, otro aspecto de gran relevancia para las mediciones DPIV es la homogeneidad de las concentraciones de partículas. Cualitativamente, si una región dentro de una ventana de interrogación tiene una mayor concentración de partículas que el otro, la magnitud de la velocidad generada por la DAnálisis de PIV se corregirá hacia la región con mayor concentración de partículas. Por lo tanto, las mediciones de SCUVA debe llevarse a cabo donde la variabilidad concentración de partículas se reduce al mínimo. Se encontraron concentraciones thatcle son relativamente constantes durante las concentraciones de partículas son relativamente constantes durante las inmersiones en el que se suspende el buzo en medio de la columna de agua. Sin embargo, los campos de partículas en ambientes bentónicos tienen el potencial de la falta de homogeneidad debido a la resuspensión de partículas por el medio ambiente o buzo inducida fluye cerca del fondo del mar. Se debe tener cuidado para minimizar la interrupción de las partículas durante las mediciones en ambientes bentónicos. Para conocimiento de los autores, un análisis formal de los errores generados por los campos de concentración de partículas no homogénea, no ha llevado a cabo ya sea en condiciones de laboratorio o de campo, y debe ser objeto de consideración en una publicación aparte. Diversas cuestiones deben ser considerados en la preparación yla realización de experimentos in situ utilizando el protocolo. Durante la grabación, el operador tiene instrucciones de permanecer inmóvil y se abstengan de todo fuera del avión y el movimiento de rotación. Esta petición es simple en teoría pero difícil en la práctica, y estas medidas requieren de la habilidad de buceo avanzado que se ha completado correctamente. Fuera del plano y movimientos de rotación de los resultados del operador en datos erróneos DPIV. Sin embargo, en el plano movimientos pueden ser corregidos mediante el uso de la casa de software. 6 Se recomienda al operador para practicar el control de la flotabilidad de varias inmersiones antes de usar SCUVA para maximizar la eficiencia de medición. Además de las consideraciones de flotación, el operador debe estar al tanto de la dirección del flujo de destino. Flujos que viajan fuera de plano relativo a la hoja de láser no dará resultados fiables DPIV, y el operador debe orientar SCUVA para captar esos flujos más eficazmente. Además, la posición del buceador en relación con el blanco debe ser selected para reducir al mínimo el flujo inducido por buzo en las mediciones. Diver-inducidas por el flujo introduce un error en el flujo de destino, y las mediciones que incluyen los efectos buzo no debe utilizarse para su posterior análisis. En el caso de que el destino tiene una superficie altamente reflectante, la región de líquido que rodea el objetivo será fuertemente iluminado, lo que hace difícil distinguir entre cerca de las partículas individuales de fluido que la rodea (la región indicada por la flecha roja, Figura 2A). Los filtros polarizadores o se pueden agregar a las cajas de láser o de la cámara para reducir la intensidad de la luz láser capturados por el sensor de la cámara de vídeo. Si esto no es posible debido a limitaciones logísticas y de acceso limitado a los equipos de post-procesamiento de imágenes utilizando el software de la casa puede proporcionar la corrección suficiente restando de las imágenes de las intensidades de los píxeles elevadas cerca de la meta. Otra consideración que afecta a la calidad de los datos es si DPIV rayas de partículas están presentes. Si la partículacampos tienen las regiones de rayas (indicado por la flecha roja, Figura 2B), la cámara de vídeo graba a una velocidad demasiado baja como para resolver estas altas velocidades. Al aumentar la velocidad de cuadros, rayas de partículas se pueden reducir. Sin embargo, esto se traduce en una reducción de la luz que llega al sensor de la cámara de vídeo y hace que el campo de partículas tenue mirada. Si la cámara de video tiene la capacidad de configurar manualmente los valores de apertura, aumentar el ajuste de la abertura para evitar oscurecimiento del campo de partículas. Determinar la configuración óptima del dispositivo puede requerir varias inmersiones con SCUVA antes de la recolección de datos con éxito.

quantitatively measuring in situ flows using a self-contained underwater velocimetry apparatus (scuva)

La capacidad de medir directamente los campos de velocidades en un ambiente fluido es necesario proporcionar los datos empíricos de los estudios en campos tan diversos como la oceanografía, la ecología, la biología y la mecánica de fluidos. Mediciones de campo introduce cuestiones prácticas, tales como las condiciones ambientales, la disponibilidad de animales, y la necesidad de técnicas de medición de campo compatible. Para evitar estos problemas, los científicos suelen utilizar ambientes controlados de laboratorio para estudiar las interacciones animal-líquido. Sin embargo, es razonable preguntarse si se puede extrapolar el comportamiento natural (es decir, lo que ocurre en el campo) a partir de mediciones de laboratorio. Por lo tanto, in situ las mediciones de flujo cuantitativos son necesarios para describir con precisión la natación de los animales en su ambiente natural. Se diseñó un auto-contenido, el dispositivo portátil que funciona independientemente de cualquier conexión con la superficie, y pueden proporcionar mediciones cuantitativas de la surrou campo de flujonding un animal. Este aparato, un aparato autónomo de velocimetría bajo el agua (SCUVA), puede ser operado por un buzo solo en profundidades de hasta 40 m. Debido a la complejidad inherente a las condiciones del campo, las consideraciones adicionales y la preparación son necesarios cuando se compara con las mediciones de laboratorio. Estos aspectos incluyen, pero no se limitan a, el movimiento del operador, la predicción de la posición de los objetivos de la natación, a disposición de partículas naturales en suspensión, y la orientación de SCUVA en relación con el flujo de intereses. El siguiente protocolo está diseñado para hacer frente a estos desafíos comunes sobre el terreno y para maximizar el éxito de la medida.

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Quantitatively Measuring In situ Flows using a Self-Contained Underwater Velocimetry Apparatus SCUVA

Este protocolo proporciona instrucciones sobre cómo usar un aparato autónomo de velocimetría bajo el agua (SCUVA), que está diseñado para la cuantificación de los animales in situ generados por los flujos. Además, este protocolo aborda los desafíos planteados por las condiciones del campo, e incluye el movimiento del operador, la predicción de la posición de los animales, y la orientación de SCUVA.

La medición cuantitativa de In situ Flujos de utilizar un aparato autónomo Velocimetry Subacuático (SCUVA)

The ability to directly measure velocity fields in a fluid environment is necessary to provide empirical data for studies in fields as diverse as ...

quantitatively-measuring-situ-flows-using-self-contained-underwater

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Quantitatively Measuring In situ Flows using a Self-Contained Underwater Velocimetry Apparatus (SCUVA)

12.9K vistas.  Woods Hole Oceanographic Institution. Este protocolo proporciona instrucciones sobre cómo usar un aparato autónomo de velocimetría bajo el agua (SCUVA), que está diseñado para la cuantificación de los animales in situ generados por los flujos. Además, este protocolo aborda los desafíos planteados por las condiciones del campo, e incluye el movimiento del operador, la predicción de la posición de los animales, y la orientación de SCUVA.

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Electrospinning Fundamentals: Optimizing Solution and Apparatus Parameters

Electrospun nanofiber scaffolds have been shown to accelerate the maturation, improve the growth, and direct the migration of cells in vitro. Electrospinning is a process in which a charged polymer jet is collected on a grounded collector; a rapidly rotating collector results in aligned nanofibers while stationary collectors result in randomly oriented fiber mats. The polymer jet is formed when an applied electrostatic charge overcomes the surface tension of the solution. There is a minimum concentration for a given polymer, termed the critical entanglement concentration, below which a stable jet cannot be achieved and no nanofibers will form - although nanoparticles may be achieved (electrospray). A stable jet has two domains, a streaming segment and a whipping segment. While the whipping jet is usually invisible to the naked eye, the streaming segment is often visible under appropriate lighting conditions. Observing the length, thickness, consistency and movement of the stream is useful to predict the alignment and morphology of the nanofibers being formed. A short, non-uniform, inconsistent, and/or oscillating stream is indicative of a variety of problems, including poor fiber alignment, beading, splattering, and curlicue or wavy patterns. The stream can be optimized by adjusting the composition of the solution and the configuration of the electrospinning apparatus, thus optimizing the alignment and morphology of the fibers being produced. In this protocol, we present a procedure for setting up a basic electrospinning apparatus, empirically approximating the critical entanglement concentration of a polymer solution and optimizing the electrospinning process. In addition, we discuss some common problems and troubleshooting techniques.

Electrospinning techniques can create a variety of nanofibrous scaffolds for tissue engineering or other applications. We describe here a procedure to optimize the parameters of the electrospinning solution and apparatus to obtain fibers with the desired morphology and alignment. Common problems and troubleshooting techniques are also presented.

Fundamentos electrospinning: Solución de Optimización de los parámetros y aparatos

Electrospun nanofiber scaffolds have been shown to accelerate the maturation, improve the growth, and direct the migration of cells in vitro. ...

Investigación

Bioingeniería

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

La creación de dos dimensiones con dibujos sustratos para el confinamiento de proteínas y células

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Micro-particle Image Velocimetry for Velocity Profile Measurements of Micro Blood Flows

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to give an accurate velocity profile. A protocol is presented for &mu;PIV measurements of blood flows in microchannels. At the scale of the microcirculation, blood cannot be considered a homogeneous fluid, as it is a suspension of flexible particles suspended in plasma, a Newtonian fluid. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate can be derived from these measurements. Several key parameters such as focal depth, particle concentration, and system compliance, are presented in order to ensure accurate, useful data along with examples and representative results for various hematocrits and flow conditions.

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows which are cross-correlated to give an accurate velocity profile. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate, each of which has clinical applications, can be derived from these measurements.

Velocímetro de Micro-partículas para Velocity perfil mediciones de flujos de sangre Micro

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Medición de las propiedades mecánicas de las células vivas mediante microscopía de fuerza atómica

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an additional application for these instruments- viewing viral assemblies in a liquid environment. This exciting and novel method of visualizing biological structures utilizes a recently developed microfluidic-based specimen holder. Our video article demonstrates how to assemble and use a microfluidic holder to image liquid specimens within a TEM. In particular, we use simian rotavirus double-layered particles (DLPs) as our model system. We also describe steps to coat the surface of the liquid chamber with affinity biofilms that tether DLPs to the viewing window. This permits us to image assemblies in a manner that is suitable for 3D structure determination. Thus, we present a first glimpse of subviral particles in a native liquid environment.

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Here we describe a procedure to image viral complexes in liquid at nanometer resolution using a transmission electron microscope.

In situ TEM de Ensamblajes Biológicos en Líquido

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an ...

Custom-designed Laser-based Heating Apparatus for Triggered Release of Cisplatin from Thermosensitive Liposomes with Magnetic Resonance Image Guidance

Liposomes have been employed as drug delivery systems to target solid tumors through exploitation of the enhanced permeability and retention (EPR) effect resulting in significant reductions in systemic toxicity. Nonetheless, insufficient release of encapsulated drug from liposomes has limited their clinical efficacy. Temperature-sensitive liposomes have been engineered to provide site-specific release of drug in order to overcome the problem of limited tumor drug bioavailability. Our lab has designed and developed a heat-activated thermosensitive liposome formulation of cisplatin (CDDP), known as HTLC, to provide triggered release of CDDP at solid tumors. Heat-activated delivery in vivo was achieved in murine models using a custom-built laser-based heating apparatus that provides a conformal heating pattern at the tumor site as confirmed by MR thermometry (MRT). A fiber optic temperature monitoring device was used to measure the temperature in real-time during the entire heating period with online adjustment of heat delivery by alternating the laser power. Drug delivery was optimized under magnetic resonance (MR) image guidance by co-encapsulation of an MR contrast agent (i.e.,&#160;gadoteridol) along with CDDP into the thermosensitive liposomes as a means to validate the heating protocol and to assess tumor accumulation. The heating protocol consisted of a preheating period of 5 min prior to administration of HTLC and 20 min heating post-injection. This heating protocol resulted in effective release of the encapsulated agents with the highest MR signal change observed in the heated tumor in comparison to the unheated tumor and muscle. This study demonstrated the successful application of the laser-based heating apparatus for preclinical thermosensitive liposome development and the importance of MR-guided validation of the heating protocol for optimization of drug delivery.

AN MRI-compatible&#160;custom-designed laser-based heating apparatus has been developed to provide local heating of subcutaneous tumors in order to activate release of agents from thermosensitive liposomes specifically at the tumor region.

Diseño personalizado basado en láser máquinas de calentamiento para lanzamiento disparada de cisplatino de termosensible liposomas con Resonancia Magnética Orientación Imagen

Liposomes have been employed as drug delivery systems to target solid tumors through exploitation of the enhanced permeability and retention (EPR) effect ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

En Mapping in situ de las propiedades mecánicas de biopelículas por partículas de seguimiento Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs). This is despite T-cell antigen receptors (TCRs) exerting usually a moderate affinity (&#181;M range) to antigen when binding is measured in vitro1. In view of the molecular and cellular parameters contributing to T-cell antigen sensitivity, a microscopy-based methodology has been developed as a means to monitor TCR-pMHC binding in situ, as it occurs within the synapse of a live T-cell and an artificial and functionalized glass-supported planar lipid bilayer (SLB), which mimics the cell membrane of an Antigen presenting Cell (APC) 2. Measurements are based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between a blue- and red-shifted fluorescent dye attached to the TCR and the pMHC. Because the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the inter-dye distance, one can employ FRET signals to visualize synaptic TCR-pMHC binding. The sensitive of the microscopy approach supports detection of single molecule FRET events. This allows to determine the affinity and off-rate of synaptic TCR-pMHC interactions and in turn to interpolate the on-rate of binding. Analogous assays could be applied to measure other receptor-ligand interactions in their native environment.

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

This manuscript describes how to conduct (single molecule) F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer.

Medición de TCR-pMHC Encuadernación<em&gt; In Situ</em&gt; Usando un ensayo de microscopía basada en FRET

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

Apparatus for Harvesting Tissue Microcolumns

This manuscript describes the production process for a laboratory apparatus, made from off-the-shelf components, that can be used to collect microcolumns of full-thickness skin tissue. The small size of the microcolumns allows donor sites to heal quickly without causing donor site scarring, while harvesting full-thickness tissue enables the incorporation of all cellular and extracellular components of skin tissue, including those associated with deeper dermal regions and the adnexal skin structures, which have yet to be successfully reproduced using conventional tissue engineering techniques. The microcolumns can be applied directly into skin wounds to augment healing, or they can be used as the autologous cell/tissue source for other tissue engineering approaches. The harvesting needles are made by modifying standard hypodermic needles, and they can be used alone for harvesting small amounts of tissue or coupled with a simple suction-based collection system (also made from commonly available laboratory supplies) for high-volume harvesting to facilitate studies in large animal models.

Here we describe a protocol for producing harvesting needles that can be used to collect full-thickness skin tissue without causing donor site scarring. The needles can be combined with a simple collection system to achieve high-volume harvesting.

Aparato para la recolección de tejido Microcolumns

This manuscript describes the production process for a laboratory apparatus, made from off-the-shelf components, that can be used to collect microcolumns ...

Meso-Scale Particle Image Velocimetry Studies of Neurovascular Flows In Vitro

Particle image velocimetry (PIV) is used in a wide variety of fields, due to the opportunity it provides for precisely visualizing and quantifying flows across a large spatiotemporal range. However, its implementation typically requires the use of expensive and specialized instrumentation, which limits its broader utility. Moreover, within the field of bioengineering, in vitro flow visualization studies are also often further limited by the high cost of commercially sourced tissue phantoms that recapitulate desired anatomical structures, particularly for those that span the mesoscale regime (i.e., submillimeter to millimeter length scales). Herein, we present a simplified experimental protocol developed to address these limitations, the key elements of which include 1) a relatively low-cost method for fabricating mesoscale tissue phantoms using 3-D printing and silicone casting, and 2) an open-source image analysis and processing framework that reduces the demand upon the instrumentation for measuring mesoscale flows (i.e., velocities up to tens of millimeters/second). Collectively, this lowers the barrier to entry for nonexperts, by leveraging resources already at the disposal of many bioengineering researchers. We demonstratethe applicability of this protocol within the context of neurovascular flow characterization; however, it is expected to be relevant to a broader range of mesoscale applications in bioengineering and beyond.

Meso-Scale Particle Image Velocimetry Studies of Neurovascular Flows In Vitro

Here we present simplified methods for fabricating transparent neurovascular phantoms and characterizing the flow therein. We highlight several important parameters and demonstrate their relationship to field accuracy.

Meso-escala partícula imagen Velocimetry estudios neurovasculares flujos In Vitro

Particle image velocimetry (PIV) is used in a wide variety of fields, due to the opportunity it provides for precisely visualizing and quantifying flows ...