1. הכנה מצטבר עבור מדידה של מתח הפנים רקמות. עבור תאים חסיד, spheroids יכול להיווצר באמצעות אחת השיטה טיפה תלויה או על ידי יצירת דף קוהרנטית של תאים כי אז יכול להיות חתך לתוך שברי 1 מ&quot;מ. היווצרות צבירה בשיטת ירידה תלוי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקרוב ומחוברות בתרביות תאים חסיד צריך להיות מבוגר כדי מפגש 90%, monolayers ואז יש לשטוף פעמיים עם PBS. לאחר ניקוז טוב, להוסיף 2 MLS (עבור 100 צלחות מ&quot;מ) של 0.05% טריפסין-1 mM EDTA, ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס עד תאים לנתק. עצור trypsinization ידי הוספת 2 MLS של המדיום להשלים בעדינות להשתמש פיפטה 5 מ&quot;ל ל triturate את התערובת עד התאים בתרחיף. העברת התאים צינור חרוטי 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 40 μl של פתרון DNAse 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​מניות דגירה במשך 5 דקות ב RT. וורטקס בקצרה צנטריפוגות ב XG 200 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ולשטוף עם גלולה 1 מ&quot;ל להשלים בינוני רקמה תרבות. חזור, ואז התאים resuspend ב 2 MLS של המדיום רקמה שלמה תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים באמצעות hemacytometer, או נגד תא אוטומטיות ולהתאים הריכוז 2.5 x 10 6 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מכסה צלחת 60 מ&quot;מ רקמת תרבות מקום 5 MLS של PBS בתחתית הצלחת. זה ישמש חדר הידרציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את המכסה להשתמש פיפטה 20 μl להפקיד 10 טיפות μl על החלק התחתון של המכסה. ודא כי טיפות ממוקמים מספיק מזה כדי לא לגעת. אפשר במקום לפחות 20 טיפות לכל מנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את המכסה על חדר-PBS מלא התחתונה לדגור על 37 ° CO 5 / 2% / 95% לחות, לעקוב אחר טיפות יומי לדגור עד או יריעות התא או אגרגטים יצרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר בצורת יריעות, הם יכולים להיות מועברים מסביב לתחתית הכוס שייקר צלוחיות המכילות 3 של ה-MLS בינוני מלא מודגרות באמבט מים רועד ב 37 ° C ו 5% CO 2 עד טופס spheroids. </li></ol> היווצרות צבירה בשיטת גיליון התא: <ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתלים תא יחיד מוכנים כפי שתואר לעיל, אך ריכוז מותאם 1x10 6 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 3 מ&quot;ל של השעיה התא עד 10 מסביב לתחתית צלוחיות מ&quot;ל (Belco, Vineland, NJ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלוחיות באמבט מים gyratory / שייקר (ניו ברונסוויק מדעי, אדיסון, ניו ג&#39;רזי) בשעה 37 ° C, 5% CO 2 עבור 4H בסל&quot;ד עד 120 תאים להתאושש trypsinization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת התאים צינור עגול תחתית זכוכית צנטריפוגה צנטריפוגה ב X 200 גרם לתוך גלולה דק. דגירה של 24 שעות אחר עד לקבלת גיליון קוהרנטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת בעדינות את הצינור התרבות כדי לסלק את הגיליון ושופכים את תוכנו של הצינור אל תוך התרבות קטן, רקמה סטרילית צלחת זכוכית תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש אזמלים מיקרו לחתוך את גיליונות לרסיסים בגדלים שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שברי ב 37 ° C על waterbath gyratory שייקר בסל&quot;ד 120 לפי 5% CO 2 על 2 עד 3 ימים או עד שהם הופכים כדורית. </li></ol> 2. מדידה של מתח הפנים המצרפי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משטח רקמה tensiometer. המכשיר מוצג תאנים. 1 ו -2. התא דחיסה (איור 3) מורכב משני חדרים. החדר החיצוני (OC) מחוברת משאבה 37 ° C במחזור המים, ומשמש לווסת את הטמפרטורה של החדר הפנימי (IC). החדרים בנויים Delrin הסתובבו ומכילים חלונות קוורץ להדמיה של המצרף. נמוך יותר (בלוס אנג&#39;לס) הרכבה ברגים לתוך הבסיס של החדר הפנימי והוא משמש 1) עמדת המצרפי בחדר הפנימי; 2) חותם את החלק התחתון של החדר הפנימי: 3) להעלות את המצרפי ליזום דחיסה; ו (4 ) לשלוט על המרחק בין לוחות מקבילים ולכן דחיסה של המצרף. הליבה המרכזית (CC) האסיפה היא מתכווננת. קצה של הליבה המרכזית (הדום) מורכב חלקה טפלון משמש הצלחת דחיסה נמוך (LCP). צלחת דחיסה העליון (UCP) הוא גליל טפלון 15mm ארוך התלוי מהזרוע איזון (B) על ידי חוט להבה יישר ניקל כרום (NCW) *. במהלך ניסוי, במצטבר תא (A) ממוקם על הצלחת התחתונה וגדל עד שהוא קשר את הצלחת העליונה. צלחת העליון מחובר בזרוע איזון (B). דחיסה של מצרף גורמת תזוזה של היד איזון. האיזון הוא כאהן / Ventron מודל 2000 electrobalance הקלטה, הפועלת על עיקרון האיזון null. נקודת המשען של הזרוע האיזון יש עוגן בתוך שדה מגנטי קבוע. כאשר מאזן פועל, זה ללא הרף מודולציה עובר זרם דרך הרכבה האלקטרומגנטי, אשר בתורו שומר על איזון זרוע במצב אופקי. כאשר אובייקט הוא מושעה מהזרוע איזון, מתח, אשר חל איזון כדי לשמור על שלובי horizoעמדת ntal, הוא יחסי לשקול של האובייקט. מתח זה מודד את כוח דחיסה חיצוני להחיל במצטבר. הצורה של צבירה מנוטר על ידי תצפית ויזואלית באמצעות stereoscope 25 x SMZ10A Nikon מצמידים את המחשב מצויד grabber מסגרת. כדי למזער הידבקות של אגרגטים התא צלחות דחיסה, הן הצלחות דחיסה תחתון ועליון היו מצופים פולי (2-hydroxyethylmethacrylate) {פולי (המה)}, חומר פולימרי אשר התאים אינם דבקים 16. * חוט היא להבה יישר בתלייה באורך 15-inch של חוט מדוכן תשובה ו clamping קליפ קלסר קטן עד הסוף. מבער בונזן מנוהלת מלמעלה למטה, את אורך החוט עד חוט אדום זוהר. החוט יישר לאחר מכן ניתן לחתוך את אורכי המתאים. וו קטן נוצר על ידי כיפוף חוט כ ¼ סנטימטר מקצה באמצעות שני סכיני גילוח. בקצה השני מוכנס לתוך חבית אז הצלחת דחיסה נמוך יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צבירה דחיסה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החדר הפנימי מלא מראש חימם בינוני CO 2 עצמאית רקמה תרבות (Gibco / BRL, ניו יורק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצרפים החל בגודל כ 200-300 μ ממוקמים על הצלחת דחיסה נמוך יותר (איור 4 א). מצרפי נטענים על ידי aspirating צבירה במדיום רקמה תרבות בחצי הדרך קצה פיפטה פסטר מצוידת בנורה סיליקון, העברת פיפטה לחדר פנימי, ומיקום קצה פיפטה מעל LCP. המצרפי היא אז גורשו על ידי בעדינות בעדינות לוחצת את הנורה על LCP. לחלופין, במצטבר מותר ליפול על ידי כוח הכבידה על LCP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת דחיסה העליון (UCP) ממוקמת מעל במצטבר ואיפשר להתיישב, להקים טרום דחיסה בסיסית לכאורה משקל UCP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> LCP הוא העלה אז עד המצרפי דחוס נגד UCP (איור 4 ב). התאמת גובה של הליבה הפנימית של המנגנון התחתון ישלוט דרגות שונות של דחיסה. דחיסה מנוטר על ידי תצפית דרך מיקרוסקופ לנתח מצויד במצלמת וידאו CCD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונות צבירה נלכדים, דיגיטציה, ונותחו באמצעות ImageJ. לכאורה לשנות UCP משקל נרשם ברציפות על מקליט רצועה תרשים, ההישג של שיווי משקל הצורה להיות מסומן על ידי off-פילוס התפוקה מתח את האיזון של כהן. המצרפי כל נתון 2 דרגות שונות של דחיסה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב מתח הפנים המצרפי. בשיווי משקל, צורה, cohesivity של המצרפי של תאים דחוסים בין לוחות מקבילים אשר אין לדבוק ניתן לקבל משוואה יאנג-Laplace (איור 5), שם היא σ cohesivity, F הוא הכוח הפועל לדחוס את המצרפי , πr 3 2 הוא אזור של פני השטח של הצבירה שעליו מופעל כוח F, ו-R 2 ו R 3 הן, בהתאמה, רדיוס של קו המשווה של מצרף דחוס הרדיוס של קשת הגדרת פרופיל פני השטח שלו נורמלי על דחיסת צלחות הארכת ביניהם (איור 6). מדידת כוח דחיסה הגיאומטריה ועל כוח ושיווי משקל צורה ויישום מדידות אלה למשוואה יאנג-Laplace מייצר ערכים מספריים של מתח רקמות לכאורה על פני השטח. בהגיעם שיווי משקל וחישוב σ 1, אגרגטים הם decompressed ואיפשר גישה שיווי משקל השני σ 2 מחושב כמתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אישור נזילות המצרפי. מתח הפנים מחושב של צבירה נוזלי, כאשר נתון לשני עיסויים שונים יישאר קבוע. ב אגרגטים כזה יחס σ 2 / σ 1 יהיה שווה ל 1 ו יפחת היחס של הכוח ליישם דחיסה כל רצופים (F 2 / F 1). לעומת זאת, מתח הפנים מחושב המצרפי של אלסטית יצייתו חוק הוק ולהגדיל את יחסי הכוח ליישם. עבור אגרגטים אלסטי יחס σ 2 / σ 1 לא יהיה שווה ל 1 אבל יהיה במקום גישת היחס בין F 2 / F 1. מתח הפנים של אגרגטים נוזלי יהיה גם ללא תלות בגודל 2,17 המצרפי. מדידות היחיד שבו מתח פנים הוא עצמאי של כוח ליישם וגודל משמשים כדי לחשב σ הממוצע עבור כל קו התא. </li></ol> 3. נציג התוצאות: להלן טבלה של תוצאות TST אופייני אגרגטים של הערמונית fibroblasts חולדה (RPF) ו עכברוש תאים הערמונית שריר חלק (RPSMC). כפי שניתן לראות באיור. 7 אגרגטים של תאים RPF יש מתח הפנים של 22.8 ± 1.1 dynes / ס&quot;מ. יתר על כן, המתח מתכוון פני הערכים שנמדדו לאחר דחיסה 1 לאחר דחיסה 2 היו הזיהוי סטטיסטיתiCal בהשוואה ידי מבחן t מזווג. השווינו גם את היחס של σ 2 / σ 1 ו-F 2 / F 1 על מנת להבטיח כי אגרגטים אלה לא לציית לחוק של הוק, כפי שהם היו, אם הם התנהגו כמו מוצקים אלסטיים. כפי שמודגם בלוח 1, יחס של σ 2 / σ 1 אכן הגישה 1.0. יתר על כן, היחס בין F 2 / F 1 היה גבוה משמעותית מאשר σ 2 / σ 1 (לזווג מבחן t, P &lt;0.05), נוסף המאשר כי אגרגטים אלה אינם מקיימים את חוק הוק ולמעשה מתנהגים כמו נוזלים. ב RPSMCs בניגוד ציית חוק הוק. כפי שניתן לראות בלוח 1, יחס של σ 2 / σ 1 הוא גדול משמעותית מ 1 ולא היה שונה סטטיסטית מזו של F 2 / F 1. כדי להמשיך להפגין נוזל דמוי התנהגות, בחנו את הקשר בין מתח הפנים (σ) ונפח מצטבר. כפי שניתן לראות באיור. 8, נפח היא עצמאית של סיגמא עבור תאים RPF (קו רגרסיה אדום, r 2 = 0.002), בעוד נראה כי כמה התלות של סיגמא על היקף עבור RPSMCs (קו רגרסיה כחול, r 2 = 0.146). נתונים אלה מאשרים כי עוד אגרגטים RPF להתנהג באופן דמוי נוזל, בעוד שאלו של RPSMCs להופיע להתנהג יותר כמו מוצק אלסטי. רק mesurements אלה המתקבלים אגרגטים מתנהג כמו נוזלים יהיה להשתמש כדי לחשב מתח הפנים. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. סקירת tensiometer את פני השטח רקמות. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. תצוגה מפורטת יותר של החדר tensiometer (פאנל מימין). <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig3.jpg" alt="איור 3"/> 3. תרשים סכמטי נוף של החדר tensiometer. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig4.jpg" alt="איור 4"/> איור 4. תמונות של (B) אגרגטים דחוס (א) ו דחוס. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig5.jpg" alt="איור 5"/> איור 5. משוואת לפלס. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig6.jpg" alt="איור 6"/> איור 6. דיאגרמה של אגל נוזל דחוס בין שני לוחות מקבילים שהיא שומרת גרוע, בשיווי משקל צורה. R 1 ו R 2 הם רדיוסים two העיקרי של עקמומיות, בקו המשווה של אגל במטוס דרך ציר הסימטריה, בהתאמה. R 3 הוא הרדיוס של השטח החוזר של אגל של מגע עם צלחת או דחיסה. H הוא המרחק בין הלוחות דחיסה העליון והתחתון. X הוא צד אחד של משולש ישר זווית עם R 2 היתר הרחבת נקודת המגע בין פני השטח של אגל או צלחת דחיסה. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> σ 1 (dynes / ס&quot;מ ± SEM) </td><td> σ 2 (dynes / ס&quot;מ ± SEM) </td><td> Pσ 1 vs σ 2 </td><td> σ 1,2 (dynes / ס&quot;מ ± SEM) </td><td> σ 2 / σ 1 </td><td> F 2 / F 1 </td><td> Pσ 2 / σ 1 ו-F 2 נ 1 </td></tr><tr><td> RPF </td><td> 22.6 ± 1.7 </td><td> 22.9 ± 1.4 </td><td> &gt; 0.05 * </td><td> 22.8 ± 1.1 </td><td> 1.04 ± 0.04 </td><td> 1.47 ± 0.06 </td><td> &lt;0.05 </td></tr><tr><td> RPSMC </td><td> 15.0 ± 2.8 </td><td> 23.0 ± 3.2 </td><td> 0.039 </td><td> NA </td><td> 1.9 ± 0.3 </td><td> 1.6 ± 0.1 </td><td> 0.16 * </td></tr></tbody></table> איור 7. המדידות TST ואישור נזילות המצרפי אגרגטים של הערמונית fibroblasts חולדה ותאי שריר חלק. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig8.jpg" alt="איור 8"/> איור 8. הקשר בין סיגמא ונפח עבור מצרפי של RPF (קו אדום) RPSMCs (הקו הכחול).

<ol>
	<li>Foty, R. A., Forgacs, G., Pfleger, C. M., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+properties+of+embryonic+tissues:+Measurement+of+interfacial+tensions.">Liquid properties of embryonic tissues: Measurement of interfacial tensions.</a> Phys Rev Lett. 72, 2298-2301 (1994).</li><li>Foty, R. A., Pfleger, C. M., Forgacs, G., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+tensions+of+embryonic+tissues+predict+their+mutual+envelopment+behavior.">Surface tensions of embryonic tissues predict their mutual envelopment behavior.</a> Development. 122, 1611-1620 (1996).</li><li>Schotz, E. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+differences+in+tissue+surface+tension+influence+zebrafish+germ+layer+positioning.">Quantitative differences in tissue surface tension influence zebrafish germ layer positioning.</a> HFSP Journal. 2, 42-56 (2008).</li><li>Jia, D., Dajusta, D., Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+surface+tensions+guide+in+vitro+self-assembly+of+rodent+pancreatic+islet+cells.">Tissue surface tensions guide in vitro self-assembly of rodent pancreatic islet cells.</a> Dev Dyn. 236, 2039-2049 (2007).</li><li>Schwarz, M. A., Zheng, H., Legan, S., Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+Self-Assembly+is+Modulated+by+Tissue+Surface+Tensions.">Lung Self-Assembly is Modulated by Tissue Surface Tensions.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. , (2010).</li><li>Ryan, P. L., Foty, R. A., Kohn, J., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+spreading+on+implantable+substrates+is+a+competitive+outcome+of+cell-cell+vs.+cell-substratum+adhesivity.">Tissue spreading on implantable substrates is a competitive outcome of cell-cell vs. cell-substratum adhesivity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 4323-4327 (2001).</li><li>Foty, R. A., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+differential+adhesion+hypothesis:+a+direct+evaluation.">The differential adhesion hypothesis: a direct evaluation.</a> Dev Biol. 278, 255-263 (2005).</li><li>Robinson, E. E., Foty, R. A., Corbett, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+matrix+assembly+regulates+alpha5beta1-mediated+cell+cohesion.">Fibronectin matrix assembly regulates alpha5beta1-mediated cell cohesion.</a> Mol Biol Cell. 15, 973-981 (2004).</li><li>Robinson, E. E., Zazzali, K. M., Corbett, S. A., Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha5beta1+integrin+mediates+strong+tissue+cohesion.">alpha5beta1 integrin mediates strong tissue cohesion.</a> J Cell Sci. 116, 377-386 (2003).</li><li>Winters, B. S., Raj, B. K., Robinson, E. E., Foty, R. A., Corbett, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+regulates+Raf-1+expression+to+modulate+fibronectin+matrix+assembly.">Three-dimensional culture regulates Raf-1 expression to modulate fibronectin matrix assembly.</a> Mol Biol Cell. 17, 3386-3396 (2006).</li><li>Caicedo-Carvajal, C. E., Shinbrot, T., Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha5beta1+integrin-fibronectin+interactions+specify+liquid+to+solid+phase+transition+of+3D+cellular+aggregates.">Alpha5beta1 integrin-fibronectin interactions specify liquid to solid phase transition of 3D cellular aggregates.</a> PLoS One. 5, e11830-e11830 (2010).</li><li>Foty, R. A., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+tumor+cell+cohesion+and+suppression+of+invasion+by+E-+or+P-cadherin.">Measurement of tumor cell cohesion and suppression of invasion by E- or P-cadherin.</a> Cancer Res. 57, 5033-5036 (1997).</li><li>Foty, R. A., Corbett, S. A., Schwarzbauer, J. E., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexamethasone+up-regulates+cadherin+expression+and+cohesion+of+HT-1080+human+fibrosarcoma+cells.">Dexamethasone up-regulates cadherin expression and cohesion of HT-1080 human fibrosarcoma cells.</a> Cancer Res. 58, 3586-3589 (1998).</li><li>Winters, B. S., Shepard, S. R., Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+measurement+of+brain+tumor+cohesion.">Biophysical measurement of brain tumor cohesion.</a> Int J Cancer. 114, 371-379 (2005).</li><li>Foty, R. A., Cummings, K. B., Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+surface+tensiometry:+a+novel+technique+for+predicting+invasive+potential+of+prostate+tumors+based+on+tumor+cell+aggregate+cohesivity+in+vitro.">Tissue surface tensiometry: a novel technique for predicting invasive potential of prostate tumors based on tumor cell aggregate cohesivity in vitro.</a> Surgical Forum L. , 707-708 (1999).</li><li>Folkman, J., Moscona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cell+shape+in+growth+control.">Role of cell shape in growth control.</a> Nature. 273, 345-349 (1978).</li><li>Foty, R. A., Forgacs, G., Pfleger, C. M., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+properties+of+embryonic+tissues:+Measurement+of+interfacial+tensions.">Liquid properties of embryonic tissues: Measurement of interfacial tensions.</a> Physical Review Letters. 72, 2298-2301 (1994).</li><li>Guevorkian, K., Colbert, M. J., Durth, M., Dufour, S., Brochard-Wyart, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspiration+of+biological+viscoelastic+drops.">Aspiration of biological viscoelastic drops.</a> Phys Rev Lett. 104, 218101-218101 (2010).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

מדידת הלכידות המצרפי על ידי TST היא פשוטה יחסית. יש, עם זאת, שלבים עיקריים שיש שולט על מנת להפיק נתונים TST שמיש; 1) אגרגטים חייב להיות &quot;בריא&quot;. זה יכול להיות נשלט על ידי הקפדה היווצרות המצרפי מתחילה בתאים בנקודת המפגש אופטימלי לפני ניתוק. גודל זמן מצטבר ובתרבות חייב גם ...

<ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מי האמבט / שייקר (ניו ברונסוויק מדעי, אדיסון, ניו ג&#39;רזי) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 מ&quot;ל סביב תחתית צלוחיות (Belco, Vineland, NJ) </li></ul>

measurement of aggregate cohesion by tissue surface tensiometry

מדידה קפדנית של אנרגיית אינטר ניתן לבצע רק באמצעות שיטות מעוגנת בעקרונות תרמודינמיים של מערכות בשיווי משקל. פיתחנו משטח רקמה tensiometry (TST) במיוחד כדי למדוד את האנרגיה משטח ללא אינטראקציה בין תאים. המושגים הבסיסיים biophysical TST תוארו בעבר 1,2 פרט. השיטה מבוססת על התצפית כי תאי מלוכדת הדדית, אם נשמרת רועד תרבות, באופן ספונטני להרכיב לתוך אשכולות. במשך הזמן, אשכולות אלו עגול עד טופס התחומים. התנהגות זו עיגול למעלה מחקה את התנהגות המאפיינת מערכות נוזלי. אנרגיית אינטר נמדדת על ידי דחיסת אגרגטים כדורית בין לוחות מקבילים tensiometer אישית מעוצבת משטח רקמה. משוואה מתמטית אותה משמש כדי למדוד את מתח הפנים של טיפת נוזל המשמש למדידת מתח הפנים של רקמות כמו אגרגטים 3D כדורית. המקבילה הסלולרית של מתח פני הנוזל הוא אנרגיית אינטר, או באופן כללי יותר, cohesivity רקמות. מחקרים קודמים מהמעבדה שלנו הראו כי פני השטח רקמות מתח (1) מנבא כיצד שתי קבוצות של תאים עובריים יהיה אינטראקציה זה עם זה 1-5, (2) יכול מאוד להשפיע על היכולת של רקמות לתקשר עם biomaterials 6, (3) יכול לשנות לא רק באמצעות מניפולציה ישירה של לכידות cadherin מבוססי אינטר 7, אלא גם על ידי מניפולציה של מולקולות ECM מפתח כגון FN 8-11 ו 4) בקורלציה עם פוטנציאל פולשני של סרטן הריאות 12, fibrosarcoma 13, 14 ו - גידול במוח הגידול בערמונית שורות תאים 15. במאמר זה נתאר את מנגנון בפירוט את הצעדים הנדרשים כדי ליצור spheroids, כדי לטעון את spheroids החדרה tensiometer, ליזום דחיסה המצרפי, לנתח ולאמת את פני השטח רקמות מדידות המתח שנוצר.

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry at JoVE.com

Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry

אנו מתארים שיטה למדידת אנרגיה מחייב, כפי שבא לידי ביטוי מתח הפנים רקמות, בין תאים בתוך הרקמה, כמו אגרגטים 3D. הבדלים מתח הפנים רקמות הוכחו לתאם עם הפולשנות של ריאות, שרירים, גידולים במוח, הם הגורמים הבסיסיים של כינון יחסים מרחביים בין סוגי תאים שונים.

מדידה של לכידות צבירה ידי Tensiometry Surface רקמות

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium.  We ...

measurement-of-aggregate-cohesion-by-tissue-surface-tensiometry

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.5K Views.  UMDNJ-Robert Wood Johnson Medical School. אנו מתארים שיטה למדידת אנרגיה מחייב, כפי שבא לידי ביטוי מתח הפנים רקמות, בין תאים בתוך הרקמה, כמו אגרגטים 3D. הבדלים מתח הפנים רקמות הוכחו לתאם עם הפולשנות של ריאות, שרירים, גידולים במוח, הם הגורמים הבסיסיים של כינון יחסים מרחביים בין סוגי תאים שונים.

Video: Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

הערכת משלוח גן פולימרית חלקיקים על ידי Nanoparticle מעקב ניתוח וזרימת cytometry תפוקה גבוהה

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

פיגומים דיווח עצמי לתרבית תאים 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Preparation of Light-responsive Membranes by a Combined Surface Grafting and Postmodification Process

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is presented. The polymerization from the membrane surface is induced by plasma treatment of the membrane, followed by reacting the membrane surface with a methanolic solution of 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA). Special attention is given to the process parameters for the plasma treatment prior to the polymerization on the surface. For example, the influence of the plasma-treatment on different types of membranes (e.g.&#160;polyester, polycarbonate, polyvinylidene fluoride) is studied. Furthermore, the time-dependent stability of the surface-grafted membranes is shown by contact angle measurements. When grafting poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA) in this way, the surface can be further modified by esterification of the alcohol moiety of the polymer with a carboxylic acid function of the desired substance. These reactions can therefore be used for the functionalization of the membrane surface. For example, the surface tension of the membrane can be changed or a desired functionality as the presented light-responsiveness can be inserted. This is demonstrated by reacting PHEMA with a carboxylic acid functionalized spirobenzopyran unit which leads to a light-responsive membrane. The choice of solvent plays a major role in the postmodification step and is discussed in more detail in this paper. The permeability measurements of such functionalized membranes are performed using a Franz cell with an external light source. By changing the wavelength of the light from the visible to the UV-range, a change of permeability of aqueous caffeine solutions is observed.

A plasma-induced polymerization procedure is described for the surface-initiated polymerization on polymer membranes. Further postmodification of the grafted polymer with photochromic substances is presented with a protocol of conducting permeability measurements of light-responsive membranes.

הכנה של ממברנות אור תגובה על ידי הארכת משטח משולבת ותהליך Postmodification

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. Kelvin probe force microscopy (KPFM) is a module of atomic force microscopy (AFM) that measures the contact potential difference between surfaces at the nano-scale. The combination of KPFM with AFM allows for the simultaneous generation of surface potential and topographical maps of biological samples such as bacterial cells. Here, we employ KPFM to examine the effects of surface potential on microbial adhesion to medically relevant surfaces such as stainless steel and gold. Surface potential maps revealed differences in surface potential for microbial membranes on different material substrates. A step-height graph was generated to show the difference in surface potential at a boundary area between the substrate surface and microorganisms. Changes in cellular membrane surface potential have been linked with changes in cellular metabolism and motility. Therefore, KPFM represents a powerful tool that can be utilized to examine the changes of microbial membrane surface potential upon adhesion to various substrate surfaces. In this study, we demonstrate the procedure to characterize the surface potential of individual methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA100 cells on stainless steel and gold using KPFM.

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

משטח מדידת פוטנציאל של חיידקים באמצעות קלווין Probe מיקרוסקופית כוח

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of exosomes to determine if they carry disease discriminatory biomarkers. For performing exosomal analysis, it is necessary to develop a method for extracting and analyzing exosomes from target biofluids without damaging the internal content.
Electric field-induced release and measurement (EFIRM) is a method for specifically extracting exosomes from biofluids, unloading their cargo, and testing their internal RNA/protein content. Using an anti-human CD63 specific antibody magnetic microparticle, exosomes are first precipitated from biofluids. Following extraction, low-voltage electric cyclic square waves (CSW) are applied to disrupt the vesicular membrane and cause cargo unloading. The content of the exosome is hybridized to DNA primers or antibodies immobilized on an electrode surface for quantification of molecular content.
The EFIRM method is advantageous for extraction of exosomes and unloading cargo for analysis without lysis buffer. This method is capable of performing specific detection of both RNA and protein biomarker targets in the exosome. EFIRM extracts exosomes specifically based on their surface markers as opposed to size-based techniques.
Transmission electron microscopy (TEM) and assay demonstrate the functionality of the method for exosome capture and analysis. The EFIRM method was applied to exosomal analysis of 9 mice injected with human lung cancer H640 cells (a cell line transfected to express the exosome marker human CD63-GFP) in order to test their exosome profile against 11 mice receiving saline controls. Elevated levels of exosomal biomarkers (reference gene GAPDH and protein surface marker human CD63-GFP) were found for the H640 injected mice in both serum and saliva samples. Furthermore, saliva and serum samples were demonstrated to have linearity (R = 0.79). These results are suggestive for the viability of salivary exosome biomarkers for detection of distal diseases.

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement EFIRM

Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.

איתור של Exosomal ביומרקר על ידי שחרור מושרה שדה חשמלי ומדידה (EFIRM)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of ...

Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. Single muscle fiber studies are useful in both basic science and clinical studies. For basic studies, single muscle fiber contractility measurements allow investigation of fundamental mechanisms of force production, and analysis of muscle function in the context of genetic manipulations. Clinically, single muscle fiber studies provide useful insight into the impact of injury and disease on muscle function, and may be used to guide the understanding of muscular pathologies. In this video article we outline the steps required to prepare and isolate an individual skeletal muscle fiber segment, attach it to force-measuring apparatus, activate it to produce maximum isometric force, and estimate its cross-sectional area for the purpose of normalizing the force produced.

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. In this article we outline a valid and reliable technique to prepare and test permeabilized skeletal muscle fibers in vitro.

מדידה המרבית איזומטרי הכוח שנוצרה על ידי סיבי שריר שלד permeabilized

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to intrinsic parameters within the process allow a high degree of control over scaffold characteristics including fiber diameter, alignment and porosity. By developing scaffolds with similar dimensions and topographies to organ- or tissue-specific extracellular matrices (ECM), micro-environments representative to those that cells are exposed to in situ can be created. 
The airway bronchiole wall, comprised of three main micro-environments, was selected as a model tissue. Using decellularized airway ECM as a guide, we electrospun the non-degradable polymer, polyethylene terephthalate (PET), by three different protocols to produce three individual electrospun scaffolds optimized for epithelial, fibroblast or smooth muscle cell-culture. Using a commercially available bioreactor system, we stably co-cultured the three cell-types to provide an in vitro model of the airway wall over an extended time period.
This model highlights the potential for such methods being employed in in vitro diagnostic studies investigating important inter-cellular cross-talk mechanisms or assessing novel pharmaceutical targets, by providing a relevant platform to allow the culture of fully differentiated adult cells within 3D, tissue-specific environments.

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall.

התאמת תהליך Electrospinning לספק שלוש סביבות ייחודיות לTri-שכבתי<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של חומת Airway

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

הנדסת רקמות ידי עצמותי כלי דם בתוך<em&gt; In vivo</em&gt; הנדסת רקמות קאמרית

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Site-Directed Immobilization of Bone Morphogenetic Protein 2 to Solid Surfaces by Click Chemistry

Different therapeutic strategies for the treatment of non-healing long bone defects have been intensively investigated. Currently used treatments present several limitations that have led to the use of biomaterials in combination with osteogenic growth factors, such as bone morphogenetic proteins (BMPs). Commonly used absorption or encapsulation methods require supra-physiological amounts of BMP2, typically resulting in a so-called initial burst release effect that provokes several severe adverse side effects. A possible strategy to overcome these problems would be to covalently couple the protein to the scaffold. Moreover, coupling should be performed in a site-specific manner in order to guarantee a reproducible product outcome. Therefore, we created a BMP2 variant, in which an artificial amino acid (propargyl-L-lysine) was introduced into the mature part of the BMP2 protein by codon usage expansion (BMP2-K3Plk). BMP2-K3Plk was coupled to functionalized beads through copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC). The biological activity of the coupled BMP2-K3Plk was proven in vitro and the osteogenic activity of the BMP2-K3Plk-functionalized beads was proven in cell based assays. The functionalized beads in contact with C2C12 cells were able to induce alkaline phosphatase (ALP) expression in locally restricted proximity of the bead. Thus, by this technique, functionalized scaffolds can be produced that can trigger cell differentiation towards an osteogenic lineage. Additionally, lower BMP2 doses are sufficient due to the controlled orientation of site-directed coupled BMP2. With this method, BMPs are always exposed to their receptors on the cell surface in the appropriate orientation, which is not the case if the factors are coupled via non-site-directed coupling techniques. The product outcome is highly controllable and, thus, results in materials with homogeneous properties, improving their applicability for the repair of critical size bone defects.

Biomaterials doped with Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP2) have been used as a new therapeutic strategy to heal non-union bone fractures. To overcome side effects resulting from an uncontrollable release of the factor, we propose a new strategy to site-directly immobilize the factor, thus creating materials with improved osteogenic capabilities.

האתר מכוון הנייח של עצם Morphogenetic חלבון 2 משטחים מוצקים על ידי לחץ על כימיה

Different therapeutic strategies for the treatment of non-healing long bone defects have been intensively investigated. Currently used treatments present ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.