1. La préparation globale pour la mesure de la tension de surface des tissus. Pour les cellules adhérentes, sphéroïdes peuvent être formées en utilisant soit la méthode goutte suspendue ou en générant une feuille cohérente de cellules qui peuvent ensuite être découpé en fragments 1 mm. La formation d&#39;agrégats par la méthode de goutte pendante: <ol><li> Proche-confluentes cultures de cellules adhérentes doivent être cultivés à 90% de confluence, les monocouches quoi doivent être rincés deux fois avec du PBS. Après la vidange bien, ajoutez 2 ml (pour les plaques de 100 mm) de 0,05% de trypsine-1 mM EDTA, et incuber à 37 ° C jusqu&#39;à ce que les cellules se détacher. Arrêtez trypsinisation en ajoutant 2 ml de milieu complet et doucement l&#39;utilisation d&#39;une pipette 5 ml de triturer le mélange jusqu&#39;à cellules sont en suspension. Transfert des cellules dans un tube de 15 ml conique. </li><li> Ajouter 40 ul d&#39;une 10 mg / ml solution stock DNAse et incuber pendant 5 minutes à température ambiante. Brièvement au vortex et centrifuger à 200 xg pendant 5 minutes. </li><li> Rejeter le surnageant et laver culot avec 1 ml de culture de tissus milieu complet. Répéter, puis remettre les cellules en 2 ml de milieu de culture de tissu complet. </li><li> Compter les cellules en utilisant un hématimètre, ou un compteur de cellules automatisé et d&#39;ajuster la concentration de 2,5 x 10 6 cellules / ml. </li><li> Retirez le couvercle d&#39;une boîte de culture de tissu de 60 mm et placer 5 ml de PBS dans le fond du plat. Ceci agira comme une chambre de l&#39;hydratation. </li><li> Inverser le couvercle et l&#39;utilisation d&#39;une pipette 20 ul de déposer 10 gouttes ul sur le fond du couvercle. Assurez-vous que des gouttes sont placées suffisamment éloignés afin de ne pas toucher. Il est possible de placer au moins 20 gouttes par plat. </li><li> Inverser le couvercle sur le PBS-remplie chambre inférieure et incuber à 37 ° C CO / 5% 2 / 95% d&#39;humidité, de surveiller l&#39;gouttes par jour et incuber jusqu&#39;au feuilles cellule soit ou agrégats sont formés. </li><li> Une fois la forme des feuilles, ils peuvent être transférés à fond rond en verre Agitateur flacons contenant 3 ml de milieu complet et incubés dans un bain d&#39;eau agité à 37 ° C et 5% de CO 2 jusqu&#39;à la formation de sphéroïdes. </li></ol> La formation d&#39;agrégats par la méthode feuille de cellules: <ol start="9"><li> Suspensions cellulaires simples sont préparés comme décrit ci-dessus, mais la concentration est ajustée à 1x10 6 cellules / ml. </li><li> Transfert de 3 ml de la suspension cellulaire à 10 ml ballons à fond rond (Belco, Vineland, NJ). </li><li> Incuber fioles dans un bain d&#39;eau giratoire / agitateur (New Brunswick Scientific, Edison, NJ) à 37 ° C, 5% de CO 2 de 4h à 120 rpm jusqu&#39;à cellules récupérer trypsinisation. </li><li> Transfert des cellules à un tube à centrifuger en verre à fond rond et centrifuger à 200 xg dans une fine granulés. Incuber pendant 24 h un autre jusqu&#39;à ce qu&#39;une feuille de formes cohérentes. </li><li> Remuer doucement le tube de culture pour déloger la plaque et versez le contenu du tube de culture dans un petit plat en verre de culture stérile tissus. </li><li> Utilisez scalpels micro pour couper les feuilles en fragments de tailles différentes. </li><li> Incuber fragments à 37 ° C sur l&#39;agitateur giratoire bain-marie à 120 rpm de moins de 5% de CO 2 pendant 2 à 3 jours ou jusqu&#39;à ce qu&#39;ils deviennent sphériques. </li></ol> 2. Mesure de la tension de surface totale <ol><li> Le tensiomètre surface du tissu. L&#39;appareil est représenté dans les figures. 1 et 2. La cellule de compression (Fig. 3) est composé de deux chambres. La chambre extérieure (CO) est relié à une pompe à 37 ° C l&#39;eau circule, et sert à réguler la température de la chambre intérieure (IC). Les chambres sont construites en Delrin broyé et comportent des fenêtres en quartz pour la visualisation de l&#39;agrégat. Le montage inférieure (LA) vis dans la base de la chambre intérieure et est utilisé pour 1) la position de l&#39;agrégat dans la chambre intérieure; 2) sceller le fond de la chambre intérieure; 3) d&#39;élever l&#39;agrégat de lancer la compression, et (4 ) contrôle la distance entre les plaques parallèles et donc la compression de l&#39;agrégat. Le noyau central (CC) de l&#39;assemblage est réglable. La pointe du noyau central (le piédestal) est composée de lisses en Teflon et agit comme la plaque de compression plus faible (LCP). La plaque de compression supérieur (UCP) est un cylindre en téflon 15mm de long qui pend au bras d&#39;équilibre (B) par une flamme redressé nickel-chrome métallique (NCW) *. Au cours d&#39;une expérience, l&#39;agrégat de cellules (A) est positionné sur la plaque inférieure et soulevé jusqu&#39;à ce qu&#39;il touche la plaque supérieure. Le plateau supérieur est relié au bras de la balance (B). La compression de l&#39;ensemble provoque un déplacement du balancier. L&#39;équilibre est un Électrobalance Cahn / Ventron modèle d&#39;enregistrement 2000, qui fonctionne sur le principe de l&#39;équilibre nulle. Le pivot du bras de la balance a une armature dans un champ magnétique permanent. Lorsque la balance est en marche, il module en permanence le courant passant par l&#39;assemblage électromagnétique, qui permet de maintenir l&#39;équilibre du bras en position horizontale. Quand un objet est suspendu au bras de l&#39;équilibre, la tension, dont le solde s&#39;applique à maintenir le bras dans le Horizoposition de NTAL, est proportionnelle à peser l&#39;objet. Cette tension mesure la force extérieure de compression appliquée à l&#39;agrégat. La forme de l&#39;agrégat est contrôlée par l&#39;observation visuelle à travers un stéréoscope 25 x Nikon SMZ10A couplé à un ordinateur équipé d&#39;une carte d&#39;acquisition. Afin de minimiser l&#39;adhérence des agrégats de cellules sur les plaques de compression, à la fois les plaques de compression inférieure et supérieure ont été recouvertes de poly (2-hydroxyéthylméthacrylate) {poly (HEMA)}, un matériau polymère à laquelle les cellules n&#39;adhèrent pas 16. * Le fil est-flammes redressé par pendaison d&#39;une longueur de 15 pouces de fil à partir d&#39;un statif et une pince de serrage liant petite à la fin. Un bec Bunsen est alors monter et descendre la longueur du fil jusqu&#39;à ce que le fil est rouge. Le fil redressé peut alors être coupé dans la longueur appropriée. Un petit crochet est formé par la flexion du fil d&#39;environ ¼ de pouce de la fin en utilisant deux lames de rasoir. L&#39;autre extrémité est ensuite insérée dans le canon de la plaque de compression plus faible. </li><li> La compression globale. <ol><li> La chambre intérieure est remplie de pré-chauffé en CO 2 indépendante milieu de culture tissulaire (Gibco / BRL, NY). </li><li> Granulats une taille allant de environ 200-300 μ sont positionnés sur la plaque de compression plus faible (figure 4A). Les agrégats sont chargés par l&#39;aspiration d&#39;un agrégat en milieu de culture tissulaire à mi-hauteur de la pointe d&#39;une pipette Pasteur munie d&#39;une ampoule de silicone, le transfert de la pipette à la chambre intérieure, et le positionnement de la pointe de la pipette au-dessus du PAFR. L&#39;agrégat est alors doucement expulsés sur le LCP en pressant doucement l&#39;ampoule. Alternativement, l&#39;agrégat est autorisé à tomber par gravité sur la LCP. </li><li> La plaque de compression supérieur (UCP) est positionné au-dessus du total et a permis de régler, en établissant un pré-compression de base apparente de poids UCP. </li><li> Le LCP est alors soulevé jusqu&#39;à ce que l&#39;agrégat est comprimé contre l&#39;UCP (figure 4B). Réglage de la hauteur de l&#39;âme intérieure de l&#39;appareil sera inférieure de contrôle différents degrés de compression. La compression est contrôlée par l&#39;observation à travers un microscope à dissection équipé d&#39;une caméra vidéo CCD. </li><li> Des images globales sont capturés, numérisés et analysés à l&#39;aide d&#39;ImageJ. Changement de poids apparente UCP est enregistrée en continu sur un enregistreur à bande, la réalisation de l&#39;équilibre de forme étant désigné par le tassement de la production de tension de l&#39;équilibre Cahn. Chaque agrégat est soumis à deux degrés différents de compression. </li></ol></li><li> Calcul de la tension de surface totale. A l&#39;équilibre la forme, la cohésivité d&#39;un agrégat de cellules comprimées entre des plaques parallèles à laquelle il n&#39;adhère pas peut être obtenu à partir de l&#39;équation de Young-Laplace (fig. 5), où σ est cohésivité, F est la force qui agit pour compresser l&#39;agrégat , πr 3 2 est l&#39;aire de la surface de l&#39;agrégat sur ​​lequel s&#39;exerce la force F, et R 2 et R 3 sont, respectivement, le rayon de l&#39;équateur de l&#39;agrégat comprimé et le rayon d&#39;un arc de définir son profil de surface normale à la compression des plaques et s&#39;étendant entre eux (fig. 6). Mesure de la force de compression et de la géométrie à la force et l&#39;équilibre de forme et l&#39;application de ces mesures à l&#39;équation de Young-Laplace génère des valeurs numériques de la tension des tissus de surface apparente. Après avoir atteint l&#39;équilibre et le calcul de σ 1, les agrégats sont décompressées et a permis d&#39;aborder un second équilibre et de σ 2 est calculé comme décrit ci-dessus. </li><li> Confirmation de la liquidité globale. La tension de surface calculée d&#39;un agrégat liquide, lorsqu&#39;il est soumis à deux compressions différents restera constante. Dans ces agrégats du rapport de σ 2 / σ 1 sera égal à 1 et sera inférieur au ratio de la force appliquée à chaque compression successives (F 2 / F 1). En revanche, la tension de surface calculée d&#39;un agrégat élastique obéir à la loi de Hooke et d&#39;augmenter proportionnellement à la force appliquée. Pour les agrégats élastiques le ratio de σ 2 / σ 1 ne sera pas égal à 1, mais sera plutôt l&#39;approche du ratio de F 2 / F 1. La tension de surface d&#39;agrégats liquides sera également indépendant de la taille des agrégats 2,17. Seules des mesures dans laquelle la tension de surface est indépendante de la force appliquée et la taille sont utilisés pour calculer σ moyenne pour chaque lignée cellulaire. </li></ol> 3. Les résultats représentatifs: Voici un tableau des résultats du TCT typique pour des agrégats de fibroblastes prostate de rat (FPR) et le rat des cellules musculaires lisses de la prostate (RPSMC). Comme on peut le voir dans la Fig. 7 des agrégats de cellules du FPR ont une tension superficielle de 22,8 ± 1,1 dynes / cm. Par ailleurs, les valeurs moyennes tension de surface mesurée après compression 1 et 2 après compression étaient statistiquement identiCal lorsque comparés par un t-test apparié. Nous avons également comparé les ratios de σ 2 / σ 1 et F 2 / F 1 pour s&#39;assurer que ces agrégats ne pas obéir à la loi de Hooke, comme ils le feraient si elles se comportaient comme des solides élastiques. Comme l&#39;a démontré dans le tableau 1, le ratio de σ 2 / σ une approche en effet de 1,0. Par ailleurs, le ratio de F 2 / F 1 a été significativement plus importante que σ 2 / σ 1 (t-test apparié, p &lt;0,05), confirmant que ces agrégats ne pas obéir à la loi de Hooke et en fait se comporter comme des liquides. En revanche RPSMCs obéi loi de Hooke. Comme on le voit dans le tableau 1, le ratio de σ 2 / σ 1 est significativement supérieure à 1 et n&#39;était pas statistiquement différente de celle de F 2 / F 1. Pour démontrer davantage de liquide comme le comportement, nous avons exploré la relation entre la tension superficielle (σ) et au volume global. Comme on peut le voir dans la Fig. 8, le volume est indépendant de sigma pour les cellules du FPR (droite de régression rouge, r 2 = 0,002), alors qu&#39;il semble y avoir une certaine dépendance de sigma sur le volume pour RPSMCs (droite de régression bleu, r 2 = 0,146). Ces données confirment en outre que les agrégats du FPR se comporter de manière liquide comme, alors que ceux de RPSMCs semblent se comporter davantage comme des solides élastiques. Seuls ceux obtenus à partir de mensurations agrégats se comporter comme des liquides serait utilisée pour calculer la tension de surface. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Aperçu du tensiomètre surface du tissu. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Une vue plus détaillée de la chambre de tensiomètre (à droite). <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. Vue schématique de la chambre de tensiomètre. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig4.jpg" alt="Figure 4"/> Figure 4. Images de non-compressé (A) et compressés (B) des agrégats. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig5.jpg" alt="Figure 5"/> Figure 5. L&#39;équation de Laplace. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig6.jpg" alt="Figure 6"/> Figure 6. Schéma d&#39;une gouttelette liquide comprimé entre deux plaques parallèles à laquelle il adhère mal, à l&#39;équilibre forme. R 1 et R 2 sont les deux rayons de courbure principaux, à l&#39;équateur de la goutte et dans un plan passant par son axe de symétrie, respectivement. R 3 est le rayon de la gouttelette zone circulaire de contact avec la plaque de compression soit. H est la distance entre les plaques de compression supérieurs et inférieurs. X est un côté d&#39;un triangle rectangle avec R hypoténuse 2 s&#39;étendant à un point de contact entre la surface de la goutte et la plaque de compression soit. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> σ 1 (dynes / cm ± SEM) </td><td> σ 2 (dynes / cm ± SEM) </td><td> Pσ 1 vs 2 σ </td><td> σ 1,2 (dynes / cm ± SEM) </td><td> σ 2 / σ 1 </td><td> F 2 / F 1 </td><td> Pσ 2 / σ 1 et F 2 F 1 </td></tr><tr><td> FPR </td><td> 22,6 ± 1,7 </td><td> 22,9 ± 1,4 </td><td> &gt; 0,05 * </td><td> 22,8 ± 1,1 </td><td> 1,04 ± 0,04 </td><td> 1,47 ± 0,06 </td><td> &lt;0,05 </td></tr><tr><td> RPSMC </td><td> 15,0 ± 2,8 </td><td> 23,0 ± 3,2 </td><td> 0,039 </td><td> NA </td><td> 1,9 ± 0,3 </td><td> 1,6 ± 0,1 </td><td> 0,16 * </td></tr></tbody></table> Figure 7. Mesures TCT et la confirmation de la liquidité globale pour les agrégats de fibroblastes de la prostate de rat et les cellules musculaires lisses. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig8.jpg" alt="Figure 8"/> Figure 8. Relation entre sigma et le volume des agrégats du FPR (ligne rouge) et RPSMCs (ligne bleue).

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	<li>Foty, R. A., Forgacs, G., Pfleger, C. M., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+properties+of+embryonic+tissues:+Measurement+of+interfacial+tensions.">Liquid properties of embryonic tissues: Measurement of interfacial tensions.</a> Phys Rev Lett. 72, 2298-2301 (1994).</li><li>Foty, R. A., Pfleger, C. M., Forgacs, G., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+tensions+of+embryonic+tissues+predict+their+mutual+envelopment+behavior.">Surface tensions of embryonic tissues predict their mutual envelopment behavior.</a> Development. 122, 1611-1620 (1996).</li><li>Schotz, E. -. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+properties+of+embryonic+tissues:+Measurement+of+interfacial+tensions.">Liquid properties of embryonic tissues: Measurement of interfacial tensions.</a> Physical Review Letters. 72, 2298-2301 (1994).</li><li>Guevorkian, K., Colbert, M. J., Durth, M., Dufour, S., Brochard-Wyart, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspiration+of+biological+viscoelastic+drops.">Aspiration of biological viscoelastic drops.</a> Phys Rev Lett. 104, 218101-218101 (2010).</li></ol>

Mesure de la cohésion globale par TST est relativement simple. Il ya, cependant, les principales étapes qui doivent être maîtrisées afin de générer des données utilisables TST; 1) les agrégats doivent être &quot;saine&quot;. Ceci peut être contrôlé en assurant que la formation d&#39;agrégats commence avec les cellules qui sont à confluence optimale avant de détachement. La taille des agrégats et du temps dans la culture doit également être contrôlé pour minimiser le développement d&#39;un noyau né...

<ul><li> l&#39;eau du bain / agitateur (New Brunswick Scientific, Edison, NJ) </li><li> 10 ml ballons à fond rond (Belco, Vineland, NJ) </li></ul>

measurement of aggregate cohesion by tissue surface tensiometry

Mesure rigoureuse d&#39;énergie de liaison intercellulaire ne peut être faite en utilisant des méthodes fondées sur des principes thermodynamiques dans les systèmes à l&#39;équilibre. Nous avons développé tensiométrie surface du tissu (TST) spécifiquement pour mesurer l&#39;énergie libre de surface d&#39;interaction entre les cellules. Les concepts sous-jacents biophysiques TCT ont été décrits précédemment dans 1,2 détail. La méthode est basée sur l&#39;observation que les cellules mutuellement cohérente, si elle est maintenue en secouant la culture, sera s&#39;assemblent spontanément en clusters. Au fil du temps, ces grappes rondes jusqu&#39;à former des sphères. Ce comportement rafles imite le comportement caractéristique des systèmes liquide. Intercellulaire énergie de liaison est mesurée par la compression des agrégats sphériques entre les plaques parallèles dans un tensiomètre conçu sur mesure tissu de surface. La même équation mathématique utilisé pour mesurer la tension de surface d&#39;une gouttelette liquide est utilisé pour mesurer la tension de surface de la 3D des tissus tels que des agrégats sphériques. L&#39;équivalent cellulaire de la tension de surface liquide est l&#39;énergie de liaison intercellulaire, ou plus généralement cohésivité tissus,. Des études antérieures de notre laboratoire ont montré que la tension de surface du tissu (1) prédit comment deux groupes de cellules embryonnaires va interagir avec un autre 1-5, (2) peut fortement influencer la capacité des tissus à interagir avec des biomatériaux 6, (3) peut être modifié non seulement par la manipulation directe de la cadhérine-7 basée cohésion intercellulaire, mais aussi par la manipulation de molécules d&#39;ECM clés tels que FN 8-11 et 4) est en corrélation avec le potentiel invasif du cancer du poumon 12, fibrosarcome 13, 14 tumeur au cerveau et tumeur de la prostate lignées cellulaires 15. Dans cet article nous allons décrire l&#39;appareil, le détail les étapes nécessaires pour générer des sphéroïdes, de charger les sphéroïdes dans la chambre de tensiomètre, d&#39;initier une compression globale, et pour analyser et valider les mesures de tension superficielle des tissus générés.

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Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry

Nous décrivons une méthode de mesure de l&#39;énergie de liaison, exprimable que la tension de surface des tissus, entre les cellules dans les tissus 3D-comme agrégats. Les différences de tension de surface de tissu ont été démontrés à corréler avec envahissement des poumons, les muscles et les tumeurs du cerveau, et sont des déterminants fondamentaux de l&#39;établissement de relations spatiales entre les différents types cellulaires.

Mesure de la cohésion globale par tensiométrie surface du tissu

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium.  We ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.5K vues.  UMDNJ-Robert Wood Johnson Medical School. Nous décrivons une méthode de mesure de l'énergie de liaison, exprimable que la tension de surface des tissus, entre les cellules dans les tissus 3D-comme agrégats. Les différences de tension de surface de tissu ont été démontrés à corréler avec envahissement des poumons, les muscles et les tumeurs du cerveau, et sont des déterminants fondamentaux de l'établissement de relations spatiales entre les différents types cellulaires.

Vidéo: Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

Évaluation de livraison Gene polymère nanoparticules d&#39;analyse de suivi par des nanoparticules et de cytométrie en flux à haut débit

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Recherche

Bio-ingénierie

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Les échafaudages auto-déclaration pour les 3-Dimensional Culture cellulaire

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Preparation of Light-responsive Membranes by a Combined Surface Grafting and Postmodification Process

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is presented. The polymerization from the membrane surface is induced by plasma treatment of the membrane, followed by reacting the membrane surface with a methanolic solution of 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA). Special attention is given to the process parameters for the plasma treatment prior to the polymerization on the surface. For example, the influence of the plasma-treatment on different types of membranes (e.g.&#160;polyester, polycarbonate, polyvinylidene fluoride) is studied. Furthermore, the time-dependent stability of the surface-grafted membranes is shown by contact angle measurements. When grafting poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA) in this way, the surface can be further modified by esterification of the alcohol moiety of the polymer with a carboxylic acid function of the desired substance. These reactions can therefore be used for the functionalization of the membrane surface. For example, the surface tension of the membrane can be changed or a desired functionality as the presented light-responsiveness can be inserted. This is demonstrated by reacting PHEMA with a carboxylic acid functionalized spirobenzopyran unit which leads to a light-responsive membrane. The choice of solvent plays a major role in the postmodification step and is discussed in more detail in this paper. The permeability measurements of such functionalized membranes are performed using a Franz cell with an external light source. By changing the wavelength of the light from the visible to the UV-range, a change of permeability of aqueous caffeine solutions is observed.

A plasma-induced polymerization procedure is described for the surface-initiated polymerization on polymer membranes. Further postmodification of the grafted polymer with photochromic substances is presented with a protocol of conducting permeability measurements of light-responsive membranes.

Préparation des membranes sensibles à la lumière par une greffe de surface combiné et processus Modification ultérieure

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. Kelvin probe force microscopy (KPFM) is a module of atomic force microscopy (AFM) that measures the contact potential difference between surfaces at the nano-scale. The combination of KPFM with AFM allows for the simultaneous generation of surface potential and topographical maps of biological samples such as bacterial cells. Here, we employ KPFM to examine the effects of surface potential on microbial adhesion to medically relevant surfaces such as stainless steel and gold. Surface potential maps revealed differences in surface potential for microbial membranes on different material substrates. A step-height graph was generated to show the difference in surface potential at a boundary area between the substrate surface and microorganisms. Changes in cellular membrane surface potential have been linked with changes in cellular metabolism and motility. Therefore, KPFM represents a powerful tool that can be utilized to examine the changes of microbial membrane surface potential upon adhesion to various substrate surfaces. In this study, we demonstrate the procedure to characterize the surface potential of individual methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA100 cells on stainless steel and gold using KPFM.

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Surface de mesure potentielle de bactéries utilisant Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of exosomes to determine if they carry disease discriminatory biomarkers. For performing exosomal analysis, it is necessary to develop a method for extracting and analyzing exosomes from target biofluids without damaging the internal content.
Electric field-induced release and measurement (EFIRM) is a method for specifically extracting exosomes from biofluids, unloading their cargo, and testing their internal RNA/protein content. Using an anti-human CD63 specific antibody magnetic microparticle, exosomes are first precipitated from biofluids. Following extraction, low-voltage electric cyclic square waves (CSW) are applied to disrupt the vesicular membrane and cause cargo unloading. The content of the exosome is hybridized to DNA primers or antibodies immobilized on an electrode surface for quantification of molecular content.
The EFIRM method is advantageous for extraction of exosomes and unloading cargo for analysis without lysis buffer. This method is capable of performing specific detection of both RNA and protein biomarker targets in the exosome. EFIRM extracts exosomes specifically based on their surface markers as opposed to size-based techniques.
Transmission electron microscopy (TEM) and assay demonstrate the functionality of the method for exosome capture and analysis. The EFIRM method was applied to exosomal analysis of 9 mice injected with human lung cancer H640 cells (a cell line transfected to express the exosome marker human CD63-GFP) in order to test their exosome profile against 11 mice receiving saline controls. Elevated levels of exosomal biomarkers (reference gene GAPDH and protein surface marker human CD63-GFP) were found for the H640 injected mice in both serum and saliva samples. Furthermore, saliva and serum samples were demonstrated to have linearity (R = 0.79). These results are suggestive for the viability of salivary exosome biomarkers for detection of distal diseases.

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement EFIRM

Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.

Détection de biomarqueurs exosomales par déclenchement électrique induite par champ et évaluation (EFIRM)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of ...

Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. Single muscle fiber studies are useful in both basic science and clinical studies. For basic studies, single muscle fiber contractility measurements allow investigation of fundamental mechanisms of force production, and analysis of muscle function in the context of genetic manipulations. Clinically, single muscle fiber studies provide useful insight into the impact of injury and disease on muscle function, and may be used to guide the understanding of muscular pathologies. In this video article we outline the steps required to prepare and isolate an individual skeletal muscle fiber segment, attach it to force-measuring apparatus, activate it to produce maximum isometric force, and estimate its cross-sectional area for the purpose of normalizing the force produced.

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. In this article we outline a valid and reliable technique to prepare and test permeabilized skeletal muscle fibers in vitro.

Mesure de la force maximale isométrique généré par perméabilisées fibres du muscle squelettique

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to intrinsic parameters within the process allow a high degree of control over scaffold characteristics including fiber diameter, alignment and porosity. By developing scaffolds with similar dimensions and topographies to organ- or tissue-specific extracellular matrices (ECM), micro-environments representative to those that cells are exposed to in situ can be created. 
The airway bronchiole wall, comprised of three main micro-environments, was selected as a model tissue. Using decellularized airway ECM as a guide, we electrospun the non-degradable polymer, polyethylene terephthalate (PET), by three different protocols to produce three individual electrospun scaffolds optimized for epithelial, fibroblast or smooth muscle cell-culture. Using a commercially available bioreactor system, we stably co-cultured the three cell-types to provide an in vitro model of the airway wall over an extended time period.
This model highlights the potential for such methods being employed in in vitro diagnostic studies investigating important inter-cellular cross-talk mechanisms or assessing novel pharmaceutical targets, by providing a relevant platform to allow the culture of fully differentiated adult cells within 3D, tissue-specific environments.

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall.

Adapter le processus Électrofilage de fournir trois environnements uniques pour un Tri-couches<em&gt; In Vitro</em&gt; Modèle du mur Airway

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Génie tissulaire par Intrinsic vascularisation dans un<em&gt; In Vivo</em&gt; Tissue Chambre Ingénierie

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Site-Directed Immobilization of Bone Morphogenetic Protein 2 to Solid Surfaces by Click Chemistry

Different therapeutic strategies for the treatment of non-healing long bone defects have been intensively investigated. Currently used treatments present several limitations that have led to the use of biomaterials in combination with osteogenic growth factors, such as bone morphogenetic proteins (BMPs). Commonly used absorption or encapsulation methods require supra-physiological amounts of BMP2, typically resulting in a so-called initial burst release effect that provokes several severe adverse side effects. A possible strategy to overcome these problems would be to covalently couple the protein to the scaffold. Moreover, coupling should be performed in a site-specific manner in order to guarantee a reproducible product outcome. Therefore, we created a BMP2 variant, in which an artificial amino acid (propargyl-L-lysine) was introduced into the mature part of the BMP2 protein by codon usage expansion (BMP2-K3Plk). BMP2-K3Plk was coupled to functionalized beads through copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC). The biological activity of the coupled BMP2-K3Plk was proven in vitro and the osteogenic activity of the BMP2-K3Plk-functionalized beads was proven in cell based assays. The functionalized beads in contact with C2C12 cells were able to induce alkaline phosphatase (ALP) expression in locally restricted proximity of the bead. Thus, by this technique, functionalized scaffolds can be produced that can trigger cell differentiation towards an osteogenic lineage. Additionally, lower BMP2 doses are sufficient due to the controlled orientation of site-directed coupled BMP2. With this method, BMPs are always exposed to their receptors on the cell surface in the appropriate orientation, which is not the case if the factors are coupled via non-site-directed coupling techniques. The product outcome is highly controllable and, thus, results in materials with homogeneous properties, improving their applicability for the repair of critical size bone defects.

Biomaterials doped with Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP2) have been used as a new therapeutic strategy to heal non-union bone fractures. To overcome side effects resulting from an uncontrollable release of the factor, we propose a new strategy to site-directly immobilize the factor, thus creating materials with improved osteogenic capabilities.

Immobilisation dirigée de protéine morphogénétique osseuse 2 aux Surfaces solides par Click Chemistry

Different therapeutic strategies for the treatment of non-healing long bone defects have been intensively investigated. Currently used treatments present ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.