1。組織の表面張力の測定のための集約準備。 接着細胞の場合は、スフェロイドはどちらハンギングドロップ法を使用するか、1 mmの断片に切断することができる細胞の首尾一貫したシートを生成することにより形成することができる。 ハンギングドロップ法による凝集体形成： <ol><li>ほぼコンフルエント接着細胞の培養は、90％コンフルエントまで増殖されるべき、whereupon単層をPBSで2回リンスする必要があります。よく排水後、0.05％トリプシン- 1mMのEDTAの2 MLSを（100 mmプレートの場合）追加し、37℃での細胞がデタッチされるまで。完全培地の2 MLSを追加することにより、トリプシン処理を停止し、静かに、細胞が懸濁液になるまで混合物を砕いて粉にするために5 mlのピ​​ペットを使用してください。 15 mlコニカルチューブに細胞を移す。 </li><li>に10 mg / mlのDNaseストック溶液40μlを加え、室温で5分間インキュベートする。 5分間、200 xgで軽くボルテックスして、遠心。 </li><li>上清を捨て、1mlの完全な組織培養の培地でペレットを洗浄。繰り返しますが、その後、完全な組織培養培地の2 MLSで細胞を懸濁します。 </li><li>血球計算盤、または自動細胞計数装置を用いて細胞をカウントし、2.5 × 10 6細胞/ mlに濃度を調整する。 </li><li> 60 mmの組織培養皿と皿の底の場所のPBS 5mlのをから蓋を外します。これは、水和室として機能します。 </li><li>蓋を逆さにして蓋の底部上に10μlの滴を堆積させるために20μlのピペットを使用してください。触れないでするように十分離れてドロップが配置されていることを確認してください。皿ごとに少なくとも20滴を配置することが可能です。 </li><li> 37 PBS -満ちボトムチャンバーとインキュベート℃/ 5％CO 2 /湿度95％の上にふたを反転させる、毎日の低下を監視し、細胞シートまたは凝集体のいずれかが形成するまでインキュベートする。 </li><li>一度シートの形、それらが回転楕円体の形になるまで℃、5％CO 2を完全培地の3のMLSを含む丸底ガラスシェーカーフラスコに移し、37で振とう水浴中でインキュベートすることができます。 </li></ol>細胞シート法による凝集体形成： <ol start="9"><li>単一の細胞懸濁液は、上記で調製されるが、濃度が1 × 10 6細胞/ mlに調整されます。 </li><li> 10ミリリットルの丸底フラスコ（Belco、ヴァインランド、ニュージャージー州）に細胞懸濁液の3mlを転送する。 </li><li>細胞はトリプシン処理から回復するまで旋回水浴/ 37シェーカー（ニューブランズウィックサイエンティフィック、エジソン、ニュージャージー州）° C、120 rpmで4時間、5％CO 2のフラスコをインキュベートする。 </li><li>ガラス丸底遠沈管と薄いペレットに200 X gで遠心して細胞を移す。一貫性のあるシートのフォームになるまでさらに24時間インキュベートする。 </li><li>ゆっくりと旋回培養チューブにシートを取り除くと、小さな、滅菌ガラスの組織培養皿に培養試験管の内容を注ぐことに。 </li><li>さまざまなサイズのフラグメントに複数のシートをカットするマイクロメスを使用してください。 </li><li> 2〜3日のために37℃、5％CO 2下で120rpmで旋回水浴シェーカー上でC言語をフラグメントをインキュベートするか、彼らは球状になるまで。 </li></ol> 2。骨材の表面張力の測定<ol><li> 組織の表面張力計 。装置は図に示されています。 1と2。圧縮のセル（図3）は、2つのチャンバーで構成されています。外室（OC）を37℃の循環水ポンプに接続され、内側のチャンバー（IC）の温度を調節する働きをする。チャンバーは、粉砕されたデルリン製で、集約の可視化のための石英窓を含みます。インナーチャンバーの底にアセンブリ（LA）ねじ下、1）内側のチャンバー内に集約して配置するために使用され、2）インナーチャンバーの底をシールし、3）圧縮を開始するために集計を高める、（4 ）パラレルプレート、したがって、集約の圧縮の間の距離を制御する。アセンブリの中央コア（CC）が調整可能です。中央のコア（台座）の先端は、滑らかなテフロンで構成され、低い圧縮プレート（LCP）として機能します。上部の圧縮プレート（UCP）は、バランスのアームからハング（B）難まっすぐニッケルクロムワイヤーで（NCW）長いテフロンのシリンダー15ミリメートル*です。実験の過程で、細胞の集合体は、（）下のプレート上に位置しているとに接触するまで、上部プレートを調達。上部のプレートは、バランスアーム（B）に接続されています。集合体の圧縮は、バランスアームの変位を引き起こす。バランスはヌルバランスの原理で動作カーン/ Ventronモデル2000の記録電気てんびん、です。バランスアームの支点は、永久磁界内に電機子を持っています。バランスが動作しているとき、それは継続的に順番に水平位置でバランスの腕を維持する電磁アセンブリ、流れる電流を変調する。オブジェクトは、バランスがhorizo​​に腕を保つために適用されるバランスのアーム、電圧、から中断されている場合ntal位置は、オブジェクトの重さに比例します。この電圧は、アグリゲートに印加される外部圧縮力を測定します。骨材の形状は、フレームグラバーを装備しているコンピュータに結合さ25 ×ニコンSMZ10Aのステレオスコープを介して目視により監視されます。圧縮プレートに細胞凝集体の付着を最小限に抑えるため、両方の下限と上限圧縮板にするためのポリ（2 -ヒドロキシエチルメタクリレート）{ポリ（HEMA）}、細胞が16を付着していないために高分子材料で被覆した。 *ワイヤーは、レトルトのスタンドからワイヤーの15インチの長さを吊り下げて最後に小さなバインダークリップをクランプして、火炎をまっすぐにしています。線が赤色に点灯するまで、ブンゼンバーナーは、ワイヤの長さを上下に実行している。まっすぐに伸ばした線は適切な長さに切断することができます。小さなフックは2つのかみそりの刃を使用してエンドから1インチのワイヤー約¼を曲げることにより形成される。もう一方の端は、低い圧縮プレートのバレルに挿入されます。 </li><li> 骨材の圧縮。 <ol><li>インナーチャンバーは、予め温めておいたCO 2に依存しない組織培養培地（GIBCO / BRL、NY）で満たされている。 </li><li>約200〜300μからサイズの範囲の凝集体は、低い圧縮プレート（図4A）に配置されています。集計は、シリコン球を装着したパスツールピペットの先端までの組織培養の培地半分の方法で集計を吸引し、内側チャンバーにピペットを転送、およびLCP上記ピペットの先端を置くことによってロードされます。集計は、優しく静かに球を押し込んでLCPに排出されます。また、骨材は、LCPの上に重力によって落下することが許可されます。 </li><li>上部の圧縮プレート（UCP）は、骨材の上に配置し、圧縮前見かけUCPの重量のベースラインを確立し、沈降さ。 </li><li>アグリゲートがUCP（図4B）に対して圧縮されるまで、LCPは、その後発生します。下の装置の内部コアの高さを調整すると、圧縮の程度の違いを制御します。圧縮は、CCDビデオカメラを備えた解剖顕微鏡を通して観察によって監視されます。 </li><li>集約画像は、キャプチャ、デジタル化、およびImageJを用いて分析している。見かけのUCPの体重の変化が連続的にストリップチャートレコーダーに記録され、形状の均衡の達成は、カーンのバランスの電圧出力の平準化オフで示されている。各集合体は、圧縮の2種類の異なる度に供される。 </li></ol></li><li> 骨材の表面張力の計算。 形状の平衡状態では、それが付着していないために平行平板間の圧縮された細胞の集合体のcohesivityはcohesivityは、Fは集約を圧縮するために作用する力であるσのヤングラプラスの方程式（図5）、から得ることができます。 、πR3 2は、力Fの力が作用する際に骨材の表面の面積であり、そしてR 2及びR 3は 、それぞれ、圧縮された集合体の赤道の半径とその表面形状が通常の定義円弧の半径です。プレートを圧縮し、それら（図6）との間に延在する。力と形状の平衡状態での圧縮力と形状を測定し、ヤングラプラスの方程式に、これらの測定値を適用すると、見かけの組織の表面張力の数値を生成します。 σの1の平衡と計算に到達すると、凝集体が解凍され、第2平衡に近づくと、上記のように2が算出されるσをすることができました。 </li><li> 集合体流動性の確認。 二つの異なる圧縮を受けた液体の集計、計算した表面張力が一定に維持されます。このような凝集体では2 /σをσ1の比は1に等しくなり、それぞれの連続圧縮（F 2 / F 1）に印加される力の比よりも小さくなります。対照的に、弾性骨材の計算された表面張力は、フックの法則に従うだろうし、加えられた力に比例して増加する。弾性骨材の場合は2 /σをσ1の比は1に等しくされませんが、代わりにF 2 / F 1の比率に近づいていきます。液体凝集体の表面張力は、集合のサイズ2,17の独立となります。表面張力が加えられた力と大きさの独立となっているだけの測定は、平均がそれぞれの細胞株でのσの計算に使用されます。 </li></ol> 3。代表的な結果： 下ラットの前立腺線維芽細胞（RPF）とラット前立腺平滑筋細胞（RPSMC）の集合体の典型的なTSTの結果の表です。図に見られるように。 RPFの細胞の7凝集体は22.8の表面張力± 1.1ダイン/ cmを持っている。また、圧縮1と後の圧縮2の後に測定された平均表面張力の値は、統計的にIDENTいた対応のあるt -検定によって比較してiCalの。我々はまた、彼らは同じように彼らは弾性固体として振る舞う場合は、これらの凝集体は、フックの法則に従うていないことを保証するために2 /σを1とF 2 / F 1、σの比を比較した。表1に示すように、2 /σをσ1の比は、実際に1.0をアプローチではありません。また、F 2 / F 1の比率はさらに、これらの凝集体は、フックの法則に従うと、実際に液体として動作しないことを確認、σ2 / 1（P &lt;0.05、t検定）σよりも有意に大きかった。コントラストRPSMCsではフックの法則は従った。表1で明らかなように、2 /σをσ1の比は1よりも有意に大きいとF 2 / F 1のそれよりも統計的に差はなかった。さらに液体のような挙動を示すために、我々は、表面張力（σ）と骨材量との関係を調査した。図に見られるように。 RPSMCs（青回帰直線、R 2 = 0.146）のボリューム上にシグマのいくつかの依存性があるように表示されるのに対し、8は、ボリュームは、RPFの細胞（赤回帰直線、R 2 = 0.002）のためにシグマとは無関係です。これらのデータは、さらにRPSMCsのものが弾性固体としてより多くの動作を行うように見えるのに対し、RPFの凝集は、液体のような方法で振る舞うことを確認してください。唯一の液体として振る舞うの集計から得られたものmesurementsは、表面張力を計算するために使用されます。 <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig1.jpg" alt="図1"/> 図1組織の表面張力計の概要。 <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig2.jpg" alt="図2"/> 図2。テンシオメータチャンバー（右パネル）のより詳細なビュー。 <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig3.jpg" alt="図3"/> 図3。テンシオメータチャンバーの模式図。 <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig4.jpg" alt="図4"/> 図4非圧縮（A）と圧縮（B）凝集体の画像。 <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig5.jpg" alt="図5"/> 図5。ラプラスの方程式。 <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig6.jpg" alt="図6"/> 図6。形状の平衡時のそれは不完全に付着する2つの平行平板間の圧縮液滴の図。 R 1及びR 2はそれぞれ、液滴の赤道でと対称軸を介して平面に、曲率の二つの主要半径です。 R 3は、どちらの圧縮板との接触の液滴の円形領域の半径である。 Hは、上部と下部圧縮板との間の距離である。 Xは、液滴の表面と圧迫板のいずれかの接点に伸びる2斜辺のRと直角三角形の一面です。 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 1（ダイン/ cm ± SEM）を、σ </td><td> σ2（ダイン/ cm ± SEM） </td><td> Pσ1対2、σ </td><td> 1,2（ダイン/ cm ± SEM）を、σ </td><td> σ2 /σ1 </td><td> F 2 / F 1 </td><td> 2 /σを1とF 2 F 1を Pσ </td></tr><tr><td> RPF </td><td> 22.6 ± 1.7 </td><td> 22.9 ± 1.4 </td><td> &gt; 0.05 * </td><td> 22.8 ± 1.1 </td><td> 1.04 ± 0.04 </td><td> 1.47 ± 0.06 </td><td> &lt;0.05 </td></tr><tr><td> RPSMC </td><td> 15.0 ± 2.8 </td><td> 23.0 ± 3.2 </td><td> 0.039 </td><td> NA </td><td> 1.9 ± 0.3 </td><td> 1.6 ± 0.1 </td><td> 0.16 * </td></tr></tbody></table> 図7。TSTの測定およびラットの前立腺線維芽細胞と平滑筋細胞の集合体の集合体流動性の確認。 <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig8.jpg" alt="図8"/> 図8。RPF（赤線）とRPSMCs（青線）の集合体のためのシグマとボリュームの関係。

<ol>
	<li>Foty, R. A., Forgacs, G., Pfleger, C. M., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+properties+of+embryonic+tissues:+Measurement+of+interfacial+tensions.">Liquid properties of embryonic tissues: Measurement of interfacial tensions.</a> Phys Rev Lett. 72, 2298-2301 (1994).</li><li>Foty, R. A., Pfleger, C. M., Forgacs, G., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+tensions+of+embryonic+tissues+predict+their+mutual+envelopment+behavior.">Surface tensions of embryonic tissues predict their mutual envelopment behavior.</a> Development. 122, 1611-1620 (1996).</li><li>Schotz, E. -. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha5beta1+integrin-fibronectin+interactions+specify+liquid+to+solid+phase+transition+of+3D+cellular+aggregates.">Alpha5beta1 integrin-fibronectin interactions specify liquid to solid phase transition of 3D cellular aggregates.</a> PLoS One. 5, e11830-e11830 (2010).</li><li>Foty, R. A., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+tumor+cell+cohesion+and+suppression+of+invasion+by+E-+or+P-cadherin.">Measurement of tumor cell cohesion and suppression of invasion by E- or P-cadherin.</a> Cancer Res. 57, 5033-5036 (1997).</li><li>Foty, R. A., Corbett, S. A., Schwarzbauer, J. E., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexamethasone+up-regulates+cadherin+expression+and+cohesion+of+HT-1080+human+fibrosarcoma+cells.">Dexamethasone up-regulates cadherin expression and cohesion of HT-1080 human fibrosarcoma cells.</a> Cancer Res. 58, 3586-3589 (1998).</li><li>Winters, B. S., Shepard, S. R., Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+measurement+of+brain+tumor+cohesion.">Biophysical measurement of brain tumor cohesion.</a> Int J Cancer. 114, 371-379 (2005).</li><li>Foty, R. A., Cummings, K. B., Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+surface+tensiometry:+a+novel+technique+for+predicting+invasive+potential+of+prostate+tumors+based+on+tumor+cell+aggregate+cohesivity+in+vitro.">Tissue surface tensiometry: a novel technique for predicting invasive potential of prostate tumors based on tumor cell aggregate cohesivity in vitro.</a> Surgical Forum L. , 707-708 (1999).</li><li>Folkman, J., Moscona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cell+shape+in+growth+control.">Role of cell shape in growth control.</a> Nature. 273, 345-349 (1978).</li><li>Foty, R. A., Forgacs, G., Pfleger, C. M., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+properties+of+embryonic+tissues:+Measurement+of+interfacial+tensions.">Liquid properties of embryonic tissues: Measurement of interfacial tensions.</a> Physical Review Letters. 72, 2298-2301 (1994).</li><li>Guevorkian, K., Colbert, M. J., Durth, M., Dufour, S., Brochard-Wyart, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspiration+of+biological+viscoelastic+drops.">Aspiration of biological viscoelastic drops.</a> Phys Rev Lett. 104, 218101-218101 (2010).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

TSTによって集計凝集を測定することは比較的簡単です。使用可能なTSTのデータを生成するために習得しなければならない重要なステップは、しかし、そこには、1）集合体は&quot;健康的&quot;でなければなりません。これは、凝集体形成が剥離する前に最適な合流点にある細胞で始まることを確認することで制御することができます。文化の集合体のサイズと時間は、集合内の壊死性コアの開?...

<ul><li>水浴/シェーカー（ニューブランズウィックサイエンティフィック、エジソン、ニュージャージー州） </li><li> 10ミリリットルの丸底フラスコ（Belco、ヴァインランド、ニュージャージー州） </li></ul>

measurement of aggregate cohesion by tissue surface tensiometry

細胞間結合エネルギーの厳密な測定は、平衡状態でのシステムの熱力学的原理に立脚した方法を用いて製造することができます。我々は特に細胞間相互作用の表面自由エネルギーを測定するために組織の表面張力測定（TST）を開発しました。 TSTの基礎となる生物物理学的な概念は、以前は次の詳細の1,2に記載されている。メソッドは、相互に凝集細胞は、振盪培養で維持した場合、自発的にクラスタにアセンブルするという観測に基づいています。時間が経つにつれて、これらのクラスタは、球を形成するために切り上げになります。この丸めアップの動作は、液体システムの動作特性を模倣しています。細胞間の結合エネルギーは、カスタム設計された組織の表面張力計で、平行平板間に球状凝集体を圧縮することによって測定されます。液滴の表面張力を測定するために使用したのと同じ数学的な方程式は、三次元組織のような球状の凝集体の表面張力を測定するために使用されます。液体の表面張力の携帯電話と同等の細胞間結合エネルギー、またはより一般的に、組織のcohesivityです。我々の研究室からこれまでの研究では、組織の表面張力（1）胚細胞の二つのグループは1-5、（2）強くできる生体材料6、（3）と相互作用する組織の能力に影響を与えることができるように相互作用する方法を予測することが示されているカドヘリンベースの細胞間の凝集7の直接操作して、だけでなく、FN 8-11と4などの主要なECM分子の操作によってのみ変更できます）肺癌12、線維肉腫13、脳腫瘍14と前立腺腫瘍の侵襲性と相関細胞株15。この記事では、集約の圧縮を開始する、と生成された組織の表面張力の測定値を分析し、検証するために、張力計室にスフェロイドをロードする装置、細部スフェロイドを生成するために必要な手順を、説明します。

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Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry

我々は、三次元組織のような凝集体中の細胞間、組織の表面張力として表現結合エネルギーを、測定する方法を説明します。組織の表面張力の違いは、肺、筋肉、脳の腫瘍の侵襲性と相関することが実証され、異なる種類の細胞間の空間関係を確立するための基本的な決定要因であるされています。

組織の表面張力測定ごとの集計凝集力の測定

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium.  We ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.5K ビュー.  UMDNJ-Robert Wood Johnson Medical School. 我々は、三次元組織のような凝集体中の細胞間、組織の表面張力として表現結合エネルギーを、測定する方法を説明します。組織の表面張力の違いは、肺、筋肉、脳の腫瘍の侵襲性と相関することが実証され、異なる種類の細胞間の空間関係を確立するための基本的な決定要因であるされています。

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Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

ナノ粒子トラッキング分析とハイスループットフローサイトメトリーによる高分子遺伝子デリバリーナノ粒子の評価

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

生物工学

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

3次元細胞培養のための自己申告足場

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Preparation of Light-responsive Membranes by a Combined Surface Grafting and Postmodification Process

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is presented. The polymerization from the membrane surface is induced by plasma treatment of the membrane, followed by reacting the membrane surface with a methanolic solution of 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA). Special attention is given to the process parameters for the plasma treatment prior to the polymerization on the surface. For example, the influence of the plasma-treatment on different types of membranes (e.g.&#160;polyester, polycarbonate, polyvinylidene fluoride) is studied. Furthermore, the time-dependent stability of the surface-grafted membranes is shown by contact angle measurements. When grafting poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA) in this way, the surface can be further modified by esterification of the alcohol moiety of the polymer with a carboxylic acid function of the desired substance. These reactions can therefore be used for the functionalization of the membrane surface. For example, the surface tension of the membrane can be changed or a desired functionality as the presented light-responsiveness can be inserted. This is demonstrated by reacting PHEMA with a carboxylic acid functionalized spirobenzopyran unit which leads to a light-responsive membrane. The choice of solvent plays a major role in the postmodification step and is discussed in more detail in this paper. The permeability measurements of such functionalized membranes are performed using a Franz cell with an external light source. By changing the wavelength of the light from the visible to the UV-range, a change of permeability of aqueous caffeine solutions is observed.

A plasma-induced polymerization procedure is described for the surface-initiated polymerization on polymer membranes. Further postmodification of the grafted polymer with photochromic substances is presented with a protocol of conducting permeability measurements of light-responsive membranes.

複合表面グラフトと後置修飾法による光応答膜の調製

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. Kelvin probe force microscopy (KPFM) is a module of atomic force microscopy (AFM) that measures the contact potential difference between surfaces at the nano-scale. The combination of KPFM with AFM allows for the simultaneous generation of surface potential and topographical maps of biological samples such as bacterial cells. Here, we employ KPFM to examine the effects of surface potential on microbial adhesion to medically relevant surfaces such as stainless steel and gold. Surface potential maps revealed differences in surface potential for microbial membranes on different material substrates. A step-height graph was generated to show the difference in surface potential at a boundary area between the substrate surface and microorganisms. Changes in cellular membrane surface potential have been linked with changes in cellular metabolism and motility. Therefore, KPFM represents a powerful tool that can be utilized to examine the changes of microbial membrane surface potential upon adhesion to various substrate surfaces. In this study, we demonstrate the procedure to characterize the surface potential of individual methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA100 cells on stainless steel and gold using KPFM.

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

ケルビンプローブフォース顕微鏡を用いて細菌の表面電位測定

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of exosomes to determine if they carry disease discriminatory biomarkers. For performing exosomal analysis, it is necessary to develop a method for extracting and analyzing exosomes from target biofluids without damaging the internal content.
Electric field-induced release and measurement (EFIRM) is a method for specifically extracting exosomes from biofluids, unloading their cargo, and testing their internal RNA/protein content. Using an anti-human CD63 specific antibody magnetic microparticle, exosomes are first precipitated from biofluids. Following extraction, low-voltage electric cyclic square waves (CSW) are applied to disrupt the vesicular membrane and cause cargo unloading. The content of the exosome is hybridized to DNA primers or antibodies immobilized on an electrode surface for quantification of molecular content.
The EFIRM method is advantageous for extraction of exosomes and unloading cargo for analysis without lysis buffer. This method is capable of performing specific detection of both RNA and protein biomarker targets in the exosome. EFIRM extracts exosomes specifically based on their surface markers as opposed to size-based techniques.
Transmission electron microscopy (TEM) and assay demonstrate the functionality of the method for exosome capture and analysis. The EFIRM method was applied to exosomal analysis of 9 mice injected with human lung cancer H640 cells (a cell line transfected to express the exosome marker human CD63-GFP) in order to test their exosome profile against 11 mice receiving saline controls. Elevated levels of exosomal biomarkers (reference gene GAPDH and protein surface marker human CD63-GFP) were found for the H640 injected mice in both serum and saliva samples. Furthermore, saliva and serum samples were demonstrated to have linearity (R = 0.79). These results are suggestive for the viability of salivary exosome biomarkers for detection of distal diseases.

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement EFIRM

Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.

電界誘起リリースおよび測定によるエキソソームのバイオマーカーの検出（EFIRM）

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of ...

Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. Single muscle fiber studies are useful in both basic science and clinical studies. For basic studies, single muscle fiber contractility measurements allow investigation of fundamental mechanisms of force production, and analysis of muscle function in the context of genetic manipulations. Clinically, single muscle fiber studies provide useful insight into the impact of injury and disease on muscle function, and may be used to guide the understanding of muscular pathologies. In this video article we outline the steps required to prepare and isolate an individual skeletal muscle fiber segment, attach it to force-measuring apparatus, activate it to produce maximum isometric force, and estimate its cross-sectional area for the purpose of normalizing the force produced.

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. In this article we outline a valid and reliable technique to prepare and test permeabilized skeletal muscle fibers in vitro.

透過性に骨格筋線維によって生成される最大等尺性力の測定

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to intrinsic parameters within the process allow a high degree of control over scaffold characteristics including fiber diameter, alignment and porosity. By developing scaffolds with similar dimensions and topographies to organ- or tissue-specific extracellular matrices (ECM), micro-environments representative to those that cells are exposed to in situ can be created. 
The airway bronchiole wall, comprised of three main micro-environments, was selected as a model tissue. Using decellularized airway ECM as a guide, we electrospun the non-degradable polymer, polyethylene terephthalate (PET), by three different protocols to produce three individual electrospun scaffolds optimized for epithelial, fibroblast or smooth muscle cell-culture. Using a commercially available bioreactor system, we stably co-cultured the three cell-types to provide an in vitro model of the airway wall over an extended time period.
This model highlights the potential for such methods being employed in in vitro diagnostic studies investigating important inter-cellular cross-talk mechanisms or assessing novel pharmaceutical targets, by providing a relevant platform to allow the culture of fully differentiated adult cells within 3D, tissue-specific environments.

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall.

三層のための3つのユニークな環境を提供するために、エレクトロスピニング法を適応させます<em&gt;インビトロ</em&gt;気道壁のモデル

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

中に組み込み血管新生による組織工学<em&gt;インビボ</em&gt;ティッシュ・エンジニアリング商工会議所

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Site-Directed Immobilization of Bone Morphogenetic Protein 2 to Solid Surfaces by Click Chemistry

Different therapeutic strategies for the treatment of non-healing long bone defects have been intensively investigated. Currently used treatments present several limitations that have led to the use of biomaterials in combination with osteogenic growth factors, such as bone morphogenetic proteins (BMPs). Commonly used absorption or encapsulation methods require supra-physiological amounts of BMP2, typically resulting in a so-called initial burst release effect that provokes several severe adverse side effects. A possible strategy to overcome these problems would be to covalently couple the protein to the scaffold. Moreover, coupling should be performed in a site-specific manner in order to guarantee a reproducible product outcome. Therefore, we created a BMP2 variant, in which an artificial amino acid (propargyl-L-lysine) was introduced into the mature part of the BMP2 protein by codon usage expansion (BMP2-K3Plk). BMP2-K3Plk was coupled to functionalized beads through copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC). The biological activity of the coupled BMP2-K3Plk was proven in vitro and the osteogenic activity of the BMP2-K3Plk-functionalized beads was proven in cell based assays. The functionalized beads in contact with C2C12 cells were able to induce alkaline phosphatase (ALP) expression in locally restricted proximity of the bead. Thus, by this technique, functionalized scaffolds can be produced that can trigger cell differentiation towards an osteogenic lineage. Additionally, lower BMP2 doses are sufficient due to the controlled orientation of site-directed coupled BMP2. With this method, BMPs are always exposed to their receptors on the cell surface in the appropriate orientation, which is not the case if the factors are coupled via non-site-directed coupling techniques. The product outcome is highly controllable and, thus, results in materials with homogeneous properties, improving their applicability for the repair of critical size bone defects.

Biomaterials doped with Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP2) have been used as a new therapeutic strategy to heal non-union bone fractures. To overcome side effects resulting from an uncontrollable release of the factor, we propose a new strategy to site-directly immobilize the factor, thus creating materials with improved osteogenic capabilities.

骨形成タンパク質 2 固体表面にクリックケミストリーによるサイト向け固定

Different therapeutic strategies for the treatment of non-healing long bone defects have been intensively investigated. Currently used treatments present ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.