1. Aggregate Vorbereitung für die Messung von Gewebe Oberflächenspannung. Für adhärente Zellen können Sphäroide entweder mit dem hängenden Tropfen-Methode oder durch die Erzeugung eines kohärenten Blatt von Zellen, die dann in 1 mm-Fragmente geschnitten werden können gebildet werden. Aggregatbildung durch die hängenden Tropfen-Methode: <ol><li> Near-konfluenten adhärenten Zellkulturen zu 90% Konfluenz sollten angebaut werden sollten, worauf Monoschichten zweimal mit PBS gespült werden. Nach dem Ablassen gut, fügen Sie 2 ml (für 100 mm-Platten) von 0,05% Trypsin-1 mM EDTA, und bei 37 ° C, bis die Zellen zu lösen. Stoppen Trypsinierung durch Zugabe von 2 ml Vollmedium und sanft mit einem 5 ml-Pipette auf die Mischung verreiben, bis die Zellen in Suspension. Transfer-Zellen auf eine 15 ml konischen Rohr. </li><li> Add 40 ul einer 10 mg / ml DNAse Stammlösung und Inkubation für 5 Minuten bei RT. Vortex kurz und Zentrifuge bei 200 xg für 5 Minuten. </li><li> Überstand verwerfen und Pellet waschen mit 1 ml komplettem Zellkulturmedium. Wiederholen Sie dann die Zellen in 2 ml komplette Zellkulturmedium. </li><li> Zählen Sie die Zellen mit einem Hämacytometer oder automatisierte Zellzahl und passen Konzentration auf 2,5 x 10 6 Zellen / ml. </li><li> Entfernen Sie den Deckel von einem 60 mm Gewebe-Kulturschale und Platz 5 ml PBS in den Boden der Schale. Dies wird als Hydratation Kammer handeln. </li><li> Drehen Sie die Deckel und die Verwendung eines 20 ul Pipette zu 10 ul Tropfen auf der Unterseite des Deckels zu hinterlegen. Stellen Sie sicher, dass die Tropfen ausreichend voneinander entfernt sind so platziert, wie nicht zu berühren. Es ist möglich, mindestens 20 Tropfen pro Teller platzieren. </li><li> Drehen Sie die Deckel wieder auf das PBS-gefüllten unteren Kammer und bei 37 ° C / 5% CO 2 / 95% Luftfeuchtigkeit, überwachen die Tropfen täglich und inkubieren, bis entweder Zellschichten oder Aggregate gebildet haben. </li><li> Sobald Blätter zu bilden, sie können, um mit rundem Boden Glas Schüttler übertragen werden Kolben mit 3 ml Vollmedium und inkubiert in einem Schüttel-Wasserbad bei 37 ° C und 5% CO 2 bis Sphäroide zu bilden. </li></ol> Aggregatbildung durch die Zellschicht Methode: <ol start="9"><li> Einzel-Zellsuspensionen werden wie oben beschrieben, aber Konzentration auf 1x10 6 Zellen / ml eingestellt. </li><li> Transfer 3 ml der Zellsuspension auf 10 ml Rundkolben (Belco, Vineland, NJ). </li><li> Inkubieren Flaschen in einem Kreisel Wasserbad / Schüttler (New Brunswick Scientific, Edison, NJ) bei 37 ° C, 5% CO 2 für 4h bei 120 Umdrehungen pro Minute, bis die Zellen aus Trypsinierung erholen. </li><li> Transfer-Zellen, um ein Glas mit rundem Boden Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge bei 200 X g in einen dünnen Pellets. Inkubieren für weitere 24 h, bis eine zusammenhängende Platte bildet. </li><li> Vorsichtig schwenken die Kultur Rohr zu verdrängen das Blatt und gießen Sie den Inhalt der Kultur Röhre in eine kleine, sterile Glas Gewebe Kulturschale. </li><li> Verwenden Sie Mikro-Skalpell, um die Blätter in Fragmente verschiedener Größen geschnitten. </li><li> Inkubieren Fragmente bei 37 ° C auf dem Wasserbad Kreiselbrecher Schüttler bei 120 rpm unter 5% CO 2 für 2 bis 3 Tage oder bis sie kugelförmig. </li></ol> 2. Die Messung der gesamtwirtschaftlichen Oberflächenspannung <ol><li> Die Gewebeoberfläche Tensiometer. Die Apparatur ist in Abb. dargestellt. 1 und 2. Die Kompression Zelle (Abb. 3) besteht aus zwei Kammern besteht. Die äußere Kammer (OC) ist ein 37 ° C Umwälzpumpe angeschlossen und dient dazu, die Temperatur der inneren Kammer (IC) zu regulieren. Die Kammern sind aus Delrin gefräst gebaut und enthalten Quarzfenster zur Visualisierung des Aggregats. Die untere Einheit (LA) Schrauben in die Basis der inneren Kammer und wird auf 1 verwendet) Position des Aggregats in der inneren Kammer, 2) Siegel der Unterseite der inneren Kammer, 3) heben das Aggregat zur Kompression zu initiieren, und (4 ) regeln den Abstand zwischen den parallelen Platten und damit die Verdichtung des Aggregats. Der zentrale Kern (CC) der Montage ist einstellbar. Die Spitze des zentralen Kerns (der Sockel) ist aus glattem Teflon bestehen und agiert als die untere Druckplatte (LCP). Die obere Druckplatte (UCP) ist ein Teflon Zylinder 15mm lang, die aus dem Gleichgewicht Arm hängt (B) durch eine Flamme-begradigt Nickel-Chrom-Draht (NCW) *. Im Verlauf eines Experiments wird die Zelle Aggregat (A) auf der unteren Platte positioniert und aufgewachsen, bis er an der oberen Platte. Die obere Platte ist, das Gleichgewicht Arm (B) verbunden. Compression des Aggregats bewirkt eine Verschiebung des Gleichgewichts Arm. Die Waage ist ein Cahn / Ventron Modell 2000 Aufnahme Elektrowaage, die auf der Nullabgleich-Prinzip arbeitet. Der Drehpunkt der Waage Arm hat einen Anker in einem permanenten Magnetfeld. Wenn die Balance in Betrieb ist, ist es kontinuierlich moduliert den Strom durch die elektromagnetische Montage, was wiederum hält die Balance Arm in die horizontale Position. Wenn ein Objekt aus dem Gleichgewicht Arm, die Spannung, die das Gleichgewicht gilt für den Arm in der liegenden ode halten suspendiertNTAL Position, ist proportional zum Objekt wiegen. Diese Spannung misst die externe Druckkraft aufgebracht, um das Aggregat. Das Aggregat der Form wird durch visuelle Beobachtung durch ein 25 x Nikon SMZ10A Stereoskop gekoppelt an einen Computer mit einem Framegrabber ausgestattet überwacht. Um die Adhäsion von Zellverbänden, die Druckplatten zu minimieren, sowohl die untere und obere Druckplatten wurden mit Poly (2-Hydroxyethylmethacrylat) {Poly (HEMA)}, einem polymeren Material, um die Zellen nicht beachtet 16 beschichtet. * Der Draht ist schwer gerade durch den Strang ein 15-Zoll Länge des Drahtes aus einer Retorte stand und Spannen eine kleine Binder Clip bis zum Ende. Ein Bunsenbrenner wird dann nach oben und laufen über die gesamte Länge des Drahtes, bis der Draht glüht rot. Die begradigt Draht kann dann in die entsprechenden Längen geschnitten werden. Ein kleiner Haken ist durch Biegen des Drahtes ca. ¼ eines Zoll vom Ende mit zwei Rasierklingen gebildet. Das andere Ende wird dann in den Lauf der unteren Druckplatte eingesetzt. </li><li> Aggregate Kompression. <ol><li> Der Innenraum ist mit vorgewärmten CO 2-unabhängige Zellkulturmedium (Gibco / BRL, NY) gefüllt. </li><li> Aggregate mit einer Größe von etwa 200-300 μ auf der unteren Druckplatte (Abb. 4A) positioniert. Aggregate werden durch Absaugen ein Aggregat in Zellkulturmedium auf halber Höhe die Spitze einer Pasteurpipette mit einem Silikon-Glühlampe, die Übertragung der Pipette in die innere Kammer und der Positionierung der Spitze der Pipette über dem LCP geladen. Das Aggregat wird dann vorsichtig auf die LCP durch leichtes Drücken der Glühbirne vertrieben. Alternativ ist das Aggregat erlaubt, durch die Schwerkraft auf die LCP fallen. </li><li> Die obere Druckplatte (UCP) ist über dem Aggregat positioniert und sich absetzen dürfen, zur Schaffung einer pre-Kompression deutlich UCP Gewicht Grundlinie. </li><li> Das LCP wird dann erhöht, bis das Aggregat gegen die UCP (Abb. 4B) komprimiert wird. Einstellen der Höhe des inneren Kerns der unteren Apparat wird die Kontrolle verschiedener Grade der Komprimierung. Die Kompression ist durch Beobachtung durch ein Binokular mit einer CCD-Videokamera ausgestattet überwacht. </li><li> Aggregate Bilder aufgenommen, digitalisiert und analysiert mit ImageJ. Scheinbare UCP Gewichtsveränderung ist kontinuierlich auf einem Strip-Chart Recorder, Erreichen der Form Gleichgewicht durch die Abflachung der Cahn Waage Spannungsausgang bezeichnet aufgezeichnet. Jedes Aggregat ist auf 2 verschiedene Grade der Komprimierung unterzogen. </li></ol></li><li> Berechnung von zusammengesetzten Oberflächenspannung. In Form Gleichgewicht, kann die Kohäsivität der ein Aggregat von Zellen zwischen parallelen Platten, auf die sie nicht haftet komprimierten aus der Young-Laplace-Gleichung (Abb. 5), wo σ erhalten werden Kohäsivität, F die Kraft, um das Aggregat zu komprimieren , &amp;pgr; r 3 2 ist der Bereich der Oberfläche des Aggregats auf die Kraft F ausgeübt wird, und R 2 und R 3 sind jeweils der Radius des Äquators der komprimierten aggregieren und den Radius eines Bogens der Definition seiner Oberfläche Profil normalen zum Komprimieren von Platten und sich zwischen ihnen (Abb. 6). Die Messung der Druckkraft und Geometrie an Kraft und Form Gleichgewicht und die Anwendung dieser Messungen, die Young-Laplace-Gleichung erzeugt Zahlenwerte der scheinbaren Gewebe Oberflächenspannung. Nach Erreichen des Gleichgewichts und Berechnung von σ 1, sind Aggregate dekomprimiert und erlaubt, eine zweite Gleichgewicht Ansatz und σ 2 berechnet wird, wie oben beschrieben. </li><li> Bestätigung der aggregierten Liquidität. Die berechnete Oberflächenspannung einer flüssigen Aggregatzustand wird, wenn zwei verschiedene Kompressionen ausgesetzt bleiben konstant. In solchen Aggregaten das Verhältnis von σ 2 / σ 1 wird gleich 1 und kleiner sein als das Verhältnis der Kraft an jeder nachfolgenden Kompression (F 2 / F 1) angewendet. Im Gegensatz dazu wird die berechnete Oberflächenspannung eines elastischen Aggregats gehorchen dem Hookeschen Gesetz und Erhöhung proportional zur angelegten Kraft. Für elastische Aggregate das Verhältnis von σ 2 / σ 1 nicht gleich 1 sein, sondern stattdessen Ansatz das Verhältnis von F 2 / F 1. Die Oberflächenspannung der Flüssigkeit Aggregate werden auch unabhängig von der Körnung 2,17. Nur Messungen, bei denen die Oberflächenspannung ist unabhängig von der aufgebrachten Kraft und Größe verwendet werden, um durchschnittlich für jede Zelllinie σ berechnen. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse: Unten ist eine Tabelle der typischen TST für Aggregate Rattenprostata Fibroblasten (RPF) und Rattenprostata glatten Muskelzellen (RPSMC). Wie in Abb. zu sehen. 7 Aggregate von RPF-Zellen haben eine Oberflächenspannung von 22,8 ± 1,1 dyn / cm. Darüber hinaus waren die mittleren Werte der Oberflächenspannung nach der Kompression 1 und nach der Komprimierung 2 gemessen statistisch identschen, wenn sie von einem gepaarten t-Test verglichen. Wir haben auch das Verhältnis von σ 2 / σ 1 und F 2 / F 1, um sicherzustellen, dass diese Aggregate nicht gehorchen dem Hookeschen Gesetz, da sie, wenn sie verhalten würde, wie elastische Festkörper verglichen. Wie in Tabelle 1, das Verhältnis von σ 2 / σ 1 gilt in der Tat Ansatz 1,0 demonstriert. Darüber hinaus wurde das Verhältnis von F 2 / F 1 signifikant größer als σ 2 / σ 1 (gepaarter t-Test, P &lt;0,05), eine weitere Bestätigung, dass diese Aggregate nicht gehorchen dem Hookeschen Gesetz und in der Tat wie Flüssigkeiten verhalten. Im Gegensatz RPSMCs gehorchte Hookeschen Gesetz. Wie sich in Tabelle 1, das Verhältnis von σ 2 / σ 1 ist deutlich größer als 1 und war statistisch nicht unterschiedlich als die von F 2 / F 1. Um weiter zu zeigen Flüssigkeit-ähnliches Verhalten, erkundeten wir die Beziehung zwischen Oberflächenspannung (σ) und dem Gesamtvolumen. Wie in Abb. zu sehen. 8, Lautstärke unabhängig von Sigma für RPF-Zellen (rot Regressionsgerade, r 2 = 0,002), während es scheint einige Abhängigkeit von Sigma auf Volumen für RPSMCs (blau Regressionsgerade, r 2 = 0,146) werden. Diese Daten bestätigen, dass RPF Aggregate in einer Flüssigkeit wie verhalten, während die der RPSMCs mehr als elastische Festkörper verhalten scheinen. Nur diejenigen Aufmaß von Aggregaten verhalten, als Flüssigkeiten erhalten würde verwendet, um die Oberflächenspannung berechnet werden. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Übersicht der Gewebeoberfläche Tensiometer. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Eine detailliertere Ansicht der Tensiometer Kammer (rechts). <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Schematische Darstellung der Tensiometer Kammer. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig4.jpg" alt="Abbildung 4"/> Abbildung 4. Images von unkomprimierten (A) und komprimiert (B) Aggregate. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig5.jpg" alt="Abbildung 5"/> Abbildung 5. Die Laplace-Gleichung. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig6.jpg" alt="Abbildung 6"/> Abbildung 6. Schematische Darstellung eines flüssigen Tropfens zwischen zwei parallelen Platten, auf die sie schlecht haftet, auf Form Gleichgewicht komprimiert. R 1 und R 2 sind die beiden primären Krümmungsradien an den Tropfen des Äquators und in einer Ebene durch die Achse der Symmetrie hat. R 3 ist der Radius des Tropfens ist kreisförmigen Kontaktfläche entweder mit Druckplatte. H ist der Abstand zwischen oberer und unterer Druckplatten. X ist eine Seite eines rechtwinkligen Dreiecks mit Hypotenuse R 2, die sich bis zu einem Punkt des Kontaktes zwischen den Tropfen die Oberfläche und entweder Druckplatte. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> σ 1 (Dyn / cm ± SEM) </td><td> σ 2 (dyn / cm ± SEM) </td><td> Pσ 1 vs σ 2 </td><td> σ 1,2 (dyn / cm ± SEM) </td><td> σ 2 / σ 1 </td><td> F 2 / F 1 </td><td> Pσ 2 / σ 1 und F 2 F 1 </td></tr><tr><td> RPF </td><td> 22,6 ± 1,7 </td><td> 22,9 ± 1,4 </td><td> &gt; 0,05 * </td><td> 22,8 ± 1,1 </td><td> 1,04 ± 0,04 </td><td> 1,47 ± 0,06 </td><td> &lt;0,05 </td></tr><tr><td> RPSMC </td><td> 15,0 ± 2,8 </td><td> 23,0 ± 3,2 </td><td> 0,039 </td><td> NA </td><td> 1,9 ± 0,3 </td><td> 1,6 ± 0,1 </td><td> 0,16 * </td></tr></tbody></table> Abbildung 7. TST Messungen und Bestätigung der aggregierten Liquidität für Aggregate Rattenprostata Fibroblasten und glatten Muskelzellen. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig8.jpg" alt="Abbildung 8"/> Abbildung 8. Beziehung zwischen Sigma und das Volumen für Aggregate der RPF (rote Linie) und RPSMCs (blaue Linie).

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	<li>Foty, R. A., Forgacs, G., Pfleger, C. M., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+properties+of+embryonic+tissues:+Measurement+of+interfacial+tensions.">Liquid properties of embryonic tissues: Measurement of interfacial tensions.</a> Phys Rev Lett. 72, 2298-2301 (1994).</li><li>Foty, R. A., Pfleger, C. M., Forgacs, G., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+tensions+of+embryonic+tissues+predict+their+mutual+envelopment+behavior.">Surface tensions of embryonic tissues predict their mutual envelopment behavior.</a> Development. 122, 1611-1620 (1996).</li><li>Schotz, E. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+differences+in+tissue+surface+tension+influence+zebrafish+germ+layer+positioning.">Quantitative differences in tissue surface tension influence zebrafish germ layer positioning.</a> HFSP Journal. 2, 42-56 (2008).</li><li>Jia, D., Dajusta, D., Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+surface+tensions+guide+in+vitro+self-assembly+of+rodent+pancreatic+islet+cells.">Tissue surface tensions guide in vitro self-assembly of rodent pancreatic islet cells.</a> Dev Dyn. 236, 2039-2049 (2007).</li><li>Schwarz, M. A., Zheng, H., Legan, S., Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+Self-Assembly+is+Modulated+by+Tissue+Surface+Tensions.">Lung Self-Assembly is Modulated by Tissue Surface Tensions.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. , (2010).</li><li>Ryan, P. L., Foty, R. A., Kohn, J., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+spreading+on+implantable+substrates+is+a+competitive+outcome+of+cell-cell+vs.+cell-substratum+adhesivity.">Tissue spreading on implantable substrates is a competitive outcome of cell-cell vs. cell-substratum adhesivity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 4323-4327 (2001).</li><li>Foty, R. A., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+differential+adhesion+hypothesis:+a+direct+evaluation.">The differential adhesion hypothesis: a direct evaluation.</a> Dev Biol. 278, 255-263 (2005).</li><li>Robinson, E. E., Foty, R. A., Corbett, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+matrix+assembly+regulates+alpha5beta1-mediated+cell+cohesion.">Fibronectin matrix assembly regulates alpha5beta1-mediated cell cohesion.</a> Mol Biol Cell. 15, 973-981 (2004).</li><li>Robinson, E. E., Zazzali, K. M., Corbett, S. A., Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha5beta1+integrin+mediates+strong+tissue+cohesion.">alpha5beta1 integrin mediates strong tissue cohesion.</a> J Cell Sci. 116, 377-386 (2003).</li><li>Winters, B. S., Raj, B. K., Robinson, E. E., Foty, R. A., Corbett, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+regulates+Raf-1+expression+to+modulate+fibronectin+matrix+assembly.">Three-dimensional culture regulates Raf-1 expression to modulate fibronectin matrix assembly.</a> Mol Biol Cell. 17, 3386-3396 (2006).</li><li>Caicedo-Carvajal, C. E., Shinbrot, T., Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha5beta1+integrin-fibronectin+interactions+specify+liquid+to+solid+phase+transition+of+3D+cellular+aggregates.">Alpha5beta1 integrin-fibronectin interactions specify liquid to solid phase transition of 3D cellular aggregates.</a> PLoS One. 5, e11830-e11830 (2010).</li><li>Foty, R. A., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+tumor+cell+cohesion+and+suppression+of+invasion+by+E-+or+P-cadherin.">Measurement of tumor cell cohesion and suppression of invasion by E- or P-cadherin.</a> Cancer Res. 57, 5033-5036 (1997).</li><li>Foty, R. A., Corbett, S. A., Schwarzbauer, J. E., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexamethasone+up-regulates+cadherin+expression+and+cohesion+of+HT-1080+human+fibrosarcoma+cells.">Dexamethasone up-regulates cadherin expression and cohesion of HT-1080 human fibrosarcoma cells.</a> Cancer Res. 58, 3586-3589 (1998).</li><li>Winters, B. S., Shepard, S. R., Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+measurement+of+brain+tumor+cohesion.">Biophysical measurement of brain tumor cohesion.</a> Int J Cancer. 114, 371-379 (2005).</li><li>Foty, R. A., Cummings, K. B., Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+surface+tensiometry:+a+novel+technique+for+predicting+invasive+potential+of+prostate+tumors+based+on+tumor+cell+aggregate+cohesivity+in+vitro.">Tissue surface tensiometry: a novel technique for predicting invasive potential of prostate tumors based on tumor cell aggregate cohesivity in vitro.</a> Surgical Forum L. , 707-708 (1999).</li><li>Folkman, J., Moscona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cell+shape+in+growth+control.">Role of cell shape in growth control.</a> Nature. 273, 345-349 (1978).</li><li>Foty, R. A., Forgacs, G., Pfleger, C. M., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+properties+of+embryonic+tissues:+Measurement+of+interfacial+tensions.">Liquid properties of embryonic tissues: Measurement of interfacial tensions.</a> Physical Review Letters. 72, 2298-2301 (1994).</li><li>Guevorkian, K., Colbert, M. J., Durth, M., Dufour, S., Brochard-Wyart, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspiration+of+biological+viscoelastic+drops.">Aspiration of biological viscoelastic drops.</a> Phys Rev Lett. 104, 218101-218101 (2010).</li></ol>

Mess-Aggregat Zusammenhalt durch TST ist relativ einfach. Es gibt jedoch wichtige Schritte, die gemeistert werden müssen, um nutzbare TST Daten vorzulegen; 1) Aggregate müssen &quot;gesund&quot;. Dies kann durch Sicherstellung, dass Aggregatbildung mit Zellen, die bei optimaler Zusammenfluss vor Ablösung sind beginnt gesteuert werden. Aggregate Größe und Zeit in der Kultur müssen ebenfalls kontrolliert, um die Entwicklung eines nekrotischen Kern innerhalb der Aggregation zu minimieren; 2) Ein weiterer Parameter, T...

<ul><li> Wasserbad / Schüttler (New Brunswick Scientific, Edison, NJ) </li><li> 10 ml Rundkolben (Belco, Vineland, NJ) </li></ul>

measurement of aggregate cohesion by tissue surface tensiometry

Der objektiven Messung von interzellulären Bindungsenergie kann nur mit Methoden in thermodynamischen Prinzipien in Systemen geerdet im Gleichgewicht sein. Wir haben Gewebeoberfläche Tensiometrie (TST) entwickelt speziell auf die freie Oberflächenenergie der Interaktion zwischen Zellen zu messen. Die biophysikalischen zugrunde liegenden Konzepte TST wurden bereits im Detail 1,2 beschrieben. Die Methode beruht auf der Beobachtung, dass beide Seiten geschlossene Zellen, wenn in Schüttelkultur gepflegt wird spontan in Cluster zusammenbauen basiert. Mit der Zeit werden diese Cluster Runde bis zu Kugeln zu bilden. Diese Aufrundung Verhalten imitiert das Verhalten charakteristisch für flüssigen Systemen. Interzelluläre Bindungsenergie wird durch Zusammendrücken sphärische Aggregate zwischen parallelen Platten in einem speziell entwickelten Gewebe Oberfläche Tensiometer gemessen. Das gleiche mathematische Gleichung benutzt, um die Oberflächenspannung einer flüssigen Tropfen messen wird verwendet, um die Oberflächenspannung von 3D-Gewebe-like kugelförmigen Aggregaten zu messen. Die zelluläre Äquivalent von Flüssigkeit Oberflächenspannung interzellulären Bindungsenergie, oder allgemeiner, Gewebe Kohäsivität. Frühere Studien aus unserem Labor haben gezeigt, dass Gewebe Oberflächenspannung (1), wie zwei Gruppen von embryonalen Zellen miteinander interagieren 1-5, (2) können einen starken Einfluss auf die Fähigkeit von Geweben mit Biomaterialien 6 zusammenwirken, (3) kann prognostiziert nicht nur durch direkte Manipulation von Cadherin-basierten interzellulären Zusammenhalt 7, sondern auch durch Manipulation der wichtigsten ECM-Moleküle wie FN 8-11 und 4) verändert werden korreliert mit invasive Potential von Lungenkrebs 12, Fibrosarkom 13, Gehirntumor 14 und Prostata-Tumor Zell-Linien 15. In diesem Artikel werden wir das Gerät beschrieben und detailliert die Schritte erforderlich, um Sphäroide zu generieren, um die Sphäroide in das Tensiometer Kammer laden, zu aggregieren Kompression zu initiieren und zu analysieren und zu validieren das Gewebe Messung der Oberflächenspannung erzeugt.

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Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry

Wir beschreiben eine Methode zur Messung der Bindungsenergie, ausdrückbar als Gewebe Oberflächenspannung zwischen den Zellen in 3D-Gewebe-like-Aggregate. Unterschiede im Gewebe Oberflächenspannung wurde gezeigt, dass mit Invasivität der Lunge, Muskel-und Hirntumoren zu korrelieren, und sind von grundlegender Bedeutung Determinanten der Gründung räumlichen Beziehungen zwischen den verschiedenen Zelltypen.

Die Messung der Aggregate Zusammenhalt durch Gewebeoberfläche Tensiometrie

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium.  We ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.5K Aufrufe.  UMDNJ-Robert Wood Johnson Medical School. Wir beschreiben eine Methode zur Messung der Bindungsenergie, ausdrückbar als Gewebe Oberflächenspannung zwischen den Zellen in 3D-Gewebe-like-Aggregate. Unterschiede im Gewebe Oberflächenspannung wurde gezeigt, dass mit Invasivität der Lunge, Muskel-und Hirntumoren zu korrelieren, und sind von grundlegender Bedeutung Determinanten der Gründung räumlichen Beziehungen zwischen den verschiedenen Zelltypen.

Serie: Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

Evaluation von polymeren Gene Delivery-Nanopartikeln durch Nanopartikel Tracking-Analyse und High-throughput Durchflusszytometrie

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Forschung

Biotechnik

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Selbstberichts Gerüste für 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Preparation of Light-responsive Membranes by a Combined Surface Grafting and Postmodification Process

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is presented. The polymerization from the membrane surface is induced by plasma treatment of the membrane, followed by reacting the membrane surface with a methanolic solution of 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA). Special attention is given to the process parameters for the plasma treatment prior to the polymerization on the surface. For example, the influence of the plasma-treatment on different types of membranes (e.g.&#160;polyester, polycarbonate, polyvinylidene fluoride) is studied. Furthermore, the time-dependent stability of the surface-grafted membranes is shown by contact angle measurements. When grafting poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA) in this way, the surface can be further modified by esterification of the alcohol moiety of the polymer with a carboxylic acid function of the desired substance. These reactions can therefore be used for the functionalization of the membrane surface. For example, the surface tension of the membrane can be changed or a desired functionality as the presented light-responsiveness can be inserted. This is demonstrated by reacting PHEMA with a carboxylic acid functionalized spirobenzopyran unit which leads to a light-responsive membrane. The choice of solvent plays a major role in the postmodification step and is discussed in more detail in this paper. The permeability measurements of such functionalized membranes are performed using a Franz cell with an external light source. By changing the wavelength of the light from the visible to the UV-range, a change of permeability of aqueous caffeine solutions is observed.

A plasma-induced polymerization procedure is described for the surface-initiated polymerization on polymer membranes. Further postmodification of the grafted polymer with photochromic substances is presented with a protocol of conducting permeability measurements of light-responsive membranes.

Herstellung der lichtreaktions Membranen durch eine Kombinierte Oberflächen-Pfropfen und Postmodification Prozess

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. Kelvin probe force microscopy (KPFM) is a module of atomic force microscopy (AFM) that measures the contact potential difference between surfaces at the nano-scale. The combination of KPFM with AFM allows for the simultaneous generation of surface potential and topographical maps of biological samples such as bacterial cells. Here, we employ KPFM to examine the effects of surface potential on microbial adhesion to medically relevant surfaces such as stainless steel and gold. Surface potential maps revealed differences in surface potential for microbial membranes on different material substrates. A step-height graph was generated to show the difference in surface potential at a boundary area between the substrate surface and microorganisms. Changes in cellular membrane surface potential have been linked with changes in cellular metabolism and motility. Therefore, KPFM represents a powerful tool that can be utilized to examine the changes of microbial membrane surface potential upon adhesion to various substrate surfaces. In this study, we demonstrate the procedure to characterize the surface potential of individual methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA100 cells on stainless steel and gold using KPFM.

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Oberflächenpotentialmessung von Bakterien mit Kelvin-Sonde Kraftmikroskopie

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of exosomes to determine if they carry disease discriminatory biomarkers. For performing exosomal analysis, it is necessary to develop a method for extracting and analyzing exosomes from target biofluids without damaging the internal content.
Electric field-induced release and measurement (EFIRM) is a method for specifically extracting exosomes from biofluids, unloading their cargo, and testing their internal RNA/protein content. Using an anti-human CD63 specific antibody magnetic microparticle, exosomes are first precipitated from biofluids. Following extraction, low-voltage electric cyclic square waves (CSW) are applied to disrupt the vesicular membrane and cause cargo unloading. The content of the exosome is hybridized to DNA primers or antibodies immobilized on an electrode surface for quantification of molecular content.
The EFIRM method is advantageous for extraction of exosomes and unloading cargo for analysis without lysis buffer. This method is capable of performing specific detection of both RNA and protein biomarker targets in the exosome. EFIRM extracts exosomes specifically based on their surface markers as opposed to size-based techniques.
Transmission electron microscopy (TEM) and assay demonstrate the functionality of the method for exosome capture and analysis. The EFIRM method was applied to exosomal analysis of 9 mice injected with human lung cancer H640 cells (a cell line transfected to express the exosome marker human CD63-GFP) in order to test their exosome profile against 11 mice receiving saline controls. Elevated levels of exosomal biomarkers (reference gene GAPDH and protein surface marker human CD63-GFP) were found for the H640 injected mice in both serum and saliva samples. Furthermore, saliva and serum samples were demonstrated to have linearity (R = 0.79). These results are suggestive for the viability of salivary exosome biomarkers for detection of distal diseases.

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement EFIRM

Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.

Der Nachweis von exosomalen Biomarker von Electric Field-induzierte Freisetzung und Messung (Efirm)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of ...

Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. Single muscle fiber studies are useful in both basic science and clinical studies. For basic studies, single muscle fiber contractility measurements allow investigation of fundamental mechanisms of force production, and analysis of muscle function in the context of genetic manipulations. Clinically, single muscle fiber studies provide useful insight into the impact of injury and disease on muscle function, and may be used to guide the understanding of muscular pathologies. In this video article we outline the steps required to prepare and isolate an individual skeletal muscle fiber segment, attach it to force-measuring apparatus, activate it to produce maximum isometric force, and estimate its cross-sectional area for the purpose of normalizing the force produced.

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. In this article we outline a valid and reliable technique to prepare and test permeabilized skeletal muscle fibers in vitro.

Die Messung der isometrischen Maximalkraft von permeabilisierten Skelettmuskelfasern generiert

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to intrinsic parameters within the process allow a high degree of control over scaffold characteristics including fiber diameter, alignment and porosity. By developing scaffolds with similar dimensions and topographies to organ- or tissue-specific extracellular matrices (ECM), micro-environments representative to those that cells are exposed to in situ can be created. 
The airway bronchiole wall, comprised of three main micro-environments, was selected as a model tissue. Using decellularized airway ECM as a guide, we electrospun the non-degradable polymer, polyethylene terephthalate (PET), by three different protocols to produce three individual electrospun scaffolds optimized for epithelial, fibroblast or smooth muscle cell-culture. Using a commercially available bioreactor system, we stably co-cultured the three cell-types to provide an in vitro model of the airway wall over an extended time period.
This model highlights the potential for such methods being employed in in vitro diagnostic studies investigating important inter-cellular cross-talk mechanisms or assessing novel pharmaceutical targets, by providing a relevant platform to allow the culture of fully differentiated adult cells within 3D, tissue-specific environments.

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall.

Anpassung der Elektrospinnverfahren für einen Dreischicht stellen drei einzigartige Umgebungen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell der Atemwegswand

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Tissue Engineering von Intrinsic Vaskularisation in ein<em&gt; In Vivo</em&gt; Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Site-Directed Immobilization of Bone Morphogenetic Protein 2 to Solid Surfaces by Click Chemistry

Different therapeutic strategies for the treatment of non-healing long bone defects have been intensively investigated. Currently used treatments present several limitations that have led to the use of biomaterials in combination with osteogenic growth factors, such as bone morphogenetic proteins (BMPs). Commonly used absorption or encapsulation methods require supra-physiological amounts of BMP2, typically resulting in a so-called initial burst release effect that provokes several severe adverse side effects. A possible strategy to overcome these problems would be to covalently couple the protein to the scaffold. Moreover, coupling should be performed in a site-specific manner in order to guarantee a reproducible product outcome. Therefore, we created a BMP2 variant, in which an artificial amino acid (propargyl-L-lysine) was introduced into the mature part of the BMP2 protein by codon usage expansion (BMP2-K3Plk). BMP2-K3Plk was coupled to functionalized beads through copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC). The biological activity of the coupled BMP2-K3Plk was proven in vitro and the osteogenic activity of the BMP2-K3Plk-functionalized beads was proven in cell based assays. The functionalized beads in contact with C2C12 cells were able to induce alkaline phosphatase (ALP) expression in locally restricted proximity of the bead. Thus, by this technique, functionalized scaffolds can be produced that can trigger cell differentiation towards an osteogenic lineage. Additionally, lower BMP2 doses are sufficient due to the controlled orientation of site-directed coupled BMP2. With this method, BMPs are always exposed to their receptors on the cell surface in the appropriate orientation, which is not the case if the factors are coupled via non-site-directed coupling techniques. The product outcome is highly controllable and, thus, results in materials with homogeneous properties, improving their applicability for the repair of critical size bone defects.

Biomaterials doped with Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP2) have been used as a new therapeutic strategy to heal non-union bone fractures. To overcome side effects resulting from an uncontrollable release of the factor, we propose a new strategy to site-directly immobilize the factor, thus creating materials with improved osteogenic capabilities.

Site-verwiesene Immobilisierung von Knochen morphogenetische Protein 2 an feste Oberflächen durch Click-Chemie

Different therapeutic strategies for the treatment of non-healing long bone defects have been intensively investigated. Currently used treatments present ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.