1. La preparación de agregados para la medición de la tensión de los tejidos de la superficie. Para células adherentes, esferoides se pueden formar utilizando el método de colgar gota o mediante la generación de una hoja coherente de las células que luego se puede cortar en fragmentos de 1 mm. La formación de agregados por el método de gota: <ol><li> Casi confluente culturas de células adherentes deben ser cultivadas a 90% de confluencia, las monocapas con lo cual se deben enjuagar dos veces con PBS. Después de drenar bien, añadir 2 ml (para placas de 100 mm) de la tripsina-1 0.05% mM EDTA y se incuba a 37 ° C hasta que las células separar. Dejar de tripsinización mediante la adición de 2 ml de medio completo y con cuidado el uso de una pipeta de 5 ml para triturar la mezcla hasta que las células están en suspensión. La transferencia de células a un tubo cónico de 15 ml. </li><li> Añadir 40 ml de un 10 mg / ml de solución de DNAsa e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente. Vortex brevemente y centrifugar a 200 xg durante 5 minutos. </li><li> Desechar el sobrenadante y lavar pellet con 1 ml de medio completo de cultivo de tejidos. Repito, pues suspender las células en 2 ml de medio completo de cultivo de tejidos. </li><li> Contar las células con un hemocitómetro, o contador celular automático y ajustar la concentración de 2,5 x 10 6 células / ml. </li><li> Quite la tapa de un plato de cultivo de tejidos de 60 mm y colocar 5 ml de PBS en el fondo del plato. Esto actúa como una cámara de hidratación. </li><li> Invertir la tapa y el uso de una pipeta de 20 l de depósito l 10 gotas en la parte inferior de la tapa. Asegúrese de que las gotas se colocan lo suficientemente separados para que no toque. Es posible colocar al menos 20 gotas por plato. </li><li> Invertir la tapa sobre el PBS cámara llena de fondo y se incuba a 37 ° C / 5% CO 2 / 95% de humedad, controlar las gotas todos los días y se incuban hasta que las hojas de células o grupos, se han formado. </li><li> Una vez que forman las hojas, que pueden ser transferidos a fondo redondo coctelera frascos que contienen 3 ml de medio completo y se incubaron en un baño de agua agitando a 37 º C y 5% de CO 2 hasta que se formen esferoides. </li></ol> La formación de agregados por el método de capa celular: <ol start="9"><li> Suspensiones de células individuales se preparan como se describe más arriba, pero la concentración se ajusta a 1x10 6 células / ml. </li><li> La transferencia de 3 ml de la suspensión celular a 10 ml matraces de fondo redondo (Belco, Vineland, NJ). </li><li> Incubar los frascos en un baño de agua giratorio / agitador (New Brunswick Scientific, Edison, NJ) a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 4 horas a 120 rpm hasta que las células a recuperarse de tripsina. </li><li> La transferencia de células a un tubo de vidrio de centrífuga de fondo redondo y se centrifuga a 200 g X en una fina pastilla. Incubar por otras 24 horas hasta que se forme la hoja coherente. </li><li> Agite suavemente el tubo de cultivo para sacar la hoja y vierta el contenido del tubo de la cultura en un plato pequeño, la cultura de vidrio estériles para tejidos. </li><li> Use bisturíes micro para cortar las hojas en fragmentos de diferentes tamaños. </li><li> Incubar fragmentos a 37 ° C en el agitador giratorio al baño maría a 120 rpm menos del 5% de CO 2 por 2 ó 3 días o hasta que se convierten esférica. </li></ol> 2. Medición de la tensión de la superficie total <ol><li> El tensiómetro de superficie del tejido. El aparato se muestra en las figuras. 1 y 2. La celda de compresión (Fig. 3) se compone de dos cámaras. La cámara exterior (CO) está conectado a una bomba de agua de 37 ° C en circulación, y sirve para regular la temperatura de la cámara interna (IC). Las cámaras están construidas con Delrin molido y contener ventanas de cuarzo para la visualización de los áridos. El menor de montaje (LA) tornillos en la base de la cámara interior y se utiliza para: 1) la posición del conjunto en la cámara interior, 2) el sello de la parte inferior de la cámara interior, 3) elevar la suma para iniciar la compresión, y (4 ) el control de la distancia entre las placas paralelas y por lo tanto, la compresión de los agregados. El núcleo central (CC) de la asamblea es ajustable. La punta del núcleo central (el pedestal) se compone de suaves de teflón y actúa como la placa de compresión más baja (LCP). La placa de compresión superior (UCP) es un cilindro de teflón de 15 mm de largo que cuelga del brazo de equilibrio (B) por una llama-se enderezó de alambre de níquel-cromo (NCW) *. Durante el curso de un experimento, el agregado de células (A) se coloca en la placa inferior y se crió hasta que haga contacto con la placa superior. La placa superior está conectado al brazo de equilibrio (B). La compresión de los agregados provocan un desplazamiento del brazo de equilibrio. El equilibrio es un Cahn / Ventron modelo 2000 electrobalanza grabación, que opera en el principio de equilibrio nulo. El punto de apoyo del brazo de la balanza tiene una armadura dentro de un campo magnético permanente. Cuando el equilibrio está en marcha, continuamente modula la corriente que pasa a través de la asamblea electromagnéticas, que a su vez mantiene el brazo de la balanza en posición horizontal. Cuando un objeto está suspendido del brazo de la balanza, la tensión, que el equilibrio se aplica para mantener el brazo en el horizoposición ntal, es proporcional al peso del objeto. Esta tensión se mide la fuerza externa aplicada a la compresión del agregado. La forma del conjunto es monitoreado por la observación visual a través de un estereoscopio de 25 x Nikon SMZ10A acoplado a un ordenador equipado con una tarjeta capturadora. A fin de minimizar la adherencia de los agregados de células a las placas de compresión, tanto en las placas de compresión inferior y superior fueron recubiertas con poli (2-hidroxietilo) {poli (HEMA)}, un material polimérico para que las células no se adhieren 16. * El cable se llama-se enderezó en la horca, una longitud de 15 pulgadas de alambre de un soporte vertical y un clip de sujeción cuaderno pequeño hasta el final. Un mechero de Bunsen es entonces correr arriba y abajo de la longitud del cable hasta que el cable se ilumina en rojo. El alambre enderezado puede ser cortada en la longitud apropiada. Un pequeño gancho se forma doblando el alambre alrededor de ¼ de pulgada de la final con dos hojas de afeitar. El otro extremo se inserta en el cilindro de la placa de compresión más baja. </li><li> La compresión global. <ol><li> La cámara interior está llena de pre-calentado CO 2-independiente medio de cultivo de tejidos (Gibco / BRL, NY). </li><li> Los agregados varían en tamaño de alrededor de 200-300 μ se colocan en la placa de compresión más baja (Fig. 4A). Los agregados son cargados por aspiración de un agregado en el medio de cultivo de tejidos a mitad de camino hasta la punta de una pipeta Pasteur provista de una bombilla de silicona, la transferencia de la pipeta a la cámara interior, y el posicionamiento de la punta de la pipeta por encima de la LCP. El agregado entonces expulsarlo lentamente en el LCP apretando suavemente el bulbo. Por otra parte, el conjunto se deja caer por gravedad en la LCP. </li><li> La placa de compresión superior (UCP) se coloca por encima de la suma y se deja reposar, el establecimiento de un pre-compresión de referencia aparente peso UCP. </li><li> El LCP se eleva entonces hasta que la suma se comprime contra la UCP (Fig. 4B). Ajuste de la altura del núcleo interno del aparato de control inferiores a los diferentes grados de compresión. La compresión se controla mediante la observación a través de un microscopio de disección equipado con una cámara de vídeo CCD. </li><li> Imágenes agregadas son capturados, digitalizados y analizados mediante el ImageJ. Cambio aparente de peso UCP se registra continuamente en un registrador de banda, el logro del equilibrio forma se designa con el estancamiento de la tensión de salida de la balanza Cahn. Cada conjunto se somete a dos diferentes grados de compresión. </li></ol></li><li> Cálculo de la tensión de la superficie total. En equilibrio, la forma, la cohesividad de un agregado de células comprimido entre dos placas paralelas a las que no se adhiere se puede obtener de la ecuación de Young-Laplace (Fig. 5), donde σ es cohesividad, F es la fuerza que actúa para comprimir el agregado , πr 3 2 es el área de la superficie de los áridos en la que se ejerce la fuerza F, y R2 y R3 son, respectivamente, el radio del ecuador de la suma comprimido y el radio de un arco de la definición de su perfil normal de la superficie a la compresión de las placas y se extiende entre ellos (Fig. 6). La medición de la fuerza de compresión y de la geometría en la fuerza y ​​el equilibrio y la forma de aplicar estas medidas a la ecuación de Young-Laplace genera valores numéricos de tensión aparente superficie del tejido. Al alcanzar el equilibrio y el cálculo de σ 1, los agregados se descomprimen y se les permite acercarse a un equilibrio de segundo y σ 2 se calcula como se describe anteriormente. </li><li> La confirmación de la liquidez global. La tensión de la superficie calculada de un total de líquido, cuando se somete a dos compresiones diferentes se mantendrá constante. En tales agregados la relación entre σ 2 / σ 1 será igual a 1 y será menor que la proporción de la fuerza aplicada en cada compresión sucesivas (F 2 / F 1). Por el contrario, la tensión superficial de un agregado calculado elástica obedece la ley de Hooke y aumentan de forma proporcional a la fuerza aplicada. Para los agregados de la relación de elasticidad de σ 2 / σ 1 no será igual a 1, sino que se acercará a la relación de F 2 / F 1. La tensión superficial de los agregados de líquido también será independiente del tamaño total de 2,17. Mediciones único en el que la tensión superficial es independiente de la fuerza aplicada y el tamaño se utilizan para calcular σ promedio para cada línea celular. </li></ol> 3. Los resultados representativos: A continuación se muestra una tabla de resultados TST típica de los agregados de los fibroblastos de próstata de la rata (FPR) y la rata células del músculo liso de próstata (RPSMC). Como se puede observar en la figura. 7 agregados de células del FPR tienen una tensión superficial de 22,8 ± 1,1 dinas / cm. Por otra parte, los valores promedio de la superficie la tensión medida después de la compresión y un después de la compresión 2 fueron estadísticamente identiCal, en comparación con una prueba t pareada. También se compararon las proporciones de σ 2 / σ 1 y F 2 / F 1 para garantizar que estos agregados no obedecer la ley de Hooke, como lo harían si se comportaban como sólidos elásticos. Como se demuestra en la Tabla 1, la relación entre σ 2 / σ 1 no llegáis a 1,0. Por otra parte, la proporción de F 2 / F 1 fue significativamente mayor que σ 2 / σ 1 (prueba t pareada, p &lt;0,05), que confirma que estos agregados no obedecen la ley de Hooke y, de hecho, se comportan como líquidos. En contraste RPSMCs obedecido la ley de Hooke. Como es evidente en la Tabla 1, la proporción de σ 2 / σ 1 es significativamente mayor que 1 y no fue estadísticamente diferente a la de F 2 / F 1. Para demostrar aún más líquidos-como el comportamiento, se exploró la relación entre la tensión superficial (σ) y al volumen total. Como se puede observar en la figura. 8, el volumen es independiente de la sigma para las células del FPR (línea de regresión de color rojo, r 2 = 0,002), mientras que parece que hay cierta dependencia de la sigma en el volumen de RPSMCs (línea de regresión azul, r 2 = 0,146). Estos datos confirman que los agregados del FPR se comportan de una manera semi-líquido, mientras que las de RPSMCs parecen comportarse más como sólidos elásticos. Sólo aquellos mesurements obtenidos a partir de los agregados se comportan como líquidos se utilizan para calcular la tensión superficial. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Descripción del tensiómetro superficie del tejido. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Una visión más detallada de la cámara de tensiómetro (panel derecho). <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Representación esquemática de la cámara del tensiómetro. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Imágenes de vídeo de alta (A) y se comprime (B) agregados. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig5.jpg" alt="Figura 5"/> Figura 5. La ecuación de Laplace. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig6.jpg" alt="Figura 6"/> Figura 6. Esquema de una gota de líquido comprimido entre dos placas paralelas a las que se adhiere mal, en el equilibrio de forma. R 1 y R 2 son los dos radios de curvatura primaria, en el ecuador de la gota y en un plano a través de su eje de simetría, respectivamente. R3 es el radio del área circular de la gota de contacto con placa de compresión sea. H es la distancia entre las placas de compresión superior e inferior. X es uno de los lados de un triángulo rectángulo con hipotenusa R 2 se extiende hasta un punto de contacto entre la superficie de la gota y, o bien la placa de compresión. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> σ 1 (dinas / cm ± SEM) </td><td> σ 2 (dinas / cm ± SEM) </td><td> Pσ 1 vs 2 σ </td><td> σ 1,2 (dinas / cm ± SEM) </td><td> σ 2 / σ 1 </td><td> F 2 / F 1 </td><td> Pσ 2 / σ 1 y F 2 F 1 </td></tr><tr><td> RPF </td><td> 22,6 ± 1,7 </td><td> 22,9 ± 1,4 </td><td> &gt; 0,05 * </td><td> 22,8 ± 1,1 </td><td> 1,04 ± 0,04 </td><td> 1,47 ± 0,06 </td><td> &lt;0,05 </td></tr><tr><td> RPSMC </td><td> 15,0 ± 2,8 </td><td> 23,0 ± 3,2 </td><td> 0.039 </td><td> NA </td><td> 1,9 ± 0,3 </td><td> 1,6 ± 0,1 </td><td> 0,16 * </td></tr></tbody></table> Figura 7. TST mediciones y la confirmación de liquidez agregada para los agregados de los fibroblastos de próstata de la rata y células musculares lisas. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig8.jpg" alt="Figura 8"/> Figura 8. Relación entre el sigma y el volumen de los agregados del FPR (línea roja) y RPSMCs (línea azul).

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	<li>Foty, R. A., Forgacs, G., Pfleger, C. M., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+properties+of+embryonic+tissues:+Measurement+of+interfacial+tensions.">Liquid properties of embryonic tissues: Measurement of interfacial tensions.</a> Phys Rev Lett. 72, 2298-2301 (1994).</li><li>Foty, R. A., Pfleger, C. M., Forgacs, G., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+tensions+of+embryonic+tissues+predict+their+mutual+envelopment+behavior.">Surface tensions of embryonic tissues predict their mutual envelopment behavior.</a> Development. 122, 1611-1620 (1996).</li><li>Schotz, E. -. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexamethasone+up-regulates+cadherin+expression+and+cohesion+of+HT-1080+human+fibrosarcoma+cells.">Dexamethasone up-regulates cadherin expression and cohesion of HT-1080 human fibrosarcoma cells.</a> Cancer Res. 58, 3586-3589 (1998).</li><li>Winters, B. S., Shepard, S. R., Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+measurement+of+brain+tumor+cohesion.">Biophysical measurement of brain tumor cohesion.</a> Int J Cancer. 114, 371-379 (2005).</li><li>Foty, R. A., Cummings, K. B., Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+surface+tensiometry:+a+novel+technique+for+predicting+invasive+potential+of+prostate+tumors+based+on+tumor+cell+aggregate+cohesivity+in+vitro.">Tissue surface tensiometry: a novel technique for predicting invasive potential of prostate tumors based on tumor cell aggregate cohesivity in vitro.</a> Surgical Forum L. , 707-708 (1999).</li><li>Folkman, J., Moscona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cell+shape+in+growth+control.">Role of cell shape in growth control.</a> Nature. 273, 345-349 (1978).</li><li>Foty, R. A., Forgacs, G., Pfleger, C. M., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+properties+of+embryonic+tissues:+Measurement+of+interfacial+tensions.">Liquid properties of embryonic tissues: Measurement of interfacial tensions.</a> Physical Review Letters. 72, 2298-2301 (1994).</li><li>Guevorkian, K., Colbert, M. J., Durth, M., Dufour, S., Brochard-Wyart, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspiration+of+biological+viscoelastic+drops.">Aspiration of biological viscoelastic drops.</a> Phys Rev Lett. 104, 218101-218101 (2010).</li></ol>

Medir la cohesión global de la prueba resulta relativamente sencillo. Hay, sin embargo, los pasos clave que hay que dominar con el fin de generar información útil TST; 1) Los agregados deben ser &quot;saludables&quot;. Esto puede ser controlado por asegurar que la formación de agregados se inicia con las células que están en la confluencia óptima antes de la separación. Tamaño de los agregados y el tiempo en la cultura también debe ser controlada para minimizar el desarrollo de un núcleo necrótico en el agre...

<ul><li> baño / agua agitador (New Brunswick Scientific, Edison, NJ) </li><li> 10 ml matraces de fondo redondo (Belco, Vineland, NJ) </li></ul>

measurement of aggregate cohesion by tissue surface tensiometry

Medición rigurosa de la energía de enlace intercelular sólo puede realizarse con métodos basados ​​en principios de la termodinámica en los sistemas en equilibrio. Hemos desarrollado tensiometría tejido de la superficie (TST) específicamente para medir la energía libre superficial de la interacción entre las células. Los conceptos biofísicos subyacentes TST han sido descritas previamente en 1,2 detalle. El método se basa en la observación de que las células entre sí coherente, si se mantiene en un cultivo agitado, espontáneamente, se reunirán en grupos. Con el tiempo, estos grupos se redondeará hacia arriba para formar esferas. Este comportamiento redondeo imita el comportamiento característico de los sistemas de líquido. Energía de enlace intercelular se mide mediante la compresión de los agregados esféricos entre placas paralelas en un tensiómetro de tejidos diseñados a la superficie. La misma ecuación matemática utilizada para medir la tensión superficial de una gota de líquido se utiliza para medir la tensión superficial de 3D, como los tejidos agregados esféricos. El equivalente celular de la tensión superficial líquido intercelular es la energía de unión, o más generalmente, cohesividad del tejido. Estudios anteriores de nuestro laboratorio han demostrado que la tensión del tejido superficial (1) predice cómo dos grupos de células embrionarias van a interactuar entre sí 1-5, (2) pueden influir fuertemente en la capacidad de los tejidos para interactuar con biomateriales 6, (3) puede ser alterada, no sólo a través de la manipulación directa de la cadherina-basado cohesión intercelular 7, sino también por la manipulación de las principales moléculas ECM como la FN 8.11 y 4) se correlaciona con el potencial invasivo de cáncer de pulmón 12, 13 fibrosarcoma, tumor cerebral 14 y tumor de próstata líneas celulares 15. En este artículo vamos a describir el aparato, el detalle de los pasos necesarios para generar esferoides, para cargar los esferoides en la cámara de tensiómetro, para iniciar la compresión de conjunto, y para analizar y validar las mediciones de la superficie del tejido tensión generada.

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Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry

Se describe un método para medir la energía de enlace, expresable como la tensión del tejido de la superficie, entre las células en 3D como el tejido de agregados. Las diferencias en la tensión de los tejidos superficiales se ha demostrado que se correlaciona con la invasión de los pulmones, los músculos y los tumores cerebrales, y son determinantes fundamentales del establecimiento de las relaciones espaciales entre los diferentes tipos de células.

La medición de la cohesión agregado por tensiometría tejido de la superficie

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium.  We ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.5K vistas.  UMDNJ-Robert Wood Johnson Medical School. Se describe un método para medir la energía de enlace, expresable como la tensión del tejido de la superficie, entre las células en 3D como el tejido de agregados. Las diferencias en la tensión de los tejidos superficiales se ha demostrado que se correlaciona con la invasión de los pulmones, los músculos y los tumores cerebrales, y son determinantes fundamentales del establecimiento de las relaciones espaciales entre los diferentes tipos de células.

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Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

La evaluación de la administración de genes nanopartículas poliméricas por nanopartículas de análisis de seguimiento y de alto rendimiento Citometría de Flujo

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Investigación

Bioingeniería

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Los andamios de autoinforme para el 3-Dimensional Cultivo Celular

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Preparation of Light-responsive Membranes by a Combined Surface Grafting and Postmodification Process

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is presented. The polymerization from the membrane surface is induced by plasma treatment of the membrane, followed by reacting the membrane surface with a methanolic solution of 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA). Special attention is given to the process parameters for the plasma treatment prior to the polymerization on the surface. For example, the influence of the plasma-treatment on different types of membranes (e.g.&#160;polyester, polycarbonate, polyvinylidene fluoride) is studied. Furthermore, the time-dependent stability of the surface-grafted membranes is shown by contact angle measurements. When grafting poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA) in this way, the surface can be further modified by esterification of the alcohol moiety of the polymer with a carboxylic acid function of the desired substance. These reactions can therefore be used for the functionalization of the membrane surface. For example, the surface tension of the membrane can be changed or a desired functionality as the presented light-responsiveness can be inserted. This is demonstrated by reacting PHEMA with a carboxylic acid functionalized spirobenzopyran unit which leads to a light-responsive membrane. The choice of solvent plays a major role in the postmodification step and is discussed in more detail in this paper. The permeability measurements of such functionalized membranes are performed using a Franz cell with an external light source. By changing the wavelength of the light from the visible to the UV-range, a change of permeability of aqueous caffeine solutions is observed.

A plasma-induced polymerization procedure is described for the surface-initiated polymerization on polymer membranes. Further postmodification of the grafted polymer with photochromic substances is presented with a protocol of conducting permeability measurements of light-responsive membranes.

Preparación de Membranas Light responden por un injerto superficial combinado y proceso de modificación posterior

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. Kelvin probe force microscopy (KPFM) is a module of atomic force microscopy (AFM) that measures the contact potential difference between surfaces at the nano-scale. The combination of KPFM with AFM allows for the simultaneous generation of surface potential and topographical maps of biological samples such as bacterial cells. Here, we employ KPFM to examine the effects of surface potential on microbial adhesion to medically relevant surfaces such as stainless steel and gold. Surface potential maps revealed differences in surface potential for microbial membranes on different material substrates. A step-height graph was generated to show the difference in surface potential at a boundary area between the substrate surface and microorganisms. Changes in cellular membrane surface potential have been linked with changes in cellular metabolism and motility. Therefore, KPFM represents a powerful tool that can be utilized to examine the changes of microbial membrane surface potential upon adhesion to various substrate surfaces. In this study, we demonstrate the procedure to characterize the surface potential of individual methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA100 cells on stainless steel and gold using KPFM.

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Superficie de medición de potencial de bacterias usando Kelvin Sonda de Microscopía de Fuerza

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of exosomes to determine if they carry disease discriminatory biomarkers. For performing exosomal analysis, it is necessary to develop a method for extracting and analyzing exosomes from target biofluids without damaging the internal content.
Electric field-induced release and measurement (EFIRM) is a method for specifically extracting exosomes from biofluids, unloading their cargo, and testing their internal RNA/protein content. Using an anti-human CD63 specific antibody magnetic microparticle, exosomes are first precipitated from biofluids. Following extraction, low-voltage electric cyclic square waves (CSW) are applied to disrupt the vesicular membrane and cause cargo unloading. The content of the exosome is hybridized to DNA primers or antibodies immobilized on an electrode surface for quantification of molecular content.
The EFIRM method is advantageous for extraction of exosomes and unloading cargo for analysis without lysis buffer. This method is capable of performing specific detection of both RNA and protein biomarker targets in the exosome. EFIRM extracts exosomes specifically based on their surface markers as opposed to size-based techniques.
Transmission electron microscopy (TEM) and assay demonstrate the functionality of the method for exosome capture and analysis. The EFIRM method was applied to exosomal analysis of 9 mice injected with human lung cancer H640 cells (a cell line transfected to express the exosome marker human CD63-GFP) in order to test their exosome profile against 11 mice receiving saline controls. Elevated levels of exosomal biomarkers (reference gene GAPDH and protein surface marker human CD63-GFP) were found for the H640 injected mice in both serum and saliva samples. Furthermore, saliva and serum samples were demonstrated to have linearity (R = 0.79). These results are suggestive for the viability of salivary exosome biomarkers for detection of distal diseases.

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement EFIRM

Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.

La detección de biomarcadores exosomal por inducida por campo eléctrico de lanzamiento y Medición (Efirm)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of ...

Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. Single muscle fiber studies are useful in both basic science and clinical studies. For basic studies, single muscle fiber contractility measurements allow investigation of fundamental mechanisms of force production, and analysis of muscle function in the context of genetic manipulations. Clinically, single muscle fiber studies provide useful insight into the impact of injury and disease on muscle function, and may be used to guide the understanding of muscular pathologies. In this video article we outline the steps required to prepare and isolate an individual skeletal muscle fiber segment, attach it to force-measuring apparatus, activate it to produce maximum isometric force, and estimate its cross-sectional area for the purpose of normalizing the force produced.

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. In this article we outline a valid and reliable technique to prepare and test permeabilized skeletal muscle fibers in vitro.

Medición de la fuerza isométrica máxima generada por las fibras musculares esqueléticas permeabilizadas

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to intrinsic parameters within the process allow a high degree of control over scaffold characteristics including fiber diameter, alignment and porosity. By developing scaffolds with similar dimensions and topographies to organ- or tissue-specific extracellular matrices (ECM), micro-environments representative to those that cells are exposed to in situ can be created. 
The airway bronchiole wall, comprised of three main micro-environments, was selected as a model tissue. Using decellularized airway ECM as a guide, we electrospun the non-degradable polymer, polyethylene terephthalate (PET), by three different protocols to produce three individual electrospun scaffolds optimized for epithelial, fibroblast or smooth muscle cell-culture. Using a commercially available bioreactor system, we stably co-cultured the three cell-types to provide an in vitro model of the airway wall over an extended time period.
This model highlights the potential for such methods being employed in in vitro diagnostic studies investigating important inter-cellular cross-talk mechanisms or assessing novel pharmaceutical targets, by providing a relevant platform to allow the culture of fully differentiated adult cells within 3D, tissue-specific environments.

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall.

Adaptación del Proceso Electrohilado para proporcionar tres ambientes únicos para un Tri-capa<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de la pared de la vía aérea

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Ingeniería de tejidos por intrínseca Vascularización en una<em&gt; En Vivo</em&gt; Cámara Ingeniería de Tejidos

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Site-Directed Immobilization of Bone Morphogenetic Protein 2 to Solid Surfaces by Click Chemistry

Different therapeutic strategies for the treatment of non-healing long bone defects have been intensively investigated. Currently used treatments present several limitations that have led to the use of biomaterials in combination with osteogenic growth factors, such as bone morphogenetic proteins (BMPs). Commonly used absorption or encapsulation methods require supra-physiological amounts of BMP2, typically resulting in a so-called initial burst release effect that provokes several severe adverse side effects. A possible strategy to overcome these problems would be to covalently couple the protein to the scaffold. Moreover, coupling should be performed in a site-specific manner in order to guarantee a reproducible product outcome. Therefore, we created a BMP2 variant, in which an artificial amino acid (propargyl-L-lysine) was introduced into the mature part of the BMP2 protein by codon usage expansion (BMP2-K3Plk). BMP2-K3Plk was coupled to functionalized beads through copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC). The biological activity of the coupled BMP2-K3Plk was proven in vitro and the osteogenic activity of the BMP2-K3Plk-functionalized beads was proven in cell based assays. The functionalized beads in contact with C2C12 cells were able to induce alkaline phosphatase (ALP) expression in locally restricted proximity of the bead. Thus, by this technique, functionalized scaffolds can be produced that can trigger cell differentiation towards an osteogenic lineage. Additionally, lower BMP2 doses are sufficient due to the controlled orientation of site-directed coupled BMP2. With this method, BMPs are always exposed to their receptors on the cell surface in the appropriate orientation, which is not the case if the factors are coupled via non-site-directed coupling techniques. The product outcome is highly controllable and, thus, results in materials with homogeneous properties, improving their applicability for the repair of critical size bone defects.

Biomaterials doped with Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP2) have been used as a new therapeutic strategy to heal non-union bone fractures. To overcome side effects resulting from an uncontrollable release of the factor, we propose a new strategy to site-directly immobilize the factor, thus creating materials with improved osteogenic capabilities.

Dirigida la inmovilización de la proteína ósea morfogenética 2 a superficies sólidas por química del tecleo

Different therapeutic strategies for the treatment of non-healing long bone defects have been intensively investigated. Currently used treatments present ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.