Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la biología de los macrófagos y las células dendríticas sobre la localización subcelular y la dinámica de varias proteínas en estos tipos celulares. Las principales ventajas de esta técnica son que es relativamente simple, económica y demuestra una mejor eficiencia y estabilidad de expresión que la mayoría de los otros métodos disponibles. Demostrando el procedimiento estará Jarmila Kralova, una estudiante de posgrado de mi laboratorio.
Para producir el retrovirus, vajilla una suspensión monocelular de células de Platinum Eco-packaging en un plato petri de 10 centímetros y cultive las células en 15 mililitros de DMEM, complementado con un 10% de suero bovino fetal, o FBS, hasta que el cultivo sea de 50 a 60% confluente. Al día siguiente, añadir 20 microgramos de la construcción retroviral de interés y 10 microgramos de vector de eco-envasado PCL a 1 mililitro de DMEM sin suero, con mezcla suave. Añadir 75 microlitros de PEI en 1 mililitro de DMEM sin suero y antibióticos a un segundo tubo para una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente, y mezclar el contenido de ambos tubos para una incubación adicional de 10 minutos a temperatura ambiente.
A continuación, reemplace cuidadosamente el medio en las células Platinum Eco con 8 mililitros de DMEM fresco de 37 grados Celsius complementados con 2%FBS y agregue cuidadosamente la mezcla de transfección en gotas a la placa. Después de una incubación de 4 horas a 37 grados centígrados, reemplace el sobrenadante con 10 mililitros de DMEM de 37 grados Celsius, complementado con 10%FBS para una incubación de 24 horas a 37 grados centígrados. Al día siguiente, utilice una pipeta de 5 mililitros para transferir el sobrenadante retroviral retroviral que contiene partículas ecotrópica a un tubo centrífugo de 15 mililitros y eliminar los desechos y las células que contienen por centrifugación.
Mientras tanto, añadir 10 mililitros de 37 grados Celsius DMEM más 10%FBS al plato de cultivo para otra incubación de 24 horas a 37 grados Celsius y recoger una segunda ronda de partículas virales como acaba de demostrar. Para cosechar la médula ósea, en una capucha de cultivo de tejido, utilice pinzas y tijeras para eliminar la piel y parte de los músculos de las extremidades posteriores y desalojar cuidadosamente el acetábulo de la articulación de la cadera sin romper el fémur. Cortar las patas en las articulaciones del tobillo y rociar los huesos con 70%etanol.
Luego retire el resto del músculo con una toalla de papel y coloque los huesos en un plato petri de 5 centímetros de PBS complementado con 2%FBS. A continuación, dobla la articulación de la rodilla de cada conjunto óseo y separa cuidadosamente los huesos con tijeras. Utilice las tijeras para extraer de uno a dos milímetros de cada epifísis de un hueso y utilice una jeringa de dos o cinco mililitros equipada con una aguja de calibre 30 cargada con PBS fresco más FBS para vaciar la médula ósea de ambos extremos del hueso en un tubo centrífugo de 15 mililitros.
Cuando la médula se ha recogido de cada uno de los huesos, pele el gestion de las células óseas por centrifugación y vuelva a suspender el pellet en 2,5 mililitros de tampón de lysis de glóbulos rojos durante dos a tres minutos a temperatura ambiente. Después de la lesión, filtre las células a través de un colador celular de 100 micrómetros en un nuevo tubo centrífuga de 15 mililitros y restaure la tenacidad con 12 mililitros de PBS más FBS. Re-suspender el pellet en DMEM, complementado con 10%FBS y antibióticos para el conteo y placa de cinco a 10 veces 10 a la sexta célula de médula ósea en un 10 centímetros, cultivo no tejido tratado petri en 10 mililitros de DMEM complementado con suero y factor estimulante de colonia de macrófagos, o MCSF.
En el quinto día de cultivo, incline cuidadosamente el plato de cultivo celular y retire todos los mililitros de medio, excepto aproximadamente, de la superficie cerca del borde del plato. Luego agregue 20 mililitros de medio fresco de 37 grados Celsius complementados con FBS y MCSF al plato y devuelva las células a la incubadora de cultivo celular. Para cosechar las células, en el día seis a siete, retire todas las células medianas y flotantes y lave el cultivo con 37 grados Celsius PBS.
Separe las células adherentes con cinco mililitros de 0.02%EDTA y PBS durante tres a cinco minutos a 37 grados Celsius en la incubadora de cultivo de tejido y use una pipeta de cinco mililitros para lavar suavemente las células disociadas del fondo de la placa. Luego transfiera las células a un tubo centrífugo de 50 mililitros que contenga 25 mililitros de PBS fresco. Para inducir la expresión de proteínas etiquetadas por EGFP en células que presentan antígenos derivados de la médula ósea, al principio del protocolo de diferenciación celular, diluir las células de la médula ósea a una de dos a cinco veces 10 a las sextas células por mililitros de DMEM más FBS y la coninación de antibióticos y placar las células de un mililitro de medio por pozo, complementadas con la citoquina de diferenciación adecuada.
Después de cuatro a seis horas en la incubadora de cultivo celular, añadir dos mililitros de la primera ronda de virus recogidos complementados con polibreno y transducir los cultivos celulares por centrifugación y una incubación de cuatro horas en la incubadora de cultivo celular. Al final del período de transducción, transfiera las células no adherentes de cada pozo a tubos centrífugos individuales de 15 mililitros y recoja las células por centrifugación. Si se necesita una mayor cantidad de células, las células pueden ser infectadas con el mismo constituido en múltiples pozos y agrupados antes de la diferenciación.
Luego re-suspende los pellets en 10 mililitros de medio de cultivo complementados con la citoquina de diferenciación apropiada y placar las células en un 10 centímetros no tejido cultivo tratado petri plato por tubo, para su cultivo de seis a ocho días, como acaba de demostrar. La evaluación de la eficacia de la transfección Platinum Eco por citometría de flujo después de la recogida del segundo virus que contiene sobrenadato revela una eficiencia media de transfección del 62% para PSTPIP2-EGFP y del 53% para OPAL1-EGFP. La transducción retroviral no afecta al estado de diferenciación de las células derivadas de la médula ósea con más del 90% de las células en ambos cultivos que demuestran positividad para sus respectivos marcadores después de la transducción con cualquiera de los dos virus.
Y con los cambios morfológicos apropiados y característicos observados para ambos tipos de células diferenciadas. Cabe destacar que la expresión general de EGFP fue menor en los cultivos celulares dendríticos derivados de la médula ósea en comparación con la expresión de EGFP de macrófagos derivados de la médula ósea, independientemente del tipo de retrovirus. Al intentar este procedimiento, es importante recordar el uso de platos plásticos no tejidos, tratados con cultivos que se utilizan normalmente para el cultivo de bacterias si planea eliminar las células del plato para el experimento.
Después de este procedimiento, se pueden emplear otros métodos de imágenes de células vivas, microscopía de superrescía u otros tipos de microscopía para responder preguntas adicionales sobre la localización subcelular y la dinámica de las proteínas de celda dendrítica y macrófagos de interés. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la inmunología exploraran la distribución y las relaciones espaciales de las proteínas expresadas por macrófagos y células dendríticas y en promover nuestra comprensión de la función de estas proteínas durante las respuestas inmunitarias. No olvide que trabajar con partículas virales puede ser extremadamente peligroso y que las precauciones, como la minimización de la generación de aerosoles, el uso de equipos de protección y el uso de una capucha de flujo laminar, siempre deben tomarse durante la realización de este procedimiento.
