Questo lavoro è stato finanziato dal NIH R01EY020560-01 e da uno studioso WM Keck Young Award ricerca medica. Gli autori desiderano ringraziare Giuseppe Bedont per la sua assistenza durante l&#39;imaging di preparati della retina e iniezioni.

1. Preparazione plasmide per l&#39;elettroporazione La concentrazione del DNA necessario per elettroporazione è 5μg/μl. Ciò richiede in genere i plasmidi desiderato di essere amplificato utilizzando un maxi-prep (Qiagen) o metodo equivalente seguita da una purificazione e concentrazione del DNA per la quantità di lavoro. Di seguito viene descritto la preparazione del DNA per la quantità di lavoro. <ol><li> Aliquota 100 mg di DNA (da maxi-prep o equivalente) e diluire il volume di 100 l per la facilità di manipolazione. </li><li> Aggiungi fenolo, la quantità di fenolo deve essere calcolata per ottenere un circa 60% di DNA / volume (mg DNA: volume totale), cioè: 100 mg di DNA (in 100 mL), più 67 microlitri fenolo (100 mcg: 167 mL). Mescolare accuratamente, non pipettare su e giù come questo può causare un eccessivo taglio del DNA. </li><li> Spin il DNA per 5 minuti a 14000 rpm a temperatura ambiente. </li><li> Raccogliere il supernatante e aggiungere cloroformio con lo stesso DNA: rapporto tra volume totale al punto 1.2; mix come descritto al punto 1.2 e girano a 14000 rpm per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Raccogliere il surnatante, aggiungere il 10% del volume surnatante di 3 acetato di sodio M per la soluzione di DNA, mescolare delicatamente e aggiungere 2,5 volte il volume surnatante del 100% di etanolo. Mescolare per inversione. DNA dovrebbe precipitare dalla soluzione durante la miscelazione. </li><li> Spin il DNA a 4 ° C per 10 minuti a 14000 RPM. </li><li> Sciacquare con 350 ml di etanolo al 70%, girano a 14000 rpm per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Aria secca il pellet poi sciogliere il DNA in 1 X PBS (biologia grado Cell) a 5μg/μL. Non asciugare eccessivamente il campione in quanto ciò rende molto difficile da sciogliere in PBS. </li><li> Aggiungi veloce colorante verde (10% azioni) per la soluzione di DNA, la concentrazione finale di tintura è 0,1%, di agire come un tracciante di iniezione. </li></ol> 2. Iniezione sottoretinica del DNA Le seguenti operazioni vengono eseguite con l&#39;assistenza di uno stereomicroscopio. Una volta praticato il processo di apertura degli occhi, incisione, e l&#39;iniezione richiede meno di 1,5 minuti che non c&#39;è abbastanza tempo per un cucciolo adeguatamente anestetizzato per recuperare. Utilizzando un acuto da 30 gauge, aprire con cautela l&#39;occhio dal taglio lungo l&#39;epitelio giunzionale fuso (Fig. 1C). Non applicare eccessiva forza poiché ciò potrebbe comportare il taglio degli occhi sottostante. Evitare di tagliare oltre il campo della giunzione palpebra come questo si tradurrà in sanguinamento che può oscurare l&#39;iniezione. <ol><li> Anestetizzare i topi appena nati in ghiaccio per alcuni minuti (Fig. 1A), non seppellire cuccioli nel ghiaccio in quanto ciò potrebbe provocare la mortalità. Il periodo di tempo sul ghiaccio è variabile da cucciolo a cucciolo, di solito 5 minuti è sufficiente, ma i topi devono essere attentamente monitorati come individui possono rispondere molto rapidamente o potrebbe richiedere l&#39;esposizione più appropriata per garantire l&#39;anestesia. Condurre un pizzico zampa con hemostats per verificare la reflex ritiro. </li><li> Al fine di facilitare l&#39;iniezione di DNA nello spazio sottoretinico dell&#39;occhio deve prima essere aperto. Tampone l&#39;occhio da iniettare con un 70% di alcool isopropilico preparazione (Tyco Healthcare) e identificare l&#39;epitelio giunzionale fusa dove le due palpebre si uniscono (Fig. 1B). </li><li> Utilizzando un acuto da 30 gauge, aprire con cautela l&#39;occhio dal taglio lungo l&#39;epitelio giunzionale fuso (Fig. 1C). Non applicare eccessiva forza poiché ciò potrebbe comportare il taglio degli occhi sottostante. Evitare di tagliare oltre il campo della giunzione palpebra come questo si tradurrà in sanguinamento che può oscurare l&#39;iniezione. </li><li> Per facilitare la penetrazione dell&#39;occhio con l&#39;ago smussato iniezione concluso utilizzare la punta di un 30-ago spessore e trattati fare una piccola incisione nella sclera in prossimità dell&#39;incrocio con la cornea (Fig. 1E). Non penetrano troppo profondamente in quanto ciò può causare una foratura della lente. </li><li> Disegna 0,3 ml di soluzione di DNA in un ago da 33 gauge smussato iniezione conclusa con i gradienti siringa per misurare il volume singolarmente per ogni iniezione (ago diametro esterno 0,52 millimetri, diametro interno 0,13 millimetri; Exmire microsiringa; Ito corp). Inserire l&#39;ago nel incisione fino alla resistenza del muro avversario sclerale si fa sentire. Fare attenzione a non penetrare l&#39;obiettivo, l&#39;ago è passato attraverso la camera vitreale (Fig. 2B). </li><li> Iniettare lentamente 0,3 ml di soluzione di DNA nello spazio sottoretinico con il dito indice o pollice per premere lo stantuffo della siringa. Lo sperimentatore deve essere attenti a controllare la velocità del pistone depressione in modo che la velocità con cui viene iniettata la soluzione di DNA nello spazio sottoretinico non supererà il tasso a cui la soluzione di DNA si diffonde all&#39;interno di spazio sottoretinico (Fig. 2C). La soluzione di DNA è viscoso ed è quindi importante che l&#39;ago non viene premuto troppo stretto contro il muro avversario sclerale in quanto ciò potrebbe comportare il DNA non essere iniettati o non diffondere in modo uniforme. Una iniezione di successo si tradurrà in un ancoradiffusione della soluzione di DNA in una porzione di spazio sottoretinico. Regioni della retina con e senza base tracciante verde dovrebbe essere evidente durante la rotazione l&#39;animale iniettato. </li></ol> 3. Elettroporazione <ol><li> Elettroporazione viene eseguita utilizzando un elettrodo di diametro 10 millimetri pinzetta (Model # 522; Instruments BTX). Immergere l&#39;elettrodo pinzetta in PBS in modo da massimizzare la conduttività elettrica dall&#39;elettrodo per l&#39;animale e posizionare la testa del cucciolo iniettato tra gli elettrodi con l&#39;occhio iniettato adiacente alla elettrodo polo positivo e il non-iniettati occhio adiacente al polo negativo elettrodo (Fig. 3B). </li><li> Applicare cinque impulsi quadrati utilizzando un generatore di impulsi: ogni impulso è di 80 volt e 50 millisecondi di durata con un intervallo di 950 millisecondi tra gli impulsi. </li><li> I cuccioli elettroporate deve ora essere scaldato fino a riprendersi dalla anestesia ghiaccio. Questo può essere fatto mettendo i cuccioli sotto una lampada riscaldamento o sulla cima di una diapositiva più caldo. Se si utilizza una diapositiva più caldo in modo che un pad appropriato è posto tra la superficie metallica e il cucciolo di recupero. Al recupero di ritorno i cuccioli elettroporate alla loro madre. </li></ol> 4. Preparazione degli occhi per l&#39;analisi <ol><li> Il momento della raccolta e analisi delle retine elettroporate viene eseguita nel rispetto degli obiettivi dell&#39;esperimento. Espressione GFP può essere grossolanamente visualizzati 3 giorni dopo l&#39;elettroporazione. Per cryoembedding e sezionamento procedere come segue. </li><li> Sacrificio degli animali elettroporate al timepoint desiderato. Disect l&#39;occhio elettroporate e fissare in paraformaldeide 4% a 4 ° C per 50 minuti. </li><li> Rimuovere con attenzione la retina dall&#39;occhio di micro-dissezione via la sclera, cornea, cristallino, retina e coroide epitelio pigmentato. La retina dissezionato può essere analizzato sotto fluorescenza per determinare l&#39;efficienza della grossolanamente elettroporazione. Trasferire la retina di soluzione di saccarosio 30% di notte a 4 ° C. </li><li> Congelare retine in ottobre crio-mezzi di inclusione (Sakura Finetek USA) e conservare a -80 ° C. Retine possono ora essere sezionato in un cryotome e catturato su vetrini. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: Esempi di P0 retine neonatale elettroporate con un pCAG-EGFP plasmide di espressione sono presentati in 3 giorni successivi elettroporazione (P3) e 14 giorni dopo elettroporazione (P14) in figura 4. L&#39;area di tessuto retinico elettroporate è variabile da esperimento a esperimento a seconda della entità del danno tessutale sostenute durante l&#39;iniezione e l&#39;uniformità della diffusione della soluzione di DNA nello spazio sottoretinico. Tipicamente 90-100% della retina elettroporate sarà caratterizzato da cellule che hanno incorporato con successo e hanno espresso il plasmide introdotto. Tuttavia, se si considera la morfologia del tessuto e di efficienza elettroporazione solo il 40-60% delle retine elettroporate sarà adatto per l&#39;analisi comparativa. Formazione rosetta e distacco della retina nel sito di puntura è quasi sempre osservato e questa regione non deve essere utilizzato per l&#39;analisi. DNA successo diffuso durante i risultati microiniezione nel tessuto in modo efficiente elettroporate laterale al sito di puntura libero da rosette e distacco. Gliosi è anche una preoccupazione importante sperimentale e quasi sempre si verifica nel sito di puntura. Tuttavia, come con la formazione rosetta e distacco di retina, gliosi non è in genere significativa nel tessuto lateralmente elettroporate. Marcatori immunoistochimici quali proteina acidica fibrillare gliale (GFAP) può essere utilizzato per determinare se i livelli di gliosi reattiva nelle regioni analizzate rientrano nella soglie accettabili. Retine sezionato dimostrando che la morfologia della retina elettroporate rimane intatto e che le etichette espressione EGFP singole cellule elettroporate sono presentati. Esempi 3 giorni a seguito di un elettroporazione P0 (Fig. 4A-C) e 14 giorni a seguito di un elettroporazione P0 (Fig. 4D-F) sono presentati. In retine P3 la maggioranza delle cellule elettroporate si trovano nello strato neuroblastiche (NBL) della retina, e non dimostrare distinte caratteristiche morfologiche di una qualsiasi delle cellule differenziate neurali o gliale della retina (Fig. 4B, C). Da cellule P14 elettroporate si trovano nello strato nucleare esterno (ONL) e lo strato interno nucleare (INL) della retina. Inoltre le varie cellule etichettate ora visualizzare caratteristica caratteristiche morfologiche dei neuroni differenziati tra interneuroni della INL, fotorecettori, e glia Müller (Fig. 4E, F). <img src="/files/ftp_upload/2847/2847fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Anestesia di un neonato (P0) topo cucciolo e apertura dell&#39;occhio per l&#39;iniezione sottoretinica di soluzione di DNA. A) cucciolo neonatale immessi sulun letto di ghiaccio tritato per anestesia. Occhio da iniettare viene posizionato in basso contro il ghiaccio. B) La posizione del fuso epitelio giunzionale (B, freccia) delle palpebre da tagliare per l&#39;apertura degli occhi. C) Taglio delle palpebre lungo l&#39;epitelio giunzionale fusa (C, freccia) per esporre l&#39;occhio. D) L&#39;occhio aperto dopo il taglio a livello della giunzione fuso. E) L&#39;incisione è fatta nell&#39;occhio sotto della sclera sotto la cornea per facilitare l&#39;inserimento facile del conclusa micro-iniezione siringa smussato. Barre di scala, B, C, D, E: 4mm. <img src="/files/ftp_upload/2847/2847fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Inserimento Figura 2. Smussato fine del micro-iniezione siringa e l&#39;iniezione di soluzione di DNA plasmide nello spazio sottoretinico. A) Schema Cartoon dimostrando il corretto inserimento della siringa di iniezione micro nell&#39;occhio e la liquidazione delle siringa nello spazio sottoretinico. L&#39;iniezione di soluzione di DNA nella camera vitrea, il passaggio della siringa attraverso l&#39;occhio nella presa, o iniezione nella lente si tradurrà in esperimenti falliti con poche o nessuna cellule elettroporate. B) La penetrazione della siringa nel incisione nella parete sclerale e la liquidazione delle siringa nello spazio sottoretinico. C) L&#39;iniezione di soluzione di DNA nello spazio sottoretinico. Barre di scala, B, C: 4mm. Abbreviazioni come segue: R-retina, L-lente, V-vitreo, SRS-sottoretinica spazio, BES-smussato conclusa siringa. <img src="/files/ftp_upload/2847/2847fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Orientamento dell&#39;elettrodo pinzetta sul mouse per elettroporazione. A) Schema Cartoon dimostrando l&#39;orientamento delle pale positivi e negativi degli elettrodi pinzetta relativa ad occhio elettroporate. Verde rappresenta la posizione del DNA iniettato nello spazio sottoretinico. Frecce tratteggiate rappresentano il movimento di carica negativa elettroforetica del DNA iniettato verso l&#39;elettrodo positivo. Elettroforesi del DNA avviene da spazio sottoretinico adiacente l&#39;elettrodo negativo nella retina, che è orientata verso l&#39;elettrodo positivo. B) La pagaia positivo della pinzetta è posizionato accanto al DNA microiniettati occhio e la pagaia negativo è posizionato adiacente alla non-iniettati occhi. C) l&#39;immagine Alto ingrandimento posizionamento dell&#39;elettrodo pinzetta sul mouse neonatale. Linee tratteggiate rappresentano la direzione del movimento elettroforetica del DNA verso l&#39;elettrodo positivo. Scala grafica, C: 5 mm. <img src="/files/ftp_upload/2847/2847fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Neonatale del mouse retina (P0) elettroporate con pCAG-EGFP e analizzati al giorno postnatale 3 (P3) e il giorno dopo la nascita 14 (P14). AC) immagini confocale di una retina P3 sezionato elettroporate con pCAG-EGFP a P0. La maggior parte delle cellule elettroporate siedono nello strato retinico neuroblastiche (NBL). (DF) immagini confocale di un sezionato P14 retina elettroporate con pCAG-EGFP a P0. Elettroporate cellule possono essere identificati nello strato nucleare esterno (ONL) e lo strato interno nucleare (INL) della retina. Bar scala, AF: 50 micron.

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	<li>Neumann, E., Rosenheck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+changes+induced+by+electric+impulses+in+vesicular+membranes.">Permeability changes induced by electric impulses in vesicular membranes.</a> J. Membr. Biol. 10, 279-290 (1972).</li><li>Turnbull, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Letter:+Letter:+An+alternate+explanation+for+the+permeability+changes+induced+by+electrical+impulses+in+vesicular+membranes.">Letter: Letter: An alternate explanation for the permeability changes induced by electrical impulses in vesicular membranes.</a> J. Membr. Biol. 14, 193-196 (1973).</li><li>Zimmermann, U., Schulz, J., Pilwat, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcellular+ion+flow+in+Escherichia+coli+B+and+electrical+sizing+of+bacterias.">Transcellular ion flow in Escherichia coli B and electrical sizing of bacterias.</a> Biophys. J. 13, 1005-1013 (1973).</li><li>Kinosita, K., Tsong, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-induced+pore+formation+and+hemolysis+of+human+erythrocytes.">Voltage-induced pore formation and hemolysis of human erythrocytes.</a> Biochim. Biophys. Acta. 471, 227-242 (1977).</li><li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields.">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO J. 1, 841-845 (1982).</li><li>Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparking+new+frontiers:+using+in+vivo+electroporation+for+genetic+manipulations.">Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations.</a> Dev. Biol. 233, 13-21 (2001).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 16-22 (2004).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation.">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 1027-1032 (2007).</li><li>Onishi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pias3-dependent+SUMOylation+directs+rod+photoreceptor+development.">Pias3-dependent SUMOylation directs rod photoreceptor development.</a> Neuron. 61, 234-246 (2009).</li><li>Onishi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+orphan+nuclear+hormone+receptor+ERRbeta+controls+rod+photoreceptor+survival.">The orphan nuclear hormone receptor ERRbeta controls rod photoreceptor survival.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 11579-11584 (2010).</li><li>Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Core+Paired-Type+and+POU+Homeodomain-Containing+Transcription+Factor+Program+Drives+Retinal+Bipolar+Cell+Gene+Expression.">A Core Paired-Type and POU Homeodomain-Containing Transcription Factor Program Drives Retinal Bipolar Cell Gene Expression.</a> J. Neurosci. 28, 7748-7764 (2008).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Elettroporazione in vivo rappresenta un metodo rapido ed efficiente per la trasformazione delle cellule della retina con plasmidi di espressione del DNA. Questo metodo permette di effettuare lo sperimentatore guadagno di studi funzione ectopica l&#39;introduzione di un gene di interesse sotto il controllo di un promotore ubiquitariamente espressa o per effettuare la perdita di studi di funzione utilizzando i costrutti shRNA targeting dei geni di interesse. Inoltre, i plasmidi di DNA multipli possono essere elet...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> Buffer saturi fenolo </td><td> Invitrogen </td><td> 15513-039 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Cloroformio </td><td> JT Baker </td><td> 9180-03 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Di sodio acetato </td><td> JT Baker </td><td> 3470-05 </td><td> 3 M magazzino </td></tr><tr><td> Verde fast FCF </td><td> Fisher Biotech </td><td> BP123-10 </td><td> 10% di magazzino </td></tr><tr><td> Alcool isopropilico prep </td><td> Tyco Healthcare </td><td> 6918 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 30-ago spessore e trattati </td><td> Terumo Medical Corp. </td><td> SG2-3013 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Exmire microsiringa </td><td> Ito Corporation </td><td> MS * E05 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Tweezertrode (elettrodo pinzetta) </td><td> BTX strumento, Genetronics Inc. </td><td> 522 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Electro Piazza Porator (elettroporatore) </td><td> BTX strumento, Genetronics Inc. </td><td> ECM 830 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Ottobre Compound </td><td> Sakura Finetek USA </td><td> 4583 </td><td> N / A </td></tr></tbody></table>

in vivo electroporation of developing mouse retina

La caratterizzazione funzionale di geni espressi durante lo sviluppo della retina dei mammiferi rimane una sfida significativa. Gene targeting per generare la perdita costitutivo o condizionale di knockouts funzione rimane costi e manodopera, oltre che in termini di tempo. Aggiungendo a queste sfide, retina espresso geni possono avere ruoli fondamentali al di fuori della retina che porta alla confonde involontaria quando si utilizza un approccio ad eliminazione diretta. Inoltre, la capacità di esprimere ectopica di un gene in un guadagno di esperimento funzione può essere estremamente utile quando si cerca di identificare un ruolo nella determinazione del fato cellulare e / o di differenziazione terminale. Vi presentiamo un metodo per l&#39;inserimento rapido ed efficiente di plasmidi DNA nella retina topo neonatale mediante elettroporazione. L&#39;applicazione di impulsi elettrici brevi risultati di sopra di una certa intensità di campo in un aumento transitorio della permeabilità della membrana plasmatica, agevolando il trasferimento di materiale attraverso la membrana 1,2,3,4. Lavoro pionieristico ha dimostrato che l&#39;elettroporazione potrebbe essere utilizzato come metodo di trasferimento genico in cellule di mammifero inducendo la formazione di pori della membrana plasmatica consentendo il passaggio di DNA altamente caricato attraverso il doppio strato lipidico 5. Continuo sviluppo tecnico, ha portato alla vitalità di elettroporazione come metodo di trasferimento genico in vivo nei tessuti di topo multiple, tra cui la retina, il metodo per il quale è qui descritto 6, 7, 8, 9, 10. Soluzione di DNA viene iniettato nello spazio sottoretinico in modo che il DNA si trova tra l&#39;epitelio pigmentato retinico e della retina neonatale (P0) del mouse e impulsi elettrici sono applicati utilizzando un elettrodo pinzetta. Il posizionamento laterale degli occhi nel topo permette la facile orientamento dell&#39;elettrodo pinzetta per le necessarie polo negativo-DNA-positiva retina allineamento palo. Incorporazione vasta ed espressione di geni trasferiti possono essere identificati per giorno post-natale 2 (P2). A causa della mancanza di significative migrazione laterale delle cellule della retina, le regioni elettroporate e non elettroporate vengono generati. Non elettroporate regioni possono servire come controlli interni istologici, se del caso. Elettroporazione della retina possono essere usate per esprimere un gene con un promotore ubiquitario, come CAG, o di distruggere la funzione del gene utilizzando costrutti shRNA o Cre-ricombinasi. Espressione più mirata può essere raggiunto attraverso la progettazione costruisce con i promotori dei geni cellulari specifici. Visualizzazione di cellule elettroporate si ottiene utilizzando i costrutti bicistronic esprimono GFP o da co-electroporating un&#39;espressione GFP costrutto. Inoltre, costruisce multiple possono essere elettroporate per lo studio degli effetti gene combinatoria o aumento simultaneo e la perdita di funzione di geni diversi. Elettroporazione retina può anche essere utilizzato per l&#39;analisi di genomica cis-normativo elementi generando costruisce espressione appropriata e mutanti di delezione. Tali esperimenti possono essere usati per identificare le regioni sufficienti o necessari per l&#39;espressione genica delle cellule specifiche 11 cis-normativo. Esperimenti potenziali sono limitati solo dalla disponibilità di costruire.

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In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

Un metodo per l&#39;incorporazione di DNA plasmidico in cellule murine della retina allo scopo di effettuare sia guadagno o la perdita di studi di funzione<em&gt; In vivo</em&gt; È presentato. Questo metodo sfrutta l&#39;aumento transitorio della permeabilità delle membrane plasmatiche delle cellule indotte con l&#39;applicazione di un campo elettrico esterno.

In elettroporazione in vivo di Retina topo in via di sviluppo

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

20.7K Views.  Johns Hopkins School of Medicine. Un metodo per l'incorporazione di DNA plasmidico in cellule murine della retina allo scopo di effettuare sia guadagno o la perdita di studi di funzione In vivo È presentato. Questo metodo sfrutta l'aumento transitorio della permeabilità delle membrane plasmatiche delle cellule indotte con l'applicazione di un campo elettrico esterno.

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Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Trasfezione delle cellule gangliari della retina di topo In vivo Elettroporazione

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

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Neuroscienze

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to cis-regulatory elements (CREs), short (&tilde;300-600 bp) stretches of genomic DNA which can lie upstream, downstream, or within the introns of the genes they control. CREs (i.e., enhancers/promoters) typically consist of multiple clustered binding sites for both transcriptional activators and repressors1-3. They serve as logical integrators of transcriptional input giving a unitary output in the form of spatiotemporally precise and quantitatively exact promoter activity. Most studies of mammalian cis-regulation to date have relied on mouse transgenesis as a means of assaying the enhancer function of CREs4-5. This technique is time-consuming, costly and, on account of insertion site effects, largely non-quantitative. On the other hand, quantitative assays for mammalian CRE function have been developed in tissue culture systems (e.g., dual luciferase assays), but the in vivo relevance of these results is often uncertain. 
Electroporation offers an excellent alternative to traditional mouse transgenesis in that it permits both spatiotemporal and quantitative assessment of cis-regulatory activity in living mammalian tissue. This technique has been particularly useful in the analysis of cis-regulation in the central nervous system, especially in the cerebral cortex and the retina6-8. While mouse retinal electroporation, both in vivo and ex vivo, has been developed and extensively described by Matsuda and Cepko6-7,9, we have recently developed a simple approach to quantify the activity of photoreceptor-specific CREs in electroporated mouse retinas10. Given that the amount of DNA that is introduced into the retina by electroporation can vary from experiment to experiment, it is necessary to include a co-electroporated 'loading control' in all experiments. In this respect, the technique is very similar to the dual luciferase assay used to quantify promoter activity in cultured cells. 
When assaying photoreceptor cis-regulatory activity, electroporation is usually performed in newborn mice (postnatal day 0, P0) which is the time of peak rod production11-12. Once retinal cell types become post-mitotic, electroporation is much less efficient. Given the high rate of rod birth in newborn mice and the fact that rods constitute more than 70% of the cells in the adult mouse retina, the majority of cells that are electroporated at P0 are rods. For this reason, rod photoreceptors are the easiest retinal cell type to study via electroporation. The technique we describe here is primarily useful for quantifying the activity of photoreceptor CREs.

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

This protocol describes a simple and inexpensive way to quantify the activity of cis-regulatory elements (i.e., enhancer/promoters) in living mouse retinas via explant electroporation. DNA preparation, retinal dissection, electroporation, retinal explant culture, and post-fixation analysis and quantification are described.

Quantificare le attività di Cis-Regolamentazione Elementi nella retina di topo Elettroporazione Espianto

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Mouse in Utero elettroporazione: controllato Transefection Gene spazio-temporale

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and the organ of Corti in the coiled cochlea. The cristae and maculae contain vestibular hair cells that transduce mechanical stimuli to subserve the special sense of balance, while auditory hair cells in the organ of Corti are the primary transducers for hearing 1. Cell fate specification in these sensory epithelia and morphogenesis of the semicircular canals and cochlea take place during the second week of gestation in the mouse and are largely completed before birth 2,3. Developmental studies of the mouse inner ear are routinely conducted by harvesting transgenic embryos at different embryonic or postnatal stages to gain insight into the molecular basis of cellular and/or morphological phenotypes 4,5. We hypothesize that gene transfer to the developing mouse inner ear in utero in the context of gain- and loss-of-function studies represents a complimentary approach to traditional mouse transgenesis for the interrogation of the genetic mechanisms underlying mammalian inner ear development6.
The experimental paradigm to conduct gene misexpression studies in the developing mouse inner ear demonstrated here resolves into three general steps: 1) ventral laparotomy; 2) transuterine microinjection; and 3) in vivo electroporation. Ventral laparotomy is a mouse survival surgical technique that permits externalization of the uterus to gain experimental access to the implanted embryos7. Transuterine microinjection is the use of beveled, glass capillary micropipettes to introduce expression plasmid into the lumen of the otic vesicle or otocyst. In vivo electroporation is the application of square wave, direct current pulses to drive expression plasmid into progenitor cells8-10. 
We previously described this electroporation-based gene transfer technique and included detailed notes on each step of the protocol11. Mouse experimental embryological techniques can be difficult to learn from prose and still images alone. In the present work, we demonstrate the 3 steps in the gene transfer procedure. Most critically, we deploy digital video microscopy to show precisely how to: 1) identify embryo orientation in utero; 2) reorient embryos for targeting injections to the otocyst; 3) microinject DNA mixed with tracer dye solution into the otocyst at embryonic days 11.5 and 12.5; 4) electroporate the injected otocyst; and 5) label electroporated embryos for postnatal selection at birth. We provide representative examples of successfully transfected inner ears; a pictorial guide to the most common causes of otocyst mistargeting; discuss how to avoid common methodological errors; and present guidelines for writing an in utero gene transfer animal care protocol.

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mouse inner ear is a placode-derived sensory organ whose developmental program is elaborated during gestation. We define an in utero gene transfer technique consisting of three steps: mouse ventral laparotomy, transuterine microinjection, and in vivo electroporation. We use digital video microscopy to demonstrate the critical experimental embryological techniques.

Gene Transfer per l&#39;orecchio del mouse Sviluppo Inner<em&gt; In Vivo</em&gt; Elettroporazione

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for investigating the cell biology and development of central brain structures by allowing acute pharmacological interventions and live imaging of cellular processes. As an example of the technique, prior work from our lab1 has shown that a previously unrecognized subcellular compartment lies between the axonal and somatodendritic compartments of axons of the Drosophila central brain. The development of this compartment, referred to as the axon initial segment (AIS)2, was shown genetically to depend on the neuron-specific cyclin-dependent kinase, Cdk5. We show here that ex vivo treatment of wild-type Drosophila larval brains with the Cdk5-specific pharmacological inhibitors roscovitine and olomoucine3 causes acute changes in actin organization, and in localization of the cell-surface protein Fasciclin 2, that mimic the changes seen in mutants that lack Cdk5 activity genetically.
A second example of the ex vivo culture technique is provided for remodeling of the connections of embryonic mushroom body (MB) gamma neurons during metamorphosis from larva to adult. The mushroom body is the center of olfactory learning and memory in the fly4, and these gamma neurons prune their axonal and dendritic branches during pupal development and then re-extend branches at a later timepoint to establish the adult innervation pattern5. Pruning of these neurons of the MB has been shown to occur via local degeneration of neurite branches6, by a mechanism that is triggered by ecdysone, a steroid hormone, acting at the ecdysone receptor B17, and that is dependent on the activity of the ubiquitin-proteasome system6. Our method of ex vivo culturing can be used to interrogate further the mechanism of developmental remodeling. We found that in the ex vivo culture setting, gamma neurons of the MB recapitulated the process of developmental pruning with a time course similar to that in vivo. It was essential, however, to wait until 1.5 hours after puparium formation before explanting the tissue in order for the cells to commit irreversibly to metamorphosis; dissection of animals at the onset of pupariation led to little or no metamorphosis in culture. Thus, with appropriate modification, the ex vivo culture approach can be applied to study dynamic as well as steady state aspects of central brain biology.

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

This article describes a method by which one can mimic in vivo development of the Drosophila mushroom body in an ex vivo culture system.

Ex coltura vivo di Whole, in via di sviluppo Brains Drosophila

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

La manipolazione genetica del topo sviluppo dell&#39;ipotalamo attraverso<em&gt; In utero</em&gt; Elettroporazione

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenesis is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting of new blood vessels from a pre-existing vessel network. Angiogenesis plays a key role not only in normal development of organs and tissues, but also in many diseases in which blood vessel formation is dysregulated, such as cancer, blindness and ischemic diseases. In adult life, blood vessels are generally quiescent so angiogenesis is an important target for novel drug development to try and regulate new vessel formation specifically in disease. In order to better understand angiogenesis and to develop appropriate strategies to regulate it, models are required that accurately reflect the different biological steps that are involved. The mouse neonatal retina provides an excellent model of angiogenesis because arteries, veins and capillaries develop to form a vascular plexus during the first week after birth. This model also has the advantage of having a two-dimensional (2D) structure making analysis straightforward compared with the complex 3D anatomy of other vascular networks. By analyzing the retinal vascular plexus at different times after birth, it is possible to observe the various stages of angiogenesis under the microscope. This article demonstrates a straightforward procedure for analyzing the vasculature of a mouse retina using fluorescent staining with isolectin and vascular specific antibodies.

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

The neonatal murine retina provides a well characterized physiological model of angiogenesis, which permits investigations of the roles of different genes or drugs that modulate angiogenesis in an in vivo context. Immunofluorescent staining to accurately visualize the vascular plexus is pivotal to the success of these types of studies.

Tutta Monte immunofluorescenza del mouse Retina neonatale per Indagare Angiogenesi<em&gt; In vivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

In vivo postnatale elettroporazione e Time-lapse imaging di migrazione neuroblasti in mouse acuta Fette cervello

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Immagini dal vivo della mitosi in via di sviluppo embrionali di topo Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). It is increasingly being recognized that several neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis present elements of vascular compromise. In addition, the most prominent causes of blindness in pediatric and working age populations (retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy, respectively) are characterized by vascular degeneration and failure of physiological vascular regrowth. The aim of this technical paper is to provide a detailed protocol to study CNS vascular regeneration in the retina. The method can be employed to elucidate molecular mechanisms that lead to failure of vascular growth after ischemic injury. In addition, potential therapeutic modalities to accelerate and restore healthy vascular plexuses can be explored. Findings obtained using the described approach may provide therapeutic avenues for ischemic retinopathies such as that of diabetes or prematurity and possibly benefit other vascular disorders of the CNS.

The rodent retina has long been recognized as an accessible window to the brain. In this technical paper we provide a protocol that employs the mouse model of oxygen-induced retinopathy to study the mechanisms that lead to failure of vascular regeneration within the central nervous system after ischemic injury. The described system can also be harnessed to explore strategies to promote regrowth of functional blood vessels within the retina and CNS.

Assessment of Vascular rigenerazione nel SNC Utilizzo del Retina mouse

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

In elettroporazione in vivo di Retina topo in via di sviluppo

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