En especial queremos agradecer a los miembros del laboratorio Gerber para obtener instrucciones técnicas para su montaje experimental y los comentarios sobre el manuscrito. También agradecemos a Lyubov Pankevych para el cuidado de la mosca y el mantenimiento del tipo salvaje acciones cantones. Este trabajo es apoyado por la DFG TH1584/1-1 subvención, la subvención SNF 31003A_132812 / 1 y el Zukunftskolleg de la Universidad de Konstanz (todos AST).

1. Preparación <ol><li> Drosophila salvaje larvas se crían a 25 ° C y 60% -80% de humedad en un ciclo de 14/10 luz / oscuridad. Para el control de la edad exacta de las larvas siempre se ponen 20 hembras y 10 machos en un vial (6 cm de altura y 2,5 cm de diámetro) que incluye aproximadamente 6 ml de alimento mosca estándar. Las moscas se les permite poner huevos durante 12 horas y se transfieren a un nuevo vial en el segundo día. 5-6 días después de la puesta de huevos larvas de llegar a la alimentación 3 ª etapa instar si se crían a 25 º C y se puede utilizar ahora para el experimento de comportamiento. Sin embargo, hay que asegurarse de tomar solamente las larvas que se encuentran todavía en la comida no y las larvas desde el lado del vial. Estas larvas ya han llegado a &quot;vagar 3 º estadio etapa&quot; - poco antes de la pupación - y su uso complica la interpretación de los resultados. </li><li> Preparación de agarosa 2,5% cajas de Petri (otros laboratorios utilizar también las concentraciones de agar de 1% durante todo el experimento, cómoconcentraciones cada vez más bajas pueden permitir la alimentación 3 º estadio las larvas de excavar en el sustrato): Disolver 2,5 g de agarosa en 100 ml ddH 2 O. Calentar la solución en un horno de microondas hasta que empiece a hervir. Con cuidado, agitar la solución y vuelva a colocarlo en el microondas hasta que todo agarosa se disuelva. Se vierte la solución caliente de agarosa en placas de Petri de tal manera que la parte inferior de las placas de Petri está completamente cubierta y la solución de agarosa forma una superficie lisa. Dejar que la solución se enfríe a temperatura ambiente y cerrar los párpados. No de inmediato cerrar los párpados, porque permitiría la condensación de agua en los párpados. </li><li> Preparación de 2M fructosa placas de Petri: Disolver 2,5 g de agarosa en 100 ml de ddH2O (de nuevo, el uso de la concentración de agar al 1% es posible, sin embargo, puede permitir la alimentación 3 ª estadio larvario para excavar en el sustrato). Calentar la solución en un horno de microondas hasta que empiece a hervir. Con cuidado, agitar la solución y vuelva a colocarlo en el microonda de agarosa hasta que todo se disuelve. Añadir cuidadosamente 35 g de fructosa en la solución caliente; lentamente agitar la mezcla hasta que el azúcar se disuelve para evitar retardo de ebullición. Verter la caliente fructosa-solución de agarosa en placas de Petri de tal manera que la parte inferior está completamente cubierta y la solución de fructosa-agarosa forma una superficie lisa. Dejar que la solución se enfríe a temperatura ambiente y cerrar los párpados. No de inmediato cerrar los párpados, porque permitiría la condensación de agua en los párpados. </li><li> Preparación de 1-octanol contenedores olor (OCT): Completa 10 l de octubre puro en un recipiente de teflón encargo olor y cerrarlo con una tapa que tiene varios pequeños orificios para permitir la evaporación del olor. Una descripción detallada de los recipientes se dan en Gerber y Stocker 2007. Prepare tres contenedores de olor para octubre Contenedores de olor permitir la evaporación de los productos químicos insertados, pero evitar que las larvas pueden directamente en contacto con ellos. Así, los experimentos aquí descritos específicamenteabordar el aprendizaje olfativo en las larvas sin perturbar efectos secundarios gustativas. </li><li> Preparación de los contenedores amilacetato olor (AM): Diluir 1:50 AM en el aceite de parafina. Completa 10 l de la dilución en un contenedor hecho a medida olor Teflon y cerrar con una tapa que tiene varios agujeros pequeños para permitir la evaporación del olor. Prepare tres contenedores de olor para AM. La dilución es importante por razones prácticas, es decir, para evitar una fuerte preferencia por un olor sobre la otra que podría ocultar un cambio dependiente de aprendizaje en la preferencia relativa entre los dos olores. La atracción igual para ambos olores pueden necesitar ser confirmado en el laboratorio antes del experimento mediante la aplicación de la prueba se describe más adelante (2.5) con los animales no tratados. Los valores que aquí se presenta se basa en varias publicaciones del laboratorio Gerber que fueron reproducidos recientemente por nuestro laboratorio 9,15,16. </li><li> El etiquetado de las placas de Petri: Antes de los experimentos de comportamiento todos los platos de Petri tienen que ser codificados. Esto significa quefructosa que contiene cápsulas de Petri tienen que ser marcados por ejemplo con una &quot;X&quot; o una &quot;A&quot; y agarosa sólo platos de Petri con una &quot;Y&quot; o &quot;B&quot;. Este código debe ser revelado al experimentador sólo después de que todos los datos han sido registrados. Mediante la realización de los experimentos de &quot;ciego&quot;, no es por lo tanto posible que las expectativas del experimentador puede afectar al rendimiento de las larvas. Para facilitar la comprensión por el público amplio en lo que sigue sólo a hablar de los olores como estímulos condicionados (CS1 o CS2) que son bien recompensados ​​cuando se presenta en un plato de Petri fructosa (+) o no premiados, cuando se presentan en un solo agarosa placa de Petri (-). </li></ol> 2. Sugar entrenamiento de la recompensa y Test <ol><li> Recoger alimentación 30 3 º estadio las larvas de un vial de alimentos. Transferirlos a una primera placa de Petri que contiene unas gotas de agua del grifo y cuidadosamente moverse hacia delante y hacia atrás con un cepillo. Transferirlos a una segunda placa de Petri que contiene también algunas gotas de grifo water para comprobar que no pasta comida en el bodywall de las larvas, de lo contrario las larvas sería capaz de experimentar el olor del alimento durante el experimento. Esto probablemente oscurecer el proceso de aprendizaje y su rendimiento en la situación de prueba. </li><li> Capacitación: Capacitar a las larvas a los olores asociados con una señal azúcar apetitivo el siguiente régimen se aplica. Ponga un recipiente olor octubre en la parte izquierda y derecha de una &quot;X&quot; marcada - por lo tanto, la recompensa que contiene fructosa (+) placa de Petri (&quot;ciego&quot; experimento, para más detalles ver 1.6). Dejar el grupo de 30 larvas de alimentación 3 º estadio en el medio de la placa de Petri, cerrar la tapa y esperar 5 min mientras los animales están expuestos a octubre Asegúrese de que las larvas no están atrapadas dentro de la gota de agua y puede superar la tensión superficial de la misma. Por que las larvas pueden moverse libremente en la placa de Petri y la experiencia de los estímulos olfativos y / o gustativa. </li><li> Formación: Retire las larvas de la placa de Petri con un cepillo humedecido y transferir lam sobre una segunda placa de Petri que está marcado con una &quot;Y&quot; - por lo tanto, sólo agarosa (-) que contenía placa de Petri - y tiene un contenedor de olor AM localizado en su lado izquierdo y derecho. Cerrar la tapa y esperar 5 min mientras los animales están expuestos a AM. </li><li> Formación: Repite 2,2) y 2,3) dos veces, de modo que los 30 larvas experimentan tres ciclos de formación: CS1 / (+) - CS2 / (-); CS1 / (+) - CS2 / (-); CS1 / (+) - CS2 / (-). En este experimento representa CS1 CS2 octubre y códigos para AM. </li><li> Prueba: Coloque una mañana y un contenedor olor octubre en las páginas opuestas de un plato de agarosa-sólo Petri. Transferir los animales entrenados para el medio de la placa de Petri de prueba. Cerrar la tapa y esperar 5 min. Posteriormente contar el número de larvas en el lado izquierdo, el lado central y derecha de la placa de Petri de prueba. </li><li> Repita los pasos 2.1) a 2,5) con un segundo grupo de 30 larvas alimentándose 3 º estadio, sino cambiar los roles experimentales de AM y octubre para que los animales reciban la formación siguientes: CS2/ (+) - CS1 / (-); CS2 / (+) - CS1 / (-); CS2 / (+) - CS1 / (-). En este experimento representa CS1 CS2 octubre y códigos para AM. </li><li> Posibles disposiciones para la formación. Por encima se presenta una formación existente de tres ensayos de formación de cualquiera de octubre / (+) - AM / (-) o en el grupo recíproco de además de tres ensayos de formación de AM / (+) - octubre / (-). Sin embargo, para evitar los efectos dependientes de la secuencia durante el entrenamiento es importante para variar la secuencia de los estímulos en repeticiones siguientes del experimento completo. Al variar el orden CS1 o CS2 y también la presentación recompensa en la placa de primera o segunda presentada, cuatro secuencias diferentes para los ensayos de entrenamiento son posibles: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Primer grupo </td><td> CS1 / (+) - CS2 / (-) </td><td> Recíproca grupo </td><td> CS2 / (+) - CS1 / (-) </td></tr><tr><td></td><td> CS1 / (-) - CS2 / (+) </td><td></td><td> CS2 / (-) - CS1 / (+) </td></tr><tr><td></td><td> CS2 / (+) - CS2 / (-) </td><td></td><td> CS1 / (+) - CS2 / (-) </td></tr><tr><td></td><td> CS2 / (-) - CS1 / (+) </td><td></td><td> CS1 / (-) - CS2 / (+) </td></tr></tbody></table> Para evitar efectos sistemáticos de estímulos en el ambiente circundante experimental, se debe realizar la prueba en un medio de los casos tales que octubre se presenta a la izquierda y a la derecha AM. En la otra mitad de los casos AM debe ser presentada a la izquierda y a la derecha octubre. 3. Las pruebas para tareas relevantes-sensorial-motoras Facultades El diseño de los experimentos descritos anteriormente permite analizar olor-azúcar en el aprendizaje de tipo salvaje alimentación 3 rd larvas instar por sí solo. Sin embargo, en la vida diaria investigadores de laboratorio suelen utilizar dos o más diferentes grupos experimentales de larvas para comparar, si el aprendizaje olfativo depende de un pargen particular, un conjunto específico de neuronas, una acción mutante, una dieta especial, diferentes condiciones de crianza, los productos químicos tóxicos añadidos durante el desarrollo, etc Por lo tanto, en todos los casos en que dos o más grupos experimentales de larvas se prueban uno tiene que hacer un conjunto de experimentos de control obligatorios para probar, si los diferentes grupos de larvas mostrar adecuados agudeza sensorial-motoras. Esto se convierte en obligatoria como posibles fenotipos no son necesariamente debido a la capacidad reducida o abolida a los olores asociados con el azúcar. Más bien, los posibles defectos de aprendizaje podría basarse en defectos en cualquier paso de la circuitería sensorial-motor en el tratamiento de los olores y / o azúcar. O en otras palabras, si una larva mutante no es capaz de azúcar sentido, no se puede establecer una memoria azúcar. Pero esto no permite concluir que la larva no puede aprender. En detalle los siguientes experimentos de control tienen que ser hechas para probar la correcta octubre, AM y el procesamiento de la fructosa de larvas transgénicas. 1. Prueba de ingenuo prefe octubrerencia Recoger alimentación 30 3 º estadio las larvas de un vial de alimentos. Lave cuidadosamente con agua del grifo, como se describe en 2.1. Poner un solo contenedor de octubre de olor en un lado de una placa de Petri de agarosa, añadir las larvas en el medio de la placa de Petri, cerrar la tapa y esperar 5 min, de tal manera que las larvas pueden arrastrarse en la placa de Petri y se orientan hacia la octubre olor fuente. Posteriormente contar el número de larvas en el lado izquierdo, en el centro y en el lado derecho de la placa de Petri de prueba. 2. Prueba de preferencia ingenuo AM Recoger alimentación 30 3 º estadio las larvas de un vial de alimentos. Lave cuidadosamente con agua del grifo, como se describe en 2.1. Poner un solo recipiente AM olor en un lado de un plato de Petri de agarosa, añadir las larvas en el medio de la placa de Petri, cerrar la tapa y esperar 5 min, de tal manera que las larvas pueden arrastrarse en la placa de Petri y se orientan hacia la AM olor fuente. Posteriormente contar el número de larvae en el lado izquierdo, en el centro y en el lado derecho de la placa de Petri de prueba. 3. Prueba de preferencia azúcar ingenuo Recoger alimentación 30 3 º estadio las larvas de un vial de alimentos. Lave cuidadosamente con agua del grifo, como se describe en 2.1. Preparar placas de Petri que contienen 2,5% de agarosa en un medio y un 2M fructosa-agarosa mezcla en la otra mitad. Añadir las larvas sobre la placa de Petri, cerrar la tapa y esperar 5 min, de tal manera que las larvas pueden arrastrarse en la placa de Petri y orientar hacia el lado que contiene fructosa. Posteriormente contar el número de larvas en el lado izquierdo, en el centro y en el lado derecho de la placa de Petri de prueba. Preparación de medio-medio platos Petri: Preparar normales placas de agarosa como se describe anteriormente en la sección 1,2. Cuando las placas de Petri llenas de agarosa se enfría, se corta cuidadosamente la agarosa a lo largo del eje vertical con un escalpelo. Retire la mitad de la agarosa de la placa de Petri. Ladd caliente una solución de fructosa-agarosa (para la preparación véase 1,3) a la mitad vacía de la placa de Petri. Tener cuidado de que las dos mitades de acuerdo y no forman un borde definido - esto afecta el comportamiento de elección larval y hace un análisis de comportamiento bastante difícil 4.. Sham formación A pesar de las pruebas de si la alimentación transgénica 3 ª instar larvas son capaces de distinguir a un nivel de tipo salvaje entre octubre y aire (3,1), AM y aire (3,2) y el azúcar y puro de agarosa (3,3), una serie adicional de experimentos de prueba ha sido recientemente introducido (para ver la discusión Gerber y Stocker, 2007). La justificación de estos experimentos es la siguiente. Durante la formación de las larvas se someten manipulación masiva y olor sucesiva y azúcar estimulación. Por lo tanto, es muy posible que el fenotipo observado aprendizaje es engañoso (aunque ingenuo olor y pruebas de azúcar en la percepción está en un nivel de tipo salvaje!). En efecto, es posible que los animales transgénicos differ de larvas de tipo salvaje con respecto a la resistencia al estrés, la motivación, la adaptación fatiga, sensorial, aprendizaje contextual, y cambios en la saciedad. Por lo tanto, Michels et al. (2005) introdujo controles que prueba si un mutante dado es capaz de (1) detectar AM frente a un contenedor vacío olor si usted trata a las larvas exactamente como durante el entrenamiento, excepto que se omite la recompensa y se limita a exponer a los dos los olores, (2) detectar octubre después de que el régimen mismo, (3) detectar AM frente a un contenedor vacío olor, si usted trata de las larvas de una manera similar a la formación, salvo que omite los olores y se limita a exponer a la recompensa, y (4 ) detectar octubre después de que el mismo régimen. Para una discusión completa y más detalles sobre los métodos consulte Michels et al (2005) y Gerber y Stocker (2007). 4. Análisis de los datos para el Aprendizaje Sugar Recompensa <ol><li> Para evaluar los datos del protocolo del azúcar aprendizaje recompensa calcular un índice de preferencia OCT (PREF OCT) para cada uno de los dos reciprocidadcamente los grupos formados: Para el primer grupo que recibió octubre / (+) - AM / (-) formación: PREF octubre (OCT + / AM-) = (número de larvas por parte de OCT - N º de larvas por parte de AM) / # de todas las larvas presentes en la zona izquierda, central y derecha Para el segundo grupo que recibió AM / (+) - OCT / (-) formación: PREF AM (AM + / OCT-) = (número de larvas en AM side - N º de larvas en el lado OCT) / # de todas las larvas presentes en la zona izquierda, central y derecha </li></ol><ol start="2"><li> Cálculo de un índice de rendimiento (PI) para los dos valores de PREF 4,1). El PI representa el aprendizaje asociativo por anulando los efectos perturbadores de olor y la exposición castigo, el paso del tiempo y la manipulación: PI = (PREF octubre (OCT + / AM) + PREF AM (AM + / PTU)) / 2 Así, inhibidores de la proteasa pueden variar desde -1 a 1. Valores significativamente negativos representan aprendizaje aversivo, mientras que los valores positivos significativamente describir el aprendizaje apetitivo. Un experimento completo suele constar de 10 o más inhibidores de la proteasa. Los datos se visualizan como caja de parcelas including todos los valores de un determinado grupo experimental. 50% de los valores que se encuentran dentro de la caja, el índice de rendimiento medio se indica como una línea gruesa en el gráfico de caja. </li></ol> 5. Análisis de los datos relevantes para la Task-sensorial-motoras Facultades <ol><li> Para evaluar los datos en las pruebas para el procesamiento apropiado olor octubre calcular un olor octubre índice de preferencia de la siguiente manera: Olor PREF octubre = (N º de larvas en el lado de octubre - N º de larvas en el otro lado) / # de todas las larvas dentro de las zonas izquierda, central y derecha </li><li> Para evaluar los datos cuando las pruebas de percepción adecuada olor AM calcular un olor AM índice de preferencia de la siguiente manera: Olor PREF AM = (# larvas de lado en AM - N º de larvas en el otro lado) / # de todas las larvas dentro de las zonas izquierda, central y derecha </li><li> Para evaluar los datos cuando las pruebas de percepción fructosa apropiado calcular un índice de preferencia de fructosa de la siguiente manera: PREF = fructosa (N º de larvas en el lado de la fructosa - N º de larvas en el otro lado) / # De todas las larvas dentro de las zonas izquierda, central y derecha </li><li> Detalles para el entrenamiento simulado se dan en Michels et al. 2005. </li></ol>

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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+Drosophila+embryonic+brain+development+using+photoactivated+gene+expression.">Dissecting Drosophila embryonic brain development using photoactivated gene expression.</a> Dev. Biol. 260, 124-137 (2003).</li><li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+functions+of+the+reaper+and+head+involution+defective+genes+in+the+programmed+cell+death+of+Drosophila+central+nervous+system+midline+cells.">Cooperative functions of the reaper and head involution defective genes in the programmed cell death of Drosophila central nervous system midline cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 5131-5136 (1997).</li><li>Kitamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+modification+of+behavior+in+Drosophila+by+targeted+expression+of+a+temperature-sensitive+shibire+allele+in+defined+neurons.">Conditional modification of behavior in Drosophila by targeted expression of a temperature-sensitive shibire allele in defined neurons.</a> J. Neurobiol. 47, 81-92 (2001).</li><li>Schroll, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+activation+of+distinct+modulatory+neurons+triggers+appetitive+or+aversive+learning+in+Drosophila+larvae.">Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae.</a> Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).</li><li>Rosenzweig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+ortholog+of+vertebrate+TRPA1+regulates+thermotaxis.">The Drosophila ortholog of vertebrate TRPA1 regulates thermotaxis.</a> Genes Dev. 19, 419-424 (2005).</li><li>Baines, R. A., Uhler, J. P., Thompson, A., Sweeney, S. T., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+electrical+properties+in+Drosophila+neurons+developing+without+synaptic+transmission.">Altered electrical properties in Drosophila neurons developing without synaptic transmission.</a> J. Neurosci. 21, 1523-1531 (2001).</li><li>Chen, Y. C., Mishra, D., Schmitt, L., Schmuker, M., Gerber, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+behavioral+odor+similarity+"space"+in+larval+Drosophila.">A behavioral odor similarity "space" in larval Drosophila.</a> Chem. Senses. 36, 237-249 (2011).</li><li>Saumweber, T., Husse, J., Gerber, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+attractiveness+and+associative+learnability+of+odors+can+be+dissociated+in+larval+Drosophila.">Innate attractiveness and associative learnability of odors can be dissociated in larval Drosophila.</a> Chem. Senses. 36, 223-235 (2011).</li><li>von Essen, A. M., Pauls, D., Thum, A. S., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacity+of+visual+classical+conditioning+in+Drosophila+larvae.">Capacity of visual classical conditioning in Drosophila larvae.</a> Behav. Neurosci. , (2011).</li><li>Honjo, K., Furukubo-Tokunaga, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cAMP+response+element-binding+protein-dependent+medium-term+memory+by+appetitive+gustatory+reinforcement+in+Drosophila+larvae.">Induction of cAMP response element-binding protein-dependent medium-term memory by appetitive gustatory reinforcement in Drosophila larvae.</a> J. Neurosci. 25, 7905-7913 (2005).</li><li>Honjo, K., Furukubo-Tokunaga, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctive+neuronal+networks+and+biochemical+pathways+for+appetitive+and+aversive+memory+in+Drosophila+larvae.">Distinctive neuronal networks and biochemical pathways for appetitive and aversive memory in Drosophila larvae.</a> J. Neurosci. 29, 852-862 (2009).</li><li>Khurana, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+Conditioning+in+the+Third+Instar+Larvae+of+Drosophila+melanogaster+Using+Heat+Shock+Reinforcement.">Olfactory Conditioning in the Third Instar Larvae of Drosophila melanogaster Using Heat Shock Reinforcement.</a> Behav. Genet. 42, 151-161 (2012).</li><li>Tully, T., Cambiazo, V., Kruse, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+through+metamorphosis+in+normal+and+mutant.">Memory through metamorphosis in normal and mutant.</a> 14, 68-74 (1994).</li><li>Michels, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+site+and+molecular+mode+of+synapsin+action+in+associative+learning.">Cellular site and molecular mode of synapsin action in associative learning.</a> Learn Mem. 18, 332-344 (2011).</li><li>Saumweber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+and+synaptic+plasticity+are+impaired+upon+lack+of+the+synaptic+protein+SAP47.">Behavioral and synaptic plasticity are impaired upon lack of the synaptic protein SAP47.</a> J. Neurosci. 31, 3508-3518 (2011).</li><li>Pfeiffer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refinement+of+tools+for+targeted+gene+expression+in+Drosophila.">Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila.</a> Genetics. 186, 735-755 (2010).</li><li>Rosenzweig, M., Kang, K., Garrity, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+TRP+channels+are+required+for+warm+and+cool+avoidance+in+Drosophila+melanogaster.">Distinct TRP channels are required for warm and cool avoidance in Drosophila melanogaster.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 14668-14673 (2008).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

<html> La configuración descrita en larvas de Drosophila permite la investigación de aprendizaje olfativo asociativo dentro de un cerebro comparativamente elemental. El enfoque es simple, barato, fácil de establecer en un laboratorio y no requiere de equipos de alta tecnología 9. Se presenta una versión del experimento para estudiar el aprendizaje apetitivo asociativo reforzada por recompensa fructosa 11. La configuración descrita se basa en una serie de estudios paramétricos que exh...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Número del CAS </td></tr><tr><td> Fructosa </td><td> Sigma </td><td> 47740 </td><td> 57-48-7 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fluka </td><td> 71350 </td><td> 7647-14-5 </td></tr><tr><td> Agarosa </td><td> Sigma </td><td> A5093 </td><td> 9012-36-6 </td></tr><tr><td> 1-octanol </td><td> Sigma </td><td> 12012 </td><td> 111-87-5 </td></tr><tr><td> Amilacetato </td><td> Sigma </td><td> 46022 </td><td> 628-63-7 </td></tr><tr><td> Queroseno </td><td> Sigma </td><td> 18512 </td><td> 8012-95-1 </td></tr></tbody></table>

appetitive associative olfactory learning in drosophila larvae

A continuación se describen los detalles metodológicos de aprendizaje asociativo apetitiva olfativa de larvas de Drosophila. La configuración, en combinación con la interferencia genética, proporciona un identificador para analizar los fundamentos neuronales y moleculares de aprendizaje asociativo específicamente en un cerebro de larvas simple. Los organismos pueden utilizar la experiencia pasada para ajustar el comportamiento presente. Tal adquisición de potencial de comportamiento puede ser definido como el aprendizaje, y las bases físicas de estos potenciales como trazas de memoria 1-4. Los neurocientíficos tratar de entender cómo estos procesos están organizados en función de los cambios moleculares y neuronales en el cerebro mediante el uso de una variedad de métodos en organismos modelos que van desde los insectos a vertebrados 5,6. Para tales esfuerzos, es útil utilizar modelos de sistemas que son simples y accesibles experimentalmente. La larva de Drosophila se ha convertido en satisfacer estas demandas sobre la base dela disponibilidad de potentes ensayos de comportamiento, la existencia de una variedad de técnicas transgénicas y la organización básica del sistema nervioso que comprende sólo unas 10.000 neuronas (aunque con algunas concesiones: las limitaciones cognitivas, pocas opciones de comportamiento, y la riqueza de la experiencia cuestionable) 7-10 . Larvas de Drosophila pueden formar asociaciones entre los olores y el refuerzo del apetito gustativo como el azúcar 11-14. En un ensayo estándar, establecido en el laboratorio de B. Gerber, los animales reciben una de dos olor formación recíproca: Un primer grupo de larvas está expuesto a un olor A, junto con un reforzador gustativa (recompensa azúcar) y es posteriormente expuesto a un olor B sin refuerzo 9. Mientras tanto, un segundo grupo de larvas recibe formación recíproca, mientras que experimentan olor A sin refuerzo y posteriormente expuestos a B con olor refuerzo (recompensa azúcar). En la siguiente ambos grupos son TESdo por su preferencia entre los dos olores. Preferencias relativamente altos para el olor recompensado reflejar el aprendizaje asociativo - presentado como un índice de rendimiento (PI). La conclusión sobre la naturaleza asociativa del índice de rendimiento es convincente, ya que además de la contingencia entre los olores y los estimulantes del gusto, otros parámetros, como el olor y la exposición recompensa, el paso del tiempo y la manipulación no difieren entre los dos grupos de 9.

La figura 1A muestra una visión general de los procedimientos experimentales para las larvas aprendizaje asociativo olfativo. Por el emparejamiento de una de las dos olores presentados con una recompensa larvas azúcar adquirir el comportamiento potencial de expresar una respuesta atractiva hacia el olor recompensado en comparación con el olor sin recompensa. Dos grupos de larvas están siempre formados por cualquiera de emparejamiento el reforzador con el olor octubre o AM. El índice de rendimiento ...

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Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Larvas de Drosophila son capaces de asociarse con estímulos de olor recompensa gustativa. Aquí se describe un sencillo paradigma de comportamiento que permite el análisis de apetito aprendizaje olfativo asociativo.

Apetitivo aprendizaje asociativo olfativa en<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

appetitive-associative-olfactory-learning-in-drosophila-larvae

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

18.8K vistas.  University of Konstanz. Larvas de Drosophila son capaces de asociarse con estímulos de olor recompensa gustativa. Aquí se describe un sencillo paradigma de comportamiento que permite el análisis de apetito aprendizaje olfativo asociativo.

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C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment through neuron-specific detection of food and chemical odors1, 2, and can associate nutritive states with chemical odors3, temperature4, and the pathogenicity of a food source5.
Here, we describe assays of C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. We modified an aversive olfactory learning paradigm6 to instead produce a positive response; the assay involves starving ~400 worms, then feeding the worms in the presence of the AWC neuron-sensed volatile chemoattractant butanone at a concentration that elicits a low chemotactic index (similar to Toroyama et al.7). A standard population chemotaxis assay1 tests the worms' attraction to the odorant immediately or minutes to hours after conditioning.
After conditioning, wild-type animals' chemotaxis to butanone increases ~0.6 Chemotaxis Index units, its "Learning Index". Associative learning is dependent on the presence of both food and butanone during training. Pairing food and butanone for a single conditioning period ("massed training") produces short-term associative memory that lasts ~2 hours. Multiple conditioning periods with rest periods between ("spaced training") yields long-term associative memory (&lt;40 hours), and is dependent on the cAMP Response Element Binding protein (CREB),6 a transcription factor required for long-term memory across species.8
Our protocol also includes image analysis methods for quick and accurate determination of chemotaxis indices. High-contrast images of animals on chemotaxis assay plates are captured and analyzed by worm counting software in MatLab. The software corrects for uneven background using a morphological tophat transformation.9 Otsu's method is then used to determine a threshold to separate worms from the background.10 Very small particles are removed automatically and larger non-worm regions (plate edges or agar punches) are removed by manual selection. The software then estimates the size of single worm by ignoring regions that are above a specified maximum size and taking the median size of the remaining regions. The number of worms is then estimated by dividing the total area identified as occupied by worms by the estimated size of a single worm.
We have found that learning and short- and long-term memory can be distinguished, and that these processes share similar key molecules with higher organisms.6,8 Our assays can quickly test novel candidate genes or molecules that affect learning and short- or long-term memory in C. elegans that are relevant across species.

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

Here we describe methods to test C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. These population assays employ the worms abilities to chemotax toward volatile odorants, and form positive associations upon pairing food with the chemoattractant butanone. Increasing the number of conditioning periods induces long-term memory.

C. elegans de aprendizaje positivo butanona, a corto plazo y largo plazo Ensayos de la memoria asociativa

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment ...

Investigación

Neurociencias

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of these diseases, including Alzheimer's, Parkinson's and Huntington's disease are characterized by age-dependent deterioration in learning and memory functions and movement coordination2. Here we use behavioral assays, including the negative geotaxis assay3 and the aversive phototaxic suppression assay (APS assay)4,5, to show that some of the behavior characteristics associated with human neurodegeneration can be recapitulated in flies. In the negative geotaxis assay, the natural tendency of flies to move against gravity when agitated is utilized to study genes or conditions that may hinder locomotor capacities. In the APS assay, the learning and memory functions are tested in positively-phototactic flies trained to associate light with aversive bitter taste and hence avoid this otherwise natural tendency to move toward light. Testing these trained flies 6 hours post-training is used to assess memory functions. Using these assays, the contribution of any genetic or environmental factors toward developing neurodegeneration can be easily studied in flies.

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Behavior assays for measuring locomotor functions, learning, and memory abilities in Drosophila.

Locomotor ensayo, aprendizaje, memoria y déficit en Drosophila Los modelos de neurodegeneración

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualización de los propioceptores<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas y pupas

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the elucidation of the molecular mechanisms involved in cognitive diseases1-7. Learning and memory can be assayed in larvae to study the effect of neurodevelopmental genes8-10 and in flies to measure the contribution of adult plasticity genes1-7. Furthermore, the short lifespan of Drosophila facilitates the analysis of genes mediating age-related memory impairment5,11-13. The availability of many inducible promoters that subdivide the Drosophila nervous system makes it possible to determine when and where a gene of interest is required for normal memory as well as relay of different aspects of the reinforcement signal3,4,14,16.
Studying memory in adult Drosophila allows for a detailed analysis of the behavior and circuitry involved and a measurement of long-term memory15-17. The length of the adult stage accommodates longer-term genetic, behavioral, dietary and pharmacological manipulations of memory, in addition to determining the effect of aging and neurodegenerative disease on memory3-6,11-13,15-21.
Classical conditioning is induced by the simultaneous presentation of a neutral odor cue (conditioned stimulus, CS+) and a reinforcement stimulus, e.g., an electric shock or sucrose, (unconditioned stimulus, US), that become associated with one another by the animal1,16. A second conditioned stimulus (CS-) is subsequently presented without the US. During the testing phase, Drosophila are simultaneously presented with CS+ and CS- odors. After the Drosophila are provided time to choose between the odors, the distribution of the animals is recorded. This procedure allows associative aversive or appetitive conditioning to be reliably measured without a bias introduced by the innate preference for either of the conditioned stimuli. Various control experiments are also performed to test whether all genotypes respond normally to odor and reinforcement alone.

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

The method to measure adult Drosophila associative memory is described. The assay is based on the ability of the fly to associate an odor presented with a negative reinforcer (electric shock) and then recall this information at a later time, allowing memory to be measured.

Drosophila Adulto olfativa Choque Aprendizaje

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Todo el montaje de Immunolabeling olfativa del receptor de las neuronas en el<em&gt; Drosophila</em&gt; Antena

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral variation. The larval path-length assay was developed to measure individual differences in foraging behavior that were later linked to the foraging gene. Larval path-length is an easily scored trait that facilitates the collection of large sample sizes, at minimal cost, for genetic screens. Here we provide a detailed description of the current protocol for the larval path-length assay first used by Sokolowski. The protocol details how to reproducibly handle test animals, perform the behavioral assay and analyze the data. An example of how the assay can be used to measure behavioral plasticity in response to environmental change, by manipulating feeding environment prior to performing the assay, is also provided. Finally, appropriate test design as well as environmental factors that can modify larval path-length such as food quality, developmental age and day effects are discussed.

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

We provide a detailed protocol for a Drosophila melanogaster foraging path-length assay. We discuss the preparation and handling of test animals, how to perform the assay and analyze the data.

Forrajeo Protocolo Ruta de longitud de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Las larvas

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Método electrofisiológico para registrar las respuestas de voltaje intracelular<em&gt; Drosophila</em&gt; Los fotorreceptores y interneuronas a la luz Estímulos<em&gt; En Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory machinery, such as in patients experiencing peripheral neuropathy or injury-induced sensitization, are not well characterized. The genetically tractable Drosophila model has been used to study the cells and genes required for noxious heat detection, which has yielded multiple conserved genes of interest. Little is known however about the cells and receptors important for noxious cold sensing. Although, Drosophila does not survive prolonged exposure to cold temperatures (&#8804;10 &#186;C), and will avoid cool, preferring warmer temperatures in behavioral preference assays, how they sense and possibly avoid noxious cold stimuli has only recently been investigated.
Here we describe and characterize the first noxious cold (&#8804;10 &#186;C) behavioral assay in Drosophila. Using this tool and assay, we show an investigator how to qualitatively and quantitatively assess cold nociceptive behaviors. This can be done under normal/healthy culture conditions, or presumably in the context of disease, injury or sensitization. Further, this assay can be applied to larvae selected for desired genotypes, which might impact thermosensation, pain, or nociceptive sensitization. Given that pain is a highly conserved process, using this assay to further study&#160;thermal nociception will likely glean important understanding of pain processes in other species, including vertebrates.

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Here we demonstrate a novel assay to study cold nociception in Drosophila larvae. This assay utilizes a custom-built Peltier probe capable of applying a focal noxious cold stimulus and results in quantifiable cold-specific behaviors. This technique will allow further cellular and molecular dissection of cold nociception.

Ensayo novedoso para la nocicepción en frío<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

An Objective and Reproducible Test of Olfactory Learning and Discrimination in Mice

Olfaction is the predominant sensory modality in mice and influences many important behaviors, including foraging, predator detection, mating, and parenting. Importantly, mice can be trained to associate novel odors with specific behavioral responses to provide insight into olfactory circuit function. This protocol details the procedure for training mice on a Go/No-Go operant learning task. In this approach, mice are trained on hundreds of automated trials daily for 2&#8211;4 weeks and can then be tested on novel Go/No-Go odor pairs to assess olfactory discrimination, or be used for studies on how odor learning alters the structure or function of the olfactory circuit. Additionally, the mouse olfactory bulb (OB) features ongoing integration of adult-born neurons. Interestingly, olfactory learning increases both the survival and synaptic connections of these adult-born neurons. Therefore, this protocol can be combined with other biochemical, electrophysiological, and imaging techniques to study learning and activity-dependent factors that mediate neuronal survival and plasticity.

Here, we train mice on an associative learning task to test odor discrimination. This protocol also allows for studies on learning-induced structural changes in the brain.

Una prueba objetiva y Reproducible de aprendizaje olfativo y discriminación en ratones

Olfaction is the predominant sensory modality in mice and influences many important behaviors, including foraging, predator detection, mating, and ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a considerable amount of information has been generated regarding ORN responses to odorants, the role of specific ORNs in driving behavioral responses remains poorly understood. Complications in behavior analyses arise due to different volatilities of odorants that activate individual ORNs, multiple ORNs activated by single odorants, and the difficulty in replicating naturally observed temporal variations in olfactory stimuli using conventional odor-delivery methods in the laboratory. Here, we describe a protocol that analyzes Drosophila larval behavior in response to simultaneous optogenetic stimulation of its ORNs. The optogenetic technology used here allows for specificity of ORN activation and precise control of temporal patterns of ORN activation. Corresponding larval movement is tracked, digitally recorded, and analyzed using custom written software. By replacing odor stimuli with light stimuli, this method allows for a more precise control of individual ORN activation in order to study its impact on larval behavior. Our method could be further extended to study the impact of second-order projection neurons (PNs) as well as local neurons (LNs) on larval behavior. This method will thus enable a comprehensive dissection of olfactory circuit function and complement studies on how olfactory neuron activities translate in to behavior responses.

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

This protocol analyzes navigational behavior of Drosophila larva in response to simultaneous optogenetic stimulation of its olfactory neurons. Light of 630 nm wavelength is used to activate individual olfactory neurons expressing a red-shifted channel rhodopsin. Larval movement is simultaneously tracked, digitally recorded, and analyzed using custom-written software.

Methods Article

Apetitivo aprendizaje asociativo olfativa en