1. Agrega doku yüzey gerilimi ölçümü için hazırlanması. Yapışık hücreler için parçacıklarının ya asılı bırak yöntemini kullanarak ya da tutarlı bir sayfa sonra 1 mm parça halinde kesilebilir hücreleri üreterek oluşturulabilir. Asılı damla yöntemi ile toplam oluşumu: <ol><li> Yakın konfluent yapışık hücre kültürleri,% 90 izdiham büyüdü olmalıdır Bunun üzerine mono tabakaları PBS ile iki kez durulanır olmalıdır. De boşalttıktan sonra, 2 ml% 0.05 tripsin-1 mM EDTA (100 mm plaka için) ekleyin ve 37 inkübe ° C hücreleri ayırmak kadar. 2 ml tam orta ekleme ve hücreleri süspansiyon kadar karışımı hafifçe çiğnemek için 5 ml pipet kullanın trypsinization Dur. 15 ml konik tüp hücreleri aktarın. </li><li> 10 mg / ml DNAz stok solüsyonu 40 ul ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. 5 dakika boyunca 200 xg&#39;de Vortex kısa ve santrifüj. </li><li> Süpernatant atın ve 1 ml tam doku kültür ortamı ile yıkayın pelet. Tekrarlama, daha sonra tekrar süspansiyon hücrelerin doku kültürü orta 2 ml. </li><li> Hemasitometre, ya da otomatik hücre sayıcı kullanarak hücre sayımı ve 2.5 x 10 6 hücre / ml konsantrasyon ayarlayabilirsiniz. </li><li> 60 mm doku kültürü çanak ve çanak alt PBS 5 ml kapağını kaldırın. Bu hidrasyon odası olarak hareket edecektir. </li><li> Kapağını ters çevirin ve alt kapağın üzerine 10 ul damla yatırmak için 20 ul pipet kullanın. Dokunmatik olarak damla yeteri kadar ayrı yerleştirildiğinde olduğunu emin olun. Bulaşık başına en az 20 damla yerleştirmek mümkündür. </li><li> 37 ° PBS-dolu alt odası ve inkübe ° C /% 5 CO 2 /% 95 nem üzerine kapağı, invert günlük damla izlemek ve hücre yaprak veya agrega ya oluşturmuşlardır kadar inkübe. </li><li> Yaprak formunda yuvarlak alt cam çalkalayıcı transfer olabilir tam orta 3 ml içeren ve 37 sallayarak bir su banyosunda inkübe şişeler ° C ve% 5 CO 2 parçacıklarının formu kadar. </li></ol> Hücre levha yöntemi ile toplam oluşumu: <ol start="9"><li> Tek hücre süspansiyonları, yukarıda açıklanan ancak 1x10 6 hücre / ml konsantrasyonu ayarlanır hazırlanmıştır . </li><li> Hücre süspansiyonu 3 ml, 10 ml yuvarlak alt şişeler (Belco, Vineland, NJ) aktarın. </li><li> Konili bir su banyosu / 37 çalkalayıcı (New Brunswick Scientific, Edison, NJ) ° C, 120 rpm&#39;de 4h için% 5 CO 2 hücreleri trypsinization kurtarmak kadar şişeler inkübe edin. </li><li> Cam bir yuvarlak alt santrifüj tüpü ve ince bir pelet içine 200 X g de santrifüj hücreleri aktarın. Tutarlı bir sayfa kıvamına gelinceye kadar başka bir 24 saat inkübe edin. </li><li> Yavaşça girdap kültür tüp levha yerinden ve kültür tüp içeriği, steril cam doku kültürü çanak içine dökün. </li><li> Çeşitli büyüklüklerde parçalara yaprak kesmek için mikro neşter kullanın. </li><li> Küresel hale ° C 120 rpm&#39;de Konili su banyosunda çalkalayıcı üzerinde% 2 ya da 3 gün için CO 2 5 altında veya kadar 37 parçaları inkübe edin. </li></ol> 2. Toplam yüzey geriliminin ölçülmesi <ol><li> Doku yüzeyine tansiyometre. Aparat İncir gösterilmektedir. 1 ve 2. Sıkıştırma hücresi (Şekil 3), iki odadan oluşmaktadır. Dış odası (OC) 37 ° C dolaşan su pompası bağlı ve iç odanın (IC) ısısını düzenlemek için hizmet vermektedir. Odaları öğütülmüş Kemik inşa ve toplu bir görünüm için kuvars pencereleri içerir. 3) sıkıştırma başlatmak için agrega yükseltmek; 2) iç odasının alt mühür; alt montaj (LA) iç odasının tabanına vida ve konumu) 1 iç odasında agrega kullanılır ve (4 Paralel plakalar ve dolayısıyla toplam sıkıştırma arasındaki mesafe kontrolü). Toplanma merkezi çekirdek (CC) ayarlanabilir. Merkezi bir çekirdek (kaide) ucu pürüzsüz Teflon oluşan ve alt sıkıştırma plakası (LCP) gibi davranır. Üst sıkıştırma plakası (UCP) Teflon silindir 15mm uzun denge kolu (B) alev doğruldu nikel-krom tel (NCW) sarkan *. Bir denemenin seyri sırasında, hücre agrega (A) alt plaka üzerine yerleştirilir ve üst plaka temas kadar yükseltti. Üst plaka denge kolu (B) bağlıdır. Agrega Sıkıştırma denge kolu yerinden neden olur. Dengesi boş denge prensibi üzerine çalışan bir Cahn / Ventron model 2000 kayıt Elektronik terazi,. Denge kol dayanak noktası, kalıcı bir manyetik alan içinde bir armatür vardır. Denge çalışırken, sürekli denge kolu da yatay konumda tutar elektromanyetik montaj, elektrik akımını geçirerek modüle. Bir nesne, denge Horizo ​​kolunu tutmak için geçerlidir, gerilim, denge kolu askıya alınırsantal konumu, nesne tartmak orantılıdır. Bu gerilim, toplam uygulanan dış basınç kuvveti ölçer. Agrega şekli bir frame grabber ile donatılmış bir bilgisayar ile birleştiğinde 25 x Nikon SMZ10A Stereoskop yoluyla görsel gözlem ile takip edilmektedir. Sıkıştırma plakaları, hücre agrega yapışma en aza indirmek için, alt ve üst sıkıştırma plakaları poli (2-hydroxyethylmethacrylate), {poli (HEMA)}, hücreler 16 yapışamayan polimerik malzeme ile kaplı her ikisi de. * Tel alev doğruldu imbik stand 15-inç uzunluğunda bir tel askı ve sonunda küçük bir bağlayıcı klip sıkma. Bunsen beki, daha sonra tel kırmızı yanıyor kadar telin uzunluğu aşağı yukarı çalıştırın ve. Doğruldu tel sonra uygun boylarda kesilebilir. Küçük bir kanca, tel bükme yaklaşık ¼ inç sonundan itibaren iki Jilet kullanarak oluşur. Diğer ucunu sonra daha düşük bir sıkıştırma plakası namlu içine eklenir. </li><li> Agrega sıkıştırma. <ol><li> Iç haznesi, önceden ısıtılmış CO 2 bağımsız doku kültür vasatı (Gibco / BRL, NY) ile doludur . </li><li> Agregalar yaklaşık 200-300 μ arasında değişen, düşük sıkıştırma plakası (Şekil 4A) konumlandırılmış. Agregalar, toplu bir silikon ampul takılmış bir Pasteur pipeti ucu kadar doku kültürü orta yarı yolda aspire, iç odasına pipet ve pipet LCP yukarıdaki ucu konumlandırma yüklenir. Agrega yavaşça ampul hafifçe sıkarak, LCP üzerine atılır. Alternatif olarak, toplam LCP üzerine ağırlık düşmesi için izin verilir. </li><li> Üst sıkıştırma plakası (UCP) agrega üzerine yerleştirilmiş ve bir ön sıkıştırma belirgin UCP ağırlığı temel kurarak, yerleşmek için izin verilir. </li><li> Agrega UCP (Şekil 4B) karşı sıkıştırılmış kadar LCP sonra ortaya çıkar. Alt aygıtının iç çekirdek yükseklik ayarlama sıkıştırma farklı derecelerde kontrol eder. Sıkıştırma CCD video kamera ile donatılmış bir diseksiyon mikroskobu ile gözlem ile izlenir. </li><li> Agrega görüntüler, yakalanan, sayısallaştırılmış ve ImageJ kullanılarak analiz edildi. Görünür UCP ağırlık değişimi sürekli Cahn denge gerilim çıkışı tesviye-off gösterilir bir şerit grafik kaydedici, şekil denge başarı kaydedilir. Her agrega sıkıştırma 2 farklı derecelerde maruz kalmaktadır. </li></ol></li><li> Toplam yüzey gerilimi hesaplanması. Uymazsa için paralel plakalar arasında sıkıştırılmış hücrelerinin şekil denge, agrega cohesivity cohesivity olan F toplam sıkıştırmak için hareket kuvvet σ Young-Laplace denklemi (Şekil 5), elde edilebilir , πr 3 2 F kuvveti sarf edildiği toplam yüzey alanı, ve R 2 ve R 3, sırasıyla, sıkıştırılmış agrega ekvator yarıçapı ve yüzey profili normal tanımlayan bir yay yarıçapı plakalar sıkıştırmak ve onları (Şekil 6) arasında uzanan. Kuvvet ve şekil denge basınç kuvveti ve geometri Ölçüm ve Young-Laplace denklemi için bu ölçümler uygulayarak belirgin doku yüzey gerilimi sayısal değerler üretir. Denge ve 1 σ hesaplama ulaştıktan sonra, agrega sıkıştırılmış ve ikinci bir denge yaklaşımı ve yukarıda açıklandığı gibi hesaplanır 2 σ izin. </li><li> Toplam likidite Onay. Sıvı bir agrega hesaplanan yüzey gerilimi, iki farklı sıkıştırma maruz kaldığında sabit kalır. Gibi agrega oranı 2 σ / σ 1 1&#39;e eşit olacak ve birbirini izleyen sıkıştırma (F 2 / F 1) uygulanan kuvvet oranına göre daha az olacaktır. Buna karşılık, elastik bir agrega hesaplanan yüzey gerilimi Hooke kanunu itaat ve uygulanan kuvvete orantılı olarak artış. Elastik agrega oranı 2 σ / 1 1 eşit olmayacak σ ancak bunun yerine F 2 / F 1 oranı yaklaşım olacaktır. Ayrıca, sıvı agregaların yüzey gerilimi toplam boyutu 2,17 bağımsız olacaktır . Uygulanan kuvvet ve büyüklük yüzey gerilimi bağımsız olduğu sadece ölçüm ortalama her hücre hattı için σ hesaplamak için kullanılır. </li></ol> 3. Temsilcisi sonuçları: Aşağıda tipik TDT sonuçlarının sıçan prostat fibroblastlar (RPF) ve sıçan prostat düz kas hücreleri (RPSMC) agrega bir tablo. Şekil görüleceği gibi. 7 RPF hücrelerinin agrega bir yüzey gerilimi 22.8 ± 1.1 dynes / cm. Ayrıca, sıkıştırma sonra 1 ve 2&#39;den sonra sıkıştırma ölçülen ortalama yüzey gerilimi değerleri istatistiksel olarak identeşleştirilmiş t-testi ile karşılaştırıldığında ical. Biz de onlar elastik katılar gibi davranmış olsaydı, 2 σ / bu rakamlar, Hooke kanunu itaat etmediğini sağlamak için 1 ve F 2 / F 1 σ oranları karşılaştırıldı. Tablo 1, 2 / 1 gerçekten 1.0 yaklaşım σ σ oranı gösterilmiştir. Ayrıca, F 2 / F 1 oranı daha fazla, bu rakamlar, Hooke kanunu itaat ve aslında sıvı gibi davranır olduğunu teyit σ 2 / 1 σ (eşleştirilmiş t-testi, p &lt;0.05) daha anlamlı olarak daha fazla idi . Hooke kanunu kontrast RPSMCs itaat. Tablo 1, 2 σ / 1 σ oranı bellidir 1 den anlamlı olarak daha fazla ve daha F 2 / F 1 istatistiksel olarak farklı değildi. Daha fazla sıvı gibi davranış göstermek için, yüzey gerilimi (σ) ve toplam hacmi arasındaki ilişkiyi araştırdı. Şekil görüleceği gibi. 8 RPSMCs (mavi regresyon çizgisi, r 2 = 0,146) hacim sigma bazı bağımlılığı var ise, hacim, RPF hücreleri (kırmızı regresyon hattı, r 2 = 0.002) sigma bağımsız. Bu veriler daha RPSMCs, elastik katılar gibi davranmaya RPF agrega ise, sıvı-benzeri bir şekilde davrandığını onaylayın. Sadece bu ölçüleri sıvılar gibi davranıyor agrega elde edilen yüzey gerilimi hesaplamak için kullanılan olurdu. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1 doku yüzeyine tansiyometre Genel Bakış. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2 tansiyometre odası (sağ panel) daha ayrıntılı bir görünüm. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3 tansiyometre odasının şematik görünümü. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig4.jpg" alt="Şekil 4"/> Şekil 4 sıkıştırılmamış (A) ve sıkıştırılmış (B) agrega Görüntüler. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig5.jpg" alt="Şekil 5"/> Şekil 5 Laplace Denklemi. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig6.jpg" alt="Şekil 6"/> Şekil 6 şeklini dengede kötü yapışır iki paralel plakalar arasında sıkıştırılmış bir sıvı damlacık diyagramı. R 1 ve R 2 sırasıyla, damlacık ekvator ve simetri ekseni boyunca bir düzlemde, iki temel eğrilik yarıçapları. R 3 kompresyon pla ile temas, damlacık dairesel alanın yarıçapı. H, alt ve üst sıkıştırma plakalar arasındaki mesafedir. X damlacık yüzey arasındaki temas ve sıkıştırma plakası ya bir noktaya kadar uzanan 2 hipotenüs R ile dik açılı üçgenin bir tarafında. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> σ 1 (dynes / cm ± SEM) </td><td> 2 σ (dynes / cm ± SEM) </td><td> Pσ 1 vs 2 σ </td><td> 1,2 (dynes / cm ± SEM) σ </td><td> 2 σ / σ 1 </td><td> F 2 / F 1 </td><td> Pσ 2 / 1 σ ve F 2 F 1 </td></tr><tr><td> RPF </td><td> 22.6 ± 1.7 </td><td> 22.9 ± 1.4 </td><td> &gt; 0.05 * </td><td> 22.8 ± 1.1 </td><td> 1.04 ± 0.04 </td><td> 1.47 ± 0.06 </td><td> &lt;0.05 </td></tr><tr><td> RPSMC </td><td> 15.0 ± 2.8 </td><td> 23.0 ± 3.2 </td><td> 0,039 </td><td> NA </td><td> 1.9 ± 0.3 </td><td> 1.6 ± 0.1 </td><td> 0.16 * </td></tr></tbody></table> Şekil 7 TST ölçümleri ve sıçan prostat fibroblastlar ve düz kas hücreleri büyüklükler toplam likidite onayı. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig8.jpg" alt="Şekil 8"/> Şekil 8 sigma ve RPF agregatları için hacim (kırmızı çizgi) ve RPSMCs (mavi çizgi) arasındaki ilişki.

<ol>
	<li>Foty, R. A., Forgacs, G., Pfleger, C. M., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+properties+of+embryonic+tissues:+Measurement+of+interfacial+tensions.">Liquid properties of embryonic tissues: Measurement of interfacial tensions.</a> Phys Rev Lett. 72, 2298-2301 (1994).</li><li>Foty, R. A., Pfleger, C. M., Forgacs, G., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+tensions+of+embryonic+tissues+predict+their+mutual+envelopment+behavior.">Surface tensions of embryonic tissues predict their mutual envelopment behavior.</a> Development. 122, 1611-1620 (1996).</li><li>Schotz, E. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+differences+in+tissue+surface+tension+influence+zebrafish+germ+layer+positioning.">Quantitative differences in tissue surface tension influence zebrafish germ layer positioning.</a> HFSP Journal. 2, 42-56 (2008).</li><li>Jia, D., Dajusta, D., Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+surface+tensions+guide+in+vitro+self-assembly+of+rodent+pancreatic+islet+cells.">Tissue surface tensions guide in vitro self-assembly of rodent pancreatic islet cells.</a> Dev Dyn. 236, 2039-2049 (2007).</li><li>Schwarz, M. A., Zheng, H., Legan, S., Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+Self-Assembly+is+Modulated+by+Tissue+Surface+Tensions.">Lung Self-Assembly is Modulated by Tissue Surface Tensions.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. , (2010).</li><li>Ryan, P. L., Foty, R. A., Kohn, J., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+spreading+on+implantable+substrates+is+a+competitive+outcome+of+cell-cell+vs.+cell-substratum+adhesivity.">Tissue spreading on implantable substrates is a competitive outcome of cell-cell vs. cell-substratum adhesivity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 4323-4327 (2001).</li><li>Foty, R. A., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+differential+adhesion+hypothesis:+a+direct+evaluation.">The differential adhesion hypothesis: a direct evaluation.</a> Dev Biol. 278, 255-263 (2005).</li><li>Robinson, E. E., Foty, R. A., Corbett, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+matrix+assembly+regulates+alpha5beta1-mediated+cell+cohesion.">Fibronectin matrix assembly regulates alpha5beta1-mediated cell cohesion.</a> Mol Biol Cell. 15, 973-981 (2004).</li><li>Robinson, E. E., Zazzali, K. M., Corbett, S. A., Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha5beta1+integrin+mediates+strong+tissue+cohesion.">alpha5beta1 integrin mediates strong tissue cohesion.</a> J Cell Sci. 116, 377-386 (2003).</li><li>Winters, B. S., Raj, B. K., Robinson, E. E., Foty, R. A., Corbett, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+regulates+Raf-1+expression+to+modulate+fibronectin+matrix+assembly.">Three-dimensional culture regulates Raf-1 expression to modulate fibronectin matrix assembly.</a> Mol Biol Cell. 17, 3386-3396 (2006).</li><li>Caicedo-Carvajal, C. E., Shinbrot, T., Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha5beta1+integrin-fibronectin+interactions+specify+liquid+to+solid+phase+transition+of+3D+cellular+aggregates.">Alpha5beta1 integrin-fibronectin interactions specify liquid to solid phase transition of 3D cellular aggregates.</a> PLoS One. 5, e11830-e11830 (2010).</li><li>Foty, R. A., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+tumor+cell+cohesion+and+suppression+of+invasion+by+E-+or+P-cadherin.">Measurement of tumor cell cohesion and suppression of invasion by E- or P-cadherin.</a> Cancer Res. 57, 5033-5036 (1997).</li><li>Foty, R. A., Corbett, S. A., Schwarzbauer, J. E., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexamethasone+up-regulates+cadherin+expression+and+cohesion+of+HT-1080+human+fibrosarcoma+cells.">Dexamethasone up-regulates cadherin expression and cohesion of HT-1080 human fibrosarcoma cells.</a> Cancer Res. 58, 3586-3589 (1998).</li><li>Winters, B. S., Shepard, S. R., Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+measurement+of+brain+tumor+cohesion.">Biophysical measurement of brain tumor cohesion.</a> Int J Cancer. 114, 371-379 (2005).</li><li>Foty, R. A., Cummings, K. B., Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+surface+tensiometry:+a+novel+technique+for+predicting+invasive+potential+of+prostate+tumors+based+on+tumor+cell+aggregate+cohesivity+in+vitro.">Tissue surface tensiometry: a novel technique for predicting invasive potential of prostate tumors based on tumor cell aggregate cohesivity in vitro.</a> Surgical Forum L. , 707-708 (1999).</li><li>Folkman, J., Moscona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cell+shape+in+growth+control.">Role of cell shape in growth control.</a> Nature. 273, 345-349 (1978).</li><li>Foty, R. A., Forgacs, G., Pfleger, C. M., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+properties+of+embryonic+tissues:+Measurement+of+interfacial+tensions.">Liquid properties of embryonic tissues: Measurement of interfacial tensions.</a> Physical Review Letters. 72, 2298-2301 (1994).</li><li>Guevorkian, K., Colbert, M. J., Durth, M., Dufour, S., Brochard-Wyart, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspiration+of+biological+viscoelastic+drops.">Aspiration of biological viscoelastic drops.</a> Phys Rev Lett. 104, 218101-218101 (2010).</li></ol>

TST toplam uyum nispeten basittir. Ancak, kullanışlı TST veri oluşturmak amacıyla hakim olmalıdır önemli adımlar vardır: 1) agrega &quot;sağlıklı&quot; olmalıdır. Bu, toplam oluşumu dekolmanı önce optimum izdiham hücreleri ile başlar sağlanarak kontrol edilebilir. Kültür Agrega boyutu ve süresi de toplam içinde nekrotik çekirdek gelişimini en aza indirmek için kontrol edilmesi gerekir; 2) TST ölçümleri etkileyebilecek bir başka parametre üst veya alt sıkıştırma plakaları büyüklü?...

<ul><li> su banyosu / çalkalayıcı (New Brunswick Scientific, Edison, NJ) </li><li> 10 ml yuvarlak alt şişeler (Belco, Vineland, NJ) </li></ul>

measurement of aggregate cohesion by tissue surface tensiometry

Içi bağlayıcı enerji sıkı ölçümü sadece denge sistemleri termodinamik ilkeleri temelinde yöntemler kullanılarak yapılabilir. Biz özellikle hücreleri arasındaki etkileşimin yüzey serbest enerji ölçmek için doku yüzeyinin tensiometresi (TST) geliştirdik. TST temel biyofiziksel kavramları daha önce ayrıntılı 1,2 tarif edilmiştir. Bu metot, karşılıklı olarak birbirine bağlı hücreler, kültür sallayarak muhafaza, kendiliğinden kümeler halinde monte edeceği gözleme dayanır. Zamanla, bu kümeleri oluşturmak için küreler kadar yuvarlak. Bu yuvarlama-up davranışı sıvı sistemlerinin davranış özelliği taklit eder. Hücreler arası bağlayıcı enerji, özel tasarlanmış bir doku yüzeyine tansiyometre paralel plakalar arasında küresel agrega sıkıştırarak ölçülür. Aynı matematiksel denklemi, bir sıvı damlacık yüzey gerilimi ölçmek için kullanılan 3D doku gibi küresel agrega yüzey gerilimi ölçmek için kullanılır. Sıvı yüzey gerilimi hücresel eşdeğer içi bağlayıcı enerji, ya da daha genel olarak, doku cohesivity. Laboratuvarımızda Önceki çalışmalar, embriyonik hücreler iki grup, başka bir 1-5 ile etkileşim (2) güçlü (3), biyomalzemeler 6 ile etkileşim dokuların yeteneği nasıl etkileyebilir doku yüzey gerilimi (1) öngördüğünü göstermiştir sadece kaderin tabanlı hücrelerarası uyum 7 doğrudan manipülasyonu yoluyla değil, aynı zamanda FN 8-11 ve 4 gibi önemli ECM moleküller) manipülasyon tarafından değiştirilebilir akciğer kanseri 12, fibrosarkoma 13, 14 beyin tümörü ve prostat tümörlerinde invaziv potansiyeli ile ilişkilidir hücre hatları 15. Bu yazıda, aparatı, detay parçacıklarının oluşturmak için gerekli adımları tansiyometre odasına parçacıklarının yüklemek için toplam sıkıştırma başlatmak için oluşturulan doku yüzey gerilimi ölçümleri analiz etmek ve doğrulamak için anlatacağız.

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry at JoVE.com

Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry

Biz 3D doku gibi agrega içinde hücreleri arasında, bağlayıcı enerji, doku yüzey gerilimi olarak ifade ölçme yöntemi açıklanmaktadır. , Akciğer, kas, ve beyin tümörleri invazivliğini ile ilişkili doku yüzey gerilimi farklar göstermiştir ve farklı hücre türleri arasındaki mekansal ilişkilerin kurulması temel belirleyicileri olmuştur.

Doku Yüzey tensiometresi Agrega Uyum ölçümü

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium.  We ...

measurement-of-aggregate-cohesion-by-tissue-surface-tensiometry

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.5K Görüntüleme.  UMDNJ-Robert Wood Johnson Medical School. Biz 3D doku gibi agrega içinde hücreleri arasında, bağlayıcı enerji, doku yüzey gerilimi olarak ifade ölçme yöntemi açıklanmaktadır. , Akciğer, kas, ve beyin tümörleri invazivliğini ile ilişkili doku yüzey gerilimi farklar göstermiştir ve farklı hücre türleri arasındaki mekansal ilişkilerin kurulması temel belirleyicileri olmuştur.

Video: Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

Polimerik Gen Taşıyıcı Değerlendirilmesi Nanoparçacık İzleme Analizi ve Yüksek throughput Flow Sitometri tarafından Nanopartiküller

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Biyomühendislik

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

3-Boyutlu Hücre Kültürü için Self-raporlama iskeleleri

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Preparation of Light-responsive Membranes by a Combined Surface Grafting and Postmodification Process

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is presented. The polymerization from the membrane surface is induced by plasma treatment of the membrane, followed by reacting the membrane surface with a methanolic solution of 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA). Special attention is given to the process parameters for the plasma treatment prior to the polymerization on the surface. For example, the influence of the plasma-treatment on different types of membranes (e.g.&#160;polyester, polycarbonate, polyvinylidene fluoride) is studied. Furthermore, the time-dependent stability of the surface-grafted membranes is shown by contact angle measurements. When grafting poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA) in this way, the surface can be further modified by esterification of the alcohol moiety of the polymer with a carboxylic acid function of the desired substance. These reactions can therefore be used for the functionalization of the membrane surface. For example, the surface tension of the membrane can be changed or a desired functionality as the presented light-responsiveness can be inserted. This is demonstrated by reacting PHEMA with a carboxylic acid functionalized spirobenzopyran unit which leads to a light-responsive membrane. The choice of solvent plays a major role in the postmodification step and is discussed in more detail in this paper. The permeability measurements of such functionalized membranes are performed using a Franz cell with an external light source. By changing the wavelength of the light from the visible to the UV-range, a change of permeability of aqueous caffeine solutions is observed.

A plasma-induced polymerization procedure is described for the surface-initiated polymerization on polymer membranes. Further postmodification of the grafted polymer with photochromic substances is presented with a protocol of conducting permeability measurements of light-responsive membranes.

Bir Kombine Yüzey Tırnak ve Postmodification Süreci Işık duyarlı Membranların Hazırlanması

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. Kelvin probe force microscopy (KPFM) is a module of atomic force microscopy (AFM) that measures the contact potential difference between surfaces at the nano-scale. The combination of KPFM with AFM allows for the simultaneous generation of surface potential and topographical maps of biological samples such as bacterial cells. Here, we employ KPFM to examine the effects of surface potential on microbial adhesion to medically relevant surfaces such as stainless steel and gold. Surface potential maps revealed differences in surface potential for microbial membranes on different material substrates. A step-height graph was generated to show the difference in surface potential at a boundary area between the substrate surface and microorganisms. Changes in cellular membrane surface potential have been linked with changes in cellular metabolism and motility. Therefore, KPFM represents a powerful tool that can be utilized to examine the changes of microbial membrane surface potential upon adhesion to various substrate surfaces. In this study, we demonstrate the procedure to characterize the surface potential of individual methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA100 cells on stainless steel and gold using KPFM.

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Kelvin Probe Kuvvet Mikroskobu kullanılarak Bakterilerin Yüzey Potansiyel Ölçümü

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of exosomes to determine if they carry disease discriminatory biomarkers. For performing exosomal analysis, it is necessary to develop a method for extracting and analyzing exosomes from target biofluids without damaging the internal content.
Electric field-induced release and measurement (EFIRM) is a method for specifically extracting exosomes from biofluids, unloading their cargo, and testing their internal RNA/protein content. Using an anti-human CD63 specific antibody magnetic microparticle, exosomes are first precipitated from biofluids. Following extraction, low-voltage electric cyclic square waves (CSW) are applied to disrupt the vesicular membrane and cause cargo unloading. The content of the exosome is hybridized to DNA primers or antibodies immobilized on an electrode surface for quantification of molecular content.
The EFIRM method is advantageous for extraction of exosomes and unloading cargo for analysis without lysis buffer. This method is capable of performing specific detection of both RNA and protein biomarker targets in the exosome. EFIRM extracts exosomes specifically based on their surface markers as opposed to size-based techniques.
Transmission electron microscopy (TEM) and assay demonstrate the functionality of the method for exosome capture and analysis. The EFIRM method was applied to exosomal analysis of 9 mice injected with human lung cancer H640 cells (a cell line transfected to express the exosome marker human CD63-GFP) in order to test their exosome profile against 11 mice receiving saline controls. Elevated levels of exosomal biomarkers (reference gene GAPDH and protein surface marker human CD63-GFP) were found for the H640 injected mice in both serum and saliva samples. Furthermore, saliva and serum samples were demonstrated to have linearity (R = 0.79). These results are suggestive for the viability of salivary exosome biomarkers for detection of distal diseases.

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement EFIRM

Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.

Elektrik Alan-kaynaklı Release ve Ölçme (EFIRM) tarafından Exosomal Biomarker Algılama

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of ...

Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. Single muscle fiber studies are useful in both basic science and clinical studies. For basic studies, single muscle fiber contractility measurements allow investigation of fundamental mechanisms of force production, and analysis of muscle function in the context of genetic manipulations. Clinically, single muscle fiber studies provide useful insight into the impact of injury and disease on muscle function, and may be used to guide the understanding of muscular pathologies. In this video article we outline the steps required to prepare and isolate an individual skeletal muscle fiber segment, attach it to force-measuring apparatus, activate it to produce maximum isometric force, and estimate its cross-sectional area for the purpose of normalizing the force produced.

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. In this article we outline a valid and reliable technique to prepare and test permeabilized skeletal muscle fibers in vitro.

Permeabilize İskelet Kası Fibers tarafından oluşturulan Maksimum İzometrik Kuvvet Ölçümü

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to intrinsic parameters within the process allow a high degree of control over scaffold characteristics including fiber diameter, alignment and porosity. By developing scaffolds with similar dimensions and topographies to organ- or tissue-specific extracellular matrices (ECM), micro-environments representative to those that cells are exposed to in situ can be created. 
The airway bronchiole wall, comprised of three main micro-environments, was selected as a model tissue. Using decellularized airway ECM as a guide, we electrospun the non-degradable polymer, polyethylene terephthalate (PET), by three different protocols to produce three individual electrospun scaffolds optimized for epithelial, fibroblast or smooth muscle cell-culture. Using a commercially available bioreactor system, we stably co-cultured the three cell-types to provide an in vitro model of the airway wall over an extended time period.
This model highlights the potential for such methods being employed in in vitro diagnostic studies investigating important inter-cellular cross-talk mechanisms or assessing novel pharmaceutical targets, by providing a relevant platform to allow the culture of fully differentiated adult cells within 3D, tissue-specific environments.

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall.

Elektrospinning Süreci Uyarlama bir Tri-katmanlı için üç Benzersiz ortamlar sağlamak için<em&gt; In Vitro</em&gt; Havayolu Wall Modeli

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Bir ıntrinsic Vaskülarizasyon tarafından Doku Mühendisliği<em&gt; İn Vivo</em&gt; Doku Mühendisliği Odası

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Site-Directed Immobilization of Bone Morphogenetic Protein 2 to Solid Surfaces by Click Chemistry

Different therapeutic strategies for the treatment of non-healing long bone defects have been intensively investigated. Currently used treatments present several limitations that have led to the use of biomaterials in combination with osteogenic growth factors, such as bone morphogenetic proteins (BMPs). Commonly used absorption or encapsulation methods require supra-physiological amounts of BMP2, typically resulting in a so-called initial burst release effect that provokes several severe adverse side effects. A possible strategy to overcome these problems would be to covalently couple the protein to the scaffold. Moreover, coupling should be performed in a site-specific manner in order to guarantee a reproducible product outcome. Therefore, we created a BMP2 variant, in which an artificial amino acid (propargyl-L-lysine) was introduced into the mature part of the BMP2 protein by codon usage expansion (BMP2-K3Plk). BMP2-K3Plk was coupled to functionalized beads through copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC). The biological activity of the coupled BMP2-K3Plk was proven in vitro and the osteogenic activity of the BMP2-K3Plk-functionalized beads was proven in cell based assays. The functionalized beads in contact with C2C12 cells were able to induce alkaline phosphatase (ALP) expression in locally restricted proximity of the bead. Thus, by this technique, functionalized scaffolds can be produced that can trigger cell differentiation towards an osteogenic lineage. Additionally, lower BMP2 doses are sufficient due to the controlled orientation of site-directed coupled BMP2. With this method, BMPs are always exposed to their receptors on the cell surface in the appropriate orientation, which is not the case if the factors are coupled via non-site-directed coupling techniques. The product outcome is highly controllable and, thus, results in materials with homogeneous properties, improving their applicability for the repair of critical size bone defects.

Biomaterials doped with Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP2) have been used as a new therapeutic strategy to heal non-union bone fractures. To overcome side effects resulting from an uncontrollable release of the factor, we propose a new strategy to site-directly immobilize the factor, thus creating materials with improved osteogenic capabilities.

Site yönettiği immobilizasyon kemik morfogenetik protein 2 katı yüzeyler için tıklayın kimya tarafından

Different therapeutic strategies for the treatment of non-healing long bone defects have been intensively investigated. Currently used treatments present ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.