Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención 1R21NS064412, subvención NSF 1052048 y Jeffress Memorial Trust subvención J-908.

1. Preparación de la muestra Nota: En muchos casos, los experimentos de perfusión verterlo una porción significativa de las células, lo que puede convertirse en un problema frustrante. Aunque no es necesario para todas las líneas celulares, las superficies de vidrio cubierta de recubrimiento con poli-L-lisina (añadir 1,0 ml/25 cm 2 de solución de 0,01% de la superficie, incubar&gt; 5 min, se lava dos veces con agua de calidad de cultivo celular, y en seco la cabina de bioseguridad) mejora la adhesión celular. Además, tenga en cuenta el nivel de bioseguridad (BSL) de la línea celular utilizada, y siga el procedimiento operativo estándar aprobado por la oficina local de salud y seguridad ambiental. En este experimento, se utilizaron células Cos-7 debido a la baja actividad de transporte de glutamina endógena (véase la Figura 4). <ol><li> Células COS7 de semillas a ~ 70-80% de confluencia en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) + 10% de suero de ternera cósmica y 100 U / ml de penicilina / estreptomicina, ya sea en cubreobjetos de vidrio 25 mm estériles colocados en el cultivo de 6 pocillosplato o 8 pocillos diapositivas con fondo de cristal. Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2, 100% de humedad durante 24 horas. </li><li> Cambiar el medio de crecimiento a DMEM suero de ternera cósmica 10% (sin antibióticos), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Crecer O / N a 37 ° C, 5% de CO2 a 100% de humedad. </li><li> Añadir 0,4 mg de cada uno de ADN plásmido que codifica el sensor de glutamina (pcDNA3.1, llevando sensor de FLIPQTV3.0 bajo el promotor de CMV 10) y la ASCT2 mCherry-etiquetado 10 a 50 ml de medio libre de suero (OPTI-MEM) y mezclar suavemente. </li><li> Añadir 1 ml de reactivo de transfección a 50 ml de medio libre de suero. Incubar a TA durante 5 min. </li><li> Mezclar las dos soluciones que contienen ADN (paso 1.3) y reactivo de transfección (paso 1,4) y se incuba durante 20 min. </li><li> Añadir suavemente el reactivo de transfección en la parte superior de las células y mezclar suavemente oscilando la cámara. Incubar durante 24 horas a 37 ° C, 5% de CO 2, el 100% de humedad. </li><li> Después de 24 horas, cambiar el medio a DMEM + 10% de suero de ternera Cósmica(CCS) + 100 unidad de penicilina / estreptomicina. </li><li> Las células se crean imágenes de 48 a 72 horas después de la transfección. </li></ol> 2. Experimento de perfusión Nota: Para las células COS7 utilizados en este experimento, los medios de comunicación de perfusión y la cámara se mantuvieron a temperatura ambiente y ambiente concentración de CO 2. Sin embargo, si las células que están siendo utilizados requieren una temperatura más alta y CO 2 de control de concentración para la supervivencia, platina del microscopio calentado y / o una cámara ambiental debe ser utilizado. <ol><li> Preparar la perfusión AF tampón (Ver Lista de Materiales). Coloque las llaves de paso para jeringas de 50 ml, cierre las llaves de paso y luego llenarlos con las soluciones para infusión. Abrir la llave de paso durante un breve periodo para llenar el espacio de cabeza en la llave de paso con el tampón. </li><li> Encienda el 8 canales, sistema de perfusión de alimentación por gravedad con un lápiz de perfusión, a continuación, seleccione &quot;Modo Manual&quot; en Seleccione la opción Función. Coloque un recipiente debajo del el lápiz de perfusión. </li><li> A manoactivar los puertos pulsando los números correspondientes y llenar los tubos utilizando 10 ml jeringa que contiene agua, y luego cerrar el puerto. Una vez que los puertos están llenos de agua, ponga las jeringas que contienen tampones AF en el puerto 1-6 del sistema de perfusión y, a continuación, abrir las llaves de paso. Abrir los puertos de nuevo para reemplazar el agua en la tubería con los tampones. La velocidad de flujo debe estar alrededor de 0,8 ml / min. </li><li> Pulse cancelar una vez en el controlador de la perfusión para volver al menú &quot;FUNCION&quot;. Cambie a la opción &quot;Editar programa&quot;, a continuación, escriba en el protocolo de perfusión indica en la Tabla 1. Guarde el programa de perfusión. </li><li> Tome las células de la incubadora. Lavar dos veces con el tampón de perfusión, a continuación, establezca las células en el escenario. Conecte el sistema de perfusión a la cámara. Si se utiliza una cámara abierta, configure otra bomba que elimina la solución de perfusión de la cámara. </li><li> Abra el software Slidebook. Iniciar una nueva diapositiva. Nota: Lasiguiente procedimiento es específico para el software Slidebook, pero otro software, como MetaFluor y NIS-elemento también se puede utilizar para el tipo de formación de imágenes se describe aquí. Teóricamente experimentos se pueden realizar utilizando cualquier software que permite obtener imágenes del curso del tiempo, y las secuencias de imágenes pueden ser analizados post-experimental utilizando software como ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) o Fiji (http:/ / fiji.sc / Fiji). Sin embargo, el software que permite la supervisión en tiempo real de la relación de aceptor / donante es de gran utilidad. </li><li> Montar el portaobjetos sobre la platina del microscopio fluorescente. Encuentre las células que expresan co-sensor y ASCT-mCherry utilizando conjuntos de filtros apropiados (véase la lista de materiales) bajo la función &quot;FOCUS&quot;. Ajuste la ganancia haciendo clic en la pestaña &quot;Cámara&quot; y arrastrando la barra deslizante debajo de &quot;ganancia&quot;. Además, ajuste la configuración del filtro de densidad neutra desde el menú desplegable de filtro de densidad neutra. Nota: Si el cubo de filtro no incluye un filtro de ojo, no utilice las piezas oculares desde shorluz de excitación t-longitud de onda es perjudicial para los ojos. Utilice la pantalla de la computadora para encontrar las células en su lugar. </li><li> Adquirir imágenes de las células with donor ( mTFP1) ex donor(mTFP1) em , donor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em and acceptor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em m channels (Filtros se especifican en la Lista de Materiales). Haga clic en &quot;Captura de imagen&quot;, y luego, en la ventana de adquisición, especifique los filtros que se van a utilizar. Haga clic en el botón &quot;TEST&quot; para ajustar el tiempo de exposición al escribir el tiempo de exposición deseado en la casilla junto a la configuración del filtro. Nota: Todos los tres canales necesitan ser expuestos para la misma longitud. Al ajustar los parámetros de la imagen, tomar el cambio en la eficiencia FRET esperado y doblar a aumentar en cuenta: por ejemplo, si se espera que la eficiencia de FRET a subir de 2 veces durante el experimento, los parámetros de imagen se deben ajustarde manera que la intensidad del Donante Aceptor ex em en el estado de reposo debería ser &lt;50% del valor máximo que se puede grabar por el instrumento, de manera que el canal no se sature durante el experimento. De señal de las células marcadas debe ser al menos tres veces mayor que en la región del fondo. </li><li> Dibuje una región de interés usando la herramienta de las regiones en el software. Alternativamente, una función de software para seleccionar píxeles por encima de cierta intensidad se puede utilizar, y luego se convierte en regiones. Para ello, haga clic en Máscara - Segmento, luego mueva la barra de desplazamiento para resaltar las áreas deseadas. </li><li> Seleccione &quot;lapso de tiempo&quot; en el cuadro Tipo de captura, a continuación, especifique el intervalo (10 segundos en este experimento) y puntos de tiempo para el experimento. </li><li> Dibuje una región en una zona sin presencia de células fluorescentes. Esta área se utiliza para la sustracción de fondo. Haga clic derecho en la región dibujada, y luego configurarlo como fondo. Nota: Lo ideal sería que las células que no sonT que expresan los sensores debe ser utilizado como la región del fondo para tener en cuenta tanto la autofluorescencia y la fluorescencia de fondo detectada por la cámara. Si no hay tales células están disponibles en el campo de visión, por lo menos una región sin las células debe ser utilizado para tener en cuenta la fluorescencia de fondo. </li><li> Seleccione el programa deseado en &quot;Select Function - Ejecutar programas de&quot; opción. Cambie al programa guardado (vea el paso 2.3), y luego pulsa ENTER en el mando a la perfusión. Ahora el programa se carga, y golpear una tecla comenzará la perfusión. </li><li> Asegúrese de perfusión y el experimento de imágenes se inicia al mismo tiempo haciendo clic en el botón &quot;Inicio&quot; en la ventana de captura, al mismo tiempo que se pulsa una tecla en el controlador de la perfusión. Nota: Se recomienda anotar el punto de tiempo en que se intercambiaron las soluciones (esto se puede hacer uso de &quot;Notas&quot; de función, que se encuentran dentro de la pestaña de la adquisición). </li><li> Realice el mismo protocolo de perfusión using de células que expresan un sensor que se espera que sea o bien saturado o no unido bajo la condición experimental. Nota: Aquí, FLIPQTV3.0_1.5μ, que está saturado bajo la condición experimental, se utiliza como un control, la Figura 6 Tales experimentos de control son necesarios para confirmar que el cambio en la eficiencia de FRET es debido al cambio real en el sustrato y no. debido al cambio en otros parámetros tales como el pH celular. </li></ol> 3. Análisis Post-experimento <ol><li> Examinar si se ha producido la muestra de deriva durante el experimento. Dibuje las regiones de interés (ROI) s en la imagen tomada en punto de tiempo 0, luego mueva la barra de desplazamiento en la parte superior de la ventana de imagen y compruebe si las células se caen de las regiones de interés en las imágenes tomadas posteriormente en el experimento. </li><li> En caso afirmativo, a continuación, utilizar la función de seguimiento para corregir la deriva, en primer lugar, la creación de máscaras alrededor de las células mediante la selección de la máscara - Segmento, luego deslice la línea que especifica el punto de corte de highlight las regiones que contienen células. Seguimiento de las regiones haciendo clic Máscara - seguimiento de partículas - rastreo de partículas básico. </li><li> Re-dibujar el rendimiento de la inversión y la región del fondo cuando sea necesario. </li><li> Exportación de la intensidad media de las regiones de interés en el transcurso del experimento. Haga clic en Estadísticas - Exportaciones - Datos Ratio / timelapse. </li><li> Cuando la eficiencia de FRET y la cuantificación de la concentración de sustrato no es necesario, trazar el curso temporal de la relación de intensidad (de donantes ex Aceptador em, / Donante ex Donante em) como un proxy de la dinámica del sustrato. Para determinar la concentración citosólica, calcular la máxima y la mínima relación de cambio (es decir, en la saturación y la ausencia de sustrato, respectivamente),? R máx -? R min, mediante regresión no lineal de Δratio (Delta R) con la siguiente ecuación: ? R = [S] / (K d + [S]) x (? R <sub&gt; max - min? R) +? R min donde [S] es la concentración de sustrato en el citosol. Utilizando los? R max - valores? R min obtenidos, la saturación (S) del sensor a una determinada? R se calcula como S = (? R -? R min) / (? R max - min? R) S además se puede convertir en la concentración de sustrato [S] utilizando la siguiente ecuación: S = [S] / (K d + [S]) Nota: la intensidad de canal em Aceptador ex Aceptador debe ser también traza para examinar si la condición experimental influyó en la fluorescencia del aceptor directamente. </li><li> Cuando se observa una deriva de referencia debido a la foto-blanqueo, realizar una corrección de la línea base. Para ello, trazar las intensidades de donante y aceptor en el tiempo (Figura 5A). Luego de identificar los puntos de tiempo utilizados para el the la línea de base, de acuerdo a la demora en el sistema de perfusión y la actividad de transporte de la célula particular (Figura 5B). </li><li> Calcula un polinomio de ajuste que mejor describe la línea base. Entonces, normalizar la intensidad prima a partir de cada punto de tiempo de la línea de base (Figura 5C). Cálculo de la relación de intensidad (de donantes ex Aceptador em, / Donante ex Donante em) de los donantes y aceptores de intensidades normalizadas. </li></ol>

<ol>
	<li>Haussinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+hepatic+ammonia+metabolism:+the+intercellular+glutamine+cycle.">Regulation of hepatic ammonia metabolism: the intercellular glutamine cycle.</a> Adv Enzyme Regul. 25, 159-180 (1986).</li><li>Haussinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+glutamine+metabolism.">Hepatic glutamine metabolism.</a> Beitr Infusionther Klin Ernahr. 17, 144-157 (1987).</li><li>Watford, M., Chellaraj, V., Ismat, A., Brown, P., Raman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+glutamine+metabolism.">Hepatic glutamine metabolism.</a> Nutrition. 18, 301-303 (2002).</li><li>Mustroph, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+translatomes+of+discrete+cell+populations+resolves+altered+cellular+priorities+during+hypoxia+in+Arabidopsis.">Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 18843-18848 (2009).</li><li>Sasagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quartz-Seq:+a+highly+reproducible+and+sensitive+single-cell+RNA+sequencing+method,+reveals+non-genetic+gene-expression+heterogeneity.">Quartz-Seq: a highly reproducible and sensitive single-cell RNA sequencing method, reveals non-genetic gene-expression heterogeneity.</a> Genome Biol. 14, R31 (2013).</li><li>Sabatini, B. L., Oertner, T. G., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life+cycle+of+Ca(2+)+ions+in+dendritic+spines.">The life cycle of Ca(2+) ions in dendritic spines.</a> Neuron. 33, 439-452 (2002).</li><li>Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+with+fluorescent+biosensors.">Quantitative imaging with fluorescent biosensors.</a> Annu Rev Plant Biol. 63, 663-706 (2012).</li><li>Newman, R. H., Fosbrink, M. D., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encodable+fluorescent+biosensors+for+tracking+signaling+dynamics+in+living+cells.">Genetically encodable fluorescent biosensors for tracking signaling dynamics in living cells.</a> Chemical reviews. , 111-3666 (2011).</li><li>Okumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+approach+for+monitoring+cellular+metabolites+and+ions+using+genetically+encoded+biosensors.">Imaging approach for monitoring cellular metabolites and ions using genetically encoded biosensors.</a> Curr Opin Biotech. 21, 45-54 (2010).</li><li>Gruenwald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+glutamine+transporter+activities+in+living+cells+using+genetically+encoded+glutamine+sensors.">Visualization of glutamine transporter activities in living cells using genetically encoded glutamine sensors.</a> PLoS One. 7, e38591 (2012).</li><li>Chaudhuri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protonophore-+and+pH-insensitive+glucose+and+sucrose+accumulation+detected+by+FRET+nanosensors+in+Arabidopsis+root+tips.">Protonophore- and pH-insensitive glucose and sucrose accumulation detected by FRET nanosensors in Arabidopsis root tips.</a> Plant Journal. 56, 948-962 (2008).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499, 295-300 (2013).</li><li>Jiang, D. W., Zhao, L. L., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+RNAi+Screen+Identifies+Letm1+as+a+Mitochondrial+Ca2+/H++Antiporter.">Genome-Wide RNAi Screen Identifies Letm1 as a Mitochondrial Ca2+/H+ Antiporter.</a> Science. , 326-147 (2009).</li><li>Barnett, N. L., Pow, D. V., Robinson, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Muller+cell+glutamine+synthetase+rapidly+impairs+the+retinal+response+to+light.">Inhibition of Muller cell glutamine synthetase rapidly impairs the retinal response to light.</a> Glia. 30, 64-73 (2000).</li><li>Rothstein, J. D., Tabakoff, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+Striatal+Glutamate+Release+after+Glutamine-Synthetase+Inhibition.">Alteration of Striatal Glutamate Release after Glutamine-Synthetase Inhibition.</a> J Neurochem. 43, 1438-1446 (1984).</li><li>Gu, S., Villegas, C. J., Jiang, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+amino+acid+transporter+SNAT3+by+insulin+in+hepatocytes.">Differential regulation of amino acid transporter SNAT3 by insulin in hepatocytes.</a> J Biol Chem. 280, 26055-26062 (2005).</li><li>Palmada, M., Speil, A., Jeyaraj, S., Bohmer, C., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serine/threonine+kinases+SGK1,+3+and+PKB+stimulate+the+amino+acid+transporter+ASCT2.">The serine/threonine kinases SGK1, 3 and PKB stimulate the amino acid transporter ASCT2.</a> Biochem Bioph Res Co. 331, 272-277 (2005).</li><li>Br&#246;er, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+astroglial+ASCT2+amino+acid+transporter+as+a+mediator+of+glutamine+efflux.">The astroglial ASCT2 amino acid transporter as a mediator of glutamine efflux.</a> J Neurochem. 73, 2184-2194 (1999).</li><li>Wallace, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-spike+detection+in+vitro+and+in+vivo+with+a+genetic+Ca2++sensor.">Single-spike detection in vitro and in vivo with a genetic Ca2+ sensor.</a> Nature. 5, 797-804 (2008).</li><li>Haugh, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+fluorescence+microscopy+with+molecular+biosensors:+what+are+we+really+measuring.">Live-cell fluorescence microscopy with molecular biosensors: what are we really measuring.</a> Biophys J. 102, 2003-2011 (2012).</li><li>San Martin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+FRET+lactate+sensor+and+its+use+to+detect+the+Warburg+effect+in+single+cancer+cells.">A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells.</a> PLoS One. 8, e57712 (2013).</li><li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators.">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat Protoc. 1, 1057-1065 (2006).</li><li>Ponsioen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+cAMP-induced+Epac+activation+by+fluorescence+resonance+energy+transfer:+Epac+as+a+novel+cAMP+indicator.">Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator.</a> Embo Rep. 5, 1176-1180 (2004).</li><li>Joseph, J., Seervi, M., Sobhan, P. K., Retnabai, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+ratio+imaging+to+profile+caspase+activity:+potential+application+in+multiparameter+high+content+apoptosis+analysis+and+drug+screening.">High throughput ratio imaging to profile caspase activity: potential application in multiparameter high content apoptosis analysis and drug screening.</a> PLoS One. 6, e20114 (2011).</li><li>Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+identifies+Letm1+as+a+mitochondrial+Ca2+/H++antiporter.">Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter.</a> Science. 326, 144-147 (2009).</li><li>Ma, H., Gibson, E. A., Dittmer, P. J., Jimenez, R., Palmer, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+examination+of+fluorescence+resonance+energy+transfer-detected+metal-ion+response+in+mammalian+cells.">High-throughput examination of fluorescence resonance energy transfer-detected metal-ion response in mammalian cells.</a> J Am Chem Soc. 134, 2488-2491 (2012).</li></ol>

No hay nada que revelar.

El éxito de los experimentos de imagen depende de algunos factores críticos. Uno de estos factores es la afinidad de sensores utilizado, como se discutió anteriormente. Concentración absoluta del sustrato en el compartimiento subcelular de interés, sin embargo, es a menudo desconocida. Por lo tanto le recomendamos probar múltiples sensores con afinidades escalonados para encontrar el que funciona mejor bajo la condición experimental deseado. Por ejemplo, en nuestro caso transfectadas las células COS7 con sensore...

Debido a la notable progreso en tecnologías que permite el examen del transcriptoma y el proteoma a nivel celular, ahora ha quedado claro que la bioquímica y el flujo resultante de los metabolitos y los iones son altamente tipo específico de célula. Por ejemplo, en el hígado de los mamíferos, la degradación y la síntesis de glutamina secuencial se llevan a cabo de forma simultánea por las células periportal y células perivenosos respectivamente, la alimentación de amonio para el ciclo de la urea en el primer tipo de células, mientras que consume el exceso de amoníaco en este último 1-3. En algunos casos, se detecta heterogeneidad bioquímica significativa incluso en un solo &quot;tipo celular&quot; 4, 5. Además de tales especificidad espacial, los niveles celulares de metabolitos e iones son altamente dinámico (por ejemplo, moléculas de señalización tales como Ca 2 + y nucleótidos cíclicos). Los patrones espacio-temporales de metabolitos e iones a menudo desempeñan un papel crítico en la transducción de señales. MONITOREO dinámica celular de metabolitos e iones, sin embargo, plantean desafío único. En muchos casos, el cambio en las concentraciones son rápida y transitoria, ejemplificada por el caso de moléculas de señalización tales como Ca 2 +, que se desintegra dentro de ~ 20 mseg en las espinas dendríticas 6. Además, la compartimentación de las rutas bioquímicas dentro y entre las células hace que sea difícil de cuantificar la dinámica de metabolitos e iones usando extracción y cromatografía en columna / técnicas de espectrometría de masas. Sensores codificados genéticamente para moléculas biológicas son ampliamente utilizados debido a la alta resolución espacio-temporal que permite al experimentador para estudiar la dinámica molecular de corta duración y / o compartimentadas (revisado en 7, 8). Estos sensores codificados genéticamente pueden dividirse en dos categorías; sensores basados ​​en la intensidad y sensores ratiometic. Sensores basados ​​en la intensidad general consisten en un dominio de unión y una gripeproteína orescent (fps), y la unión al dominio de unión soluto cambia la intensidad fluorescente. Sensores Ratiometic, por otro lado, a menudo se aprovechan de Föster de transferencia de energía de resonancia (FRET) entre dos programas marco que funcionan como un par de FRET. Estos sensores consisten en un dominio de unión y dos programas marco, y la unión soluto induce el cambio en la eficiencia de FRET entre los dos programas marco. Un gran número de sensores para metabolitos e iones biológicamente importantes se han desarrollado en la última década 8, 9. Una de la excitante posibilidad ofrecida por tales sensores codificados genéticamente es su uso en el análisis de alta resolución de los procesos de transporte de membrana, que anteriormente no era fácil de detectar en el nivel celular. Sensores codificados genéticamente facilitar el análisis de los mecanismos de transporte, tales como especificidad de sustrato y la dependencia de pH 10, 11. Por otra parte, en combinación con la res genéticosuentes como la biblioteca de RNAi construye de organismos modelo, ahora es posible realizar búsquedas en todo el genoma para nuevos procesos de transporte por medio de sensores codificados genéticamente. De hecho, el uso de cable del sensor codificado genéticamente para el descubrimiento de los transportadores de no caracterizados previamente en múltiples casos 12, 13. Recientemente, nuestro laboratorio ha desarrollado una serie de sensores basados ​​en FRET de glutamina. Hemos demostrado que los niveles de glutamina celular pueden ser visualizados usando tales sensores de glutamina de FRET 10. Estos sensores constan de un donante de FRET (mTFP1) insertado en una proteína bacteriana de unión glutamina glnH, y un aceptor de FRET (Venus) en el extremo C-terminal de glnH (Figura 1). FRET eficiencia de estos sensores a disminuir tras la unión de glutamina, lo que resulta en la disminución de la relación de intensidad de aceptor / donador. Fine regulación de los procesos de transporte de la glutamina es importante en los procesos biológicos, tales como neurotransmisión 14, 15 y el mantenimiento de ciclo de la urea en el hígado 1, 16, 17. Aquí se presenta la metodología de análisis de las actividades de transporte con sensores FRET para glutamina, usando un campo amplio de fluorescencia microscopio puesta a punto. El objetivo de los experimentos que se muestran aquí son para detectar las actividades del transportador en una sola célula y para examinar la especificidad de sustrato de un transportador expresado transitoriamente.

<table><tbody><tr><td>Inverted fluorescent microscope</td><td>Olympus</td><td>IX81F-3-5</td><td>An equivalent inverted fluorescent microscope from other suppliers would also be appropriate.</td></tr><tr><td>Excitation filter (mTFP1)</td><td>Omega Optical</td><td>3RD450-460</td><td>Band width 450-460 nm</td></tr><tr><td>Excitation filter (Venus)</td><td>Chroma</td><td>ET500/20</td><td>Band width 490-510 nm</td></tr><tr><td>Emission filter (mTFP1)</td><td>Chroma</td><td>HQ495/30m</td><td>Band width 475-505 nm</td></tr><tr><td>Emission filter (Venus)</td><td>Chroma</td><td>ET535/30m</td><td>Band width 520-550 nm</td></tr><tr><td>Dichroic mirror (FRET channels)</td><td>Chroma</td><td>470dcxr</td><td>Long pass, 470 nm cut off</td></tr><tr><td>Dichroic mirror (YFP channel)</td><td>Chroma</td><td>89002bs</td><td>Passes 445-490 nm, 510-560 nm, 590-680 nm</td></tr><tr><td>mCherry filter set</td><td>Chroma</td><td>49008</td><td>Excitation 540-580 nm, long pass dichroic with 585 nm cut off, emission filter 595-695 nm</td></tr><tr><td>Light source</td><td>Olympus</td><td>U-LH100L-3-5</td><td>LED- or halogen light source that produces stable light intensity, mercury lamps are not recommended</td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Qimaging</td><td>Rolera-MGi EMCCD</td><td></td></tr><tr><td>Apochromatic fluorescence objective</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfusion system, ValveBank II</td><td>AutoMate Scientific</td><td>[01-08]</td><td>Other perfusion systems that allow fast solution exchange would also work</td></tr><tr><td>Laminar-flow chambers</td><td>C&amp;amp;L Instruments</td><td>VC-MPC-TW</td><td>Other larminar-flow chambers would also work.</td></tr><tr><td>Chambered slide</td><td>Lab-Tek</td><td>154534</td><td>For open-chamber experiments</td></tr><tr><td>Perfusion pump</td><td>Thermo Scientific</td><td>74-046-12131</td><td>For open-chamber experiments</td></tr><tr><td>Software supporting ratiometric measurements</td><td>Intellegenent Imaging Innovation</td><td>Slidebook 5.5</td><td></td></tr><tr><td>Laminar flow biosafety cabinet</td><td>ESCO</td><td>LA-3A2</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp CO&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-255-25</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s MEM (DMEM)</td><td>Hyclone</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>Cosmic calf serum</td><td>Hyclone</td><td>SH3008703</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Serum-free medium for transfection (OPTI-MEM I)</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td>Used with Lipofectamine 2000</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine solution</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>25 mm circular glass cover slips</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-545-102</td><td>In case VC-MPC-TW is used</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668027</td><td>Other transfection reagents can also be used.</td></tr><tr><td>Solution A (Hank&#039;s buffer)</td><td></td><td></td><td>9.7 g HANK salt (Sigma H1387), 0.35 g NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, 5.96 g HEPES to 1 L, pH adjusted to 7.35 with NaOH</td></tr><tr><td>Solution B</td><td></td><td></td><td>Solution A + 0.04 mM Gln</td></tr><tr><td>Solution C</td><td></td><td></td><td>Solution A + 0.2 mM Gln</td></tr><tr><td>Solution D</td><td></td><td></td><td>Solution A + 1 mM Gln</td></tr><tr><td>Solution E</td><td></td><td></td><td>Solution A + 5 mM Gln</td></tr><tr><td>Solution F</td><td></td><td></td><td>Solution A + 5 mM Ala</td></tr></tbody></table>

glutamine flux imaging using genetically encoded sensors

Sensores codificados genéticamente permiten la monitorización en tiempo real de las moléculas biológicas con una resolución subcelular. Una enorme variedad de tales sensores para moléculas biológicas se hizo disponible en los últimos 15 años, algunos de los cuales se convirtió en herramientas indispensables que se utilizan rutinariamente en muchos laboratorios. Una de las emocionantes aplicaciones de sensores codificados genéticamente es el uso de estos sensores en la investigación de los procesos de transporte celulares. Propiedades de los transportistas, como la cinética y especificidades de sustrato se pueden investigar a nivel celular, que proporciona posibilidades de análisis específicos de tipo celular de las actividades de transporte. En este artículo, vamos a demostrar cómo la dinámica del transportador se pueden observar utilizando el sensor de glutamina codificado genéticamente como ejemplo. Diseño experimental, detalles técnicos de los parámetros experimentales, y las consideraciones para los análisis post-experimentales serán discutidos.

Tiempo curso experimentos típicos se representan en la Figura 2. En estos experimentos, FRET sensores de glutamina con afinidades de 8 mM (FLIPQTV3.0_8m, Figura 2A y 2B) y 100 M (FlipQTV3.0_100 μ C y D) fueron co-expresada con un ASCT2 intercambiador de aminoácidos obligatoria 18 en células COS7 10. La afluencia de glutamina se detecta como el cambio en las relaciones de intensidad de fluorescencia entre el donante (mTFP1) y el aceptor (Venus) ...

Watch this Scientific Journal Video about Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors at JoVE.com

Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors

Este artículo le mostrará cómo controlar la dinámica de glutamina en las células vivas mediante FRET. Sensores codificados genéticamente permiten la monitorización en tiempo real de las moléculas biológicas con una resolución subcelular. Diseño experimental, detalles técnicos de los parámetros experimentales, y las consideraciones para los análisis post-experimentales serán discutidos para los sensores de glutamina codificados genéticamente.

Glutamina Flux Imaging utilizando sensores codificados genéticamente

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for ...

glutamine-flux-imaging-using-genetically-encoded-sensors

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.5K vistas.  Virginia Tech.  Este artículo le mostrará cómo controlar la dinámica de glutamina en las células vivas mediante FRET. Sensores codificados genéticamente permiten la monitorización en tiempo real de las moléculas biológicas con una resolución subcelular. Diseño experimental, detalles técnicos de los parámetros experimentales, y las consideraciones para los análisis post-experimentales serán discutidos para los sensores de glutamina codificados genéticamente. 

Video: Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors

Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including destruction of the sample, introduction of potential artifacts, and a lack of specificity for the reactive species involved. Thus, there is a current need in the field of toxicology for non-destructive, sensitive, and specific methods that can be used to observe and quantify intracellular redox perturbations, more commonly referred to as oxidative stress. Here, we present a method for the use of two genetically-encoded fluorogenic sensors, roGFP2 and HyPer, to be used in live-cell imaging studies to observe xenobiotic-induced oxidative responses. roGFP2 equilibrates with the glutathione redox potential (EGSH), while HyPer directly detects hydrogen peroxide (H2O2). Both sensors can be expressed into various cell types via transfection or transduction, and can be targeted to specific cellular compartments. Most importantly, live-cell microscopy using these sensors offers high spatial and temporal resolution that is not possible using conventional methods. Changes in the fluorescence intensity monitored at 510 nm serves as the readout for both genetically-encoded fluorogenic sensors when sequentially excited by 404 nm and 488 nm light. This property makes both sensors ratiometric, eliminating common microscopy artifacts and correcting for differences in sensor expression between cells. This methodology can be applied across a variety of fluorometric platforms capable of exciting and collecting emissions at the prescribed wavelengths, making it suitable for use with confocal imaging systems, conventional wide-field microscopy, and plate readers. Both genetically-encoded fluorogenic sensors have been used in a variety of cell types and toxicological studies to monitor cellular EGSH and H2O2 generation in real-time. Outlined here is a standardized method that is widely adaptable across cell types and fluorometric platforms for the application of roGFP2 and HyPer in live-cell toxicological assessments of oxidative stress.

This manuscript describes the use of genetically-encoded fluorogenic reporters in an application of live-cell imaging for the examination of xenobiotic-induced oxidative stress. This experimental approach offers unparalleled spatiotemporal resolution, sensitivity, and specificity while avoiding many of the shortcomings of conventional methods used for the detection of toxicological oxidative stress.

Enfoques de evaluación de estrés oxidativo toxicológico mediante sensores codificados genéticamente fluorógenos la proyección de imagen

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be validated for predictive purposes. Ideally such systems would be low volume, which precludes sampling and destructive analyses when time course data are to be obtained. What is needed is an in situ monitoring tool which can report the necessary information in real-time and noninvasively. An interesting option is the use of fluorescent, protein-based in vivo biological sensors as reporters of intracellular concentrations. One particular class of in vivo biosensors that has found applications in metabolite quantification is based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between two fluorescent proteins connected by a ligand binding domain. FRET integrated biological sensors (FIBS) are constitutively produced within the cell line, they have fast response times and their spectral characteristics change based on the concentration of metabolite within the cell. In this paper, the method for constructing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines that constitutively express a FIBS for glucose and glutamine and calibrating the FIBS in vivo in batch cell culture in order to enable future quantification of intracellular metabolite concentration is described. Data from fed-batch CHO cell cultures demonstrates that the FIBS was able in each case to detect the resulting change in the intracellular concentration. Using the fluorescent signal from the FIBS and the previously constructed calibration curve, the intracellular concentration was accurately determined as confirmed by an independent enzymatic assay.

A description of how to calibrate F&#246;rster Resonance Energy Transfer integrated biological sensors (FIBS) for in situ metabolic profiling is presented.&#160;The FIBS can be used to measure intracellular levels of metabolites noninvasively aiding in the development of metabolic models and high throughput screening of bioprocess conditions.

FIBS habilitadas no invasiva perfiles metabólicos

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

Bioingeniería

Visualizing Cellular Gibberellin Levels Using the nlsGPS1 F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) Biosensor

The phytohormone gibberellin (GA) is a small, mobile signaling molecule that plays a key role in seed germination, cellular elongation, and developmental transitions in plants. Gibberellin Perception Sensor 1 (GPS1) is the first F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)-based biosensor that allows monitoring of cellular GA levels in vivo. By measuring a fluorescence emission ratio of nuclear localized-GPS1 (nlsGPS1), spatiotemporal mapping of endogenously and exogenously supplied GA gradients in different tissue types is feasible at a cellular scale. This protocol will describe how to image nlsGPS1 emission ratios in three example experiments: steady-state, before-and-after exogenous gibberellin A4 (GA4) treatments, and over a treatment time-course. We also provide methods to analyze nlsGPS1 emission ratios using both Fiji and a commercial three-dimensional (3-D) micrograph visualization and analysis software and explain the limitations and likely pitfalls of using nlsGPS1 to quantify gibberellin levels.

Gibberellin Perception Sensor 1 (GPS1) is the first F&#246;rster resonance energy transfer-based biosensor for measuring the cellular levels of gibberellin phytohormones with a high spatiotemporal resolution. This protocol reports on the method to visualize and quantify cellular gibberellin levels using the genetically encoded nlsGPS1 biosensor in Arabidopsis hypocotyls and root tips.

Niveles de giberelina celular visualizado utilizando la energía de resonancia NlsGPS1 Förster transferencia Biosensor (traste)

The phytohormone gibberellin (GA) is a small, mobile signaling molecule that plays a key role in seed germination, cellular elongation, and developmental ...

Biología del Desarrollo

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new method of Ca2+-imaging using the bioluminescent reporter GFP-aequorin (GA) has been developed. This new technique relies on the fusion of the GFP and aequorin genes, producing a molecule capable of binding calcium and&#160;&#8212; with the addition of its cofactor coelenterazine &#8212; emitting bright light that can be monitored through a photon collector. Transgenic lines carrying the GFP-aequorin gene have been generated for both mice and Drosophila. In Drosophila, the GFP-aequorin gene has been placed under the control of the GAL4/UAS binary expression system allowing for targeted expression and imaging within the brain. This method has subsequently been shown to be capable of detecting both inward Ca2+-transients and Ca2+-released from inner stores. Most importantly it allows for a greater duration in continuous recording, imaging at greater depths within the brain, and recording at high temporal resolutions (up to 8.3 msec). Here we present the basic method for using bioluminescent imaging to record and analyze Ca2+-activity within the mushroom bodies, a structure central to learning and memory in the fly brain.

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Here we present a novel Ca2+-imaging approach using a bioluminescent reporter. This approach uses a fused construct GFP-aequorin which binds to Ca2+ and emits light, eliminating the need for light excitation. Significantly this method permits long continuous imaging, access to deep brain structures and high temporal resolution.

En Vivo Cerebral Funcional Imaging Enfoque Basado en calcio bioluminiscente Indicador GFP-aequorina

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Neurociencias

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

Selección de alto rendimiento y biosensores fluorescentes con C. elegans Las cepas

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Biología

A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR malfunction, expressed as either over- or under-activity caused by mutations, altered expression, trafficking, or localization, can contribute to numerous diseases, especially in the central nervous system. Therefore, understanding the receptor&#39;s biology as well as facilitating the discovery of compounds and small molecules is crucial in ongoing efforts to combat neurological diseases. Current approaches to studying the receptor have limitations including low throughput, high cost, and the inability to study its functional abilities due to the necessary presence of channel blockers to prevent NMDAR-mediated excitotoxicity. Additionally, the existing assay systems are sensitive to stimulation by glutamate only and lack sensitivity to stimulation by glycine, the other co-ligand of the NMDAR. Here, we present the first plate-based assay with high-throughput power to study an NMDA receptor with sensitivity to both co-ligands, glutamate and D-serine/glycine. This approach allows the study of different NMDAR subunit compositions and allows functional studies of the receptor in glycine- and/or glutamate-sensitive modes. Additionally, the method does not require the presence of inhibitors during measurements. The effects of positive and negative allosteric modulators can be detected with this assay and the known pharmacology of NMDAR has been replicated in our system. This technique overcomes the limitations of existing methods and is cost-effective. We believe that this novel technique will accelerate the discovery of therapies for NMDAR-mediated pathologies.

The goal of this protocol is to facilitate the study of NMDA-receptors (NMDAR) at a larger scale and allow the examination of modulatory effects of small molecules and their therapeutic applications.

Un análisis del flujo de calcio de alto rendimiento para el estudio de los receptores NMDA con sensibilidad D/glicina-serina y glutamato

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...

Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice

Synapses are highly compartmentalized functional units that operate independently on each other. In Huntington&#39;s disease (HD) and other neurodegenerative disorders, this independence might be compromised due to insufficient glutamate clearance and the resulting spill-in and spill-out effects. Altered astrocytic coverage of the presynaptic terminals and/or dendritic spines as well as a reduced size of glutamate transporter clusters at glutamate release sites have been implicated in the pathogenesis of diseases resulting in symptoms of dys-/hyperkinesia. However, the mechanisms leading to the dysfunction of glutamatergic synapses in HD are not well understood. Improving and applying synapse imaging we have obtained data shedding new light on the mechanisms impeding the initiation of movements. Here, we describe the principle elements of a relatively inexpensive approach to achieve single synapse resolution by using the new genetically encoded ultrafast glutamate sensor iGluu, wide-field optics, a scientific CMOS (sCMOS) camera, a 473 nm laser and a laser positioning system to evaluate the state of corticostriatal synapses in acute slices from age appropriate healthy or diseased mice. Glutamate transients were constructed from single or multiple pixels to obtain estimates of i) glutamate release based on the maximal elevation of the glutamate concentration [Glu] next to the active zone and ii) glutamate uptake as reflected in the time constant of decay (TauD) of the perisynaptic [Glu]. Differences in the resting bouton size and contrasting patterns of short-term plasticity served as criteria for the identification of corticostriatal terminals as belonging to the intratelencephalic (IT) or the pyramidal tract (PT) pathway. Using these methods, we discovered that in symptomatic HD mice ~40% of PT-type corticostriatal synapses exhibited insufficient glutamate clearance, suggesting that these synapses might be at risk to excitotoxic damage. The results underline the usefulness of TauD as a biomarker of dysfunctional synapses in Huntington mice with a hypokinetic phenotype.

We present a protocol to evaluate the balance between glutamate release and clearance at single corticostriatal glutamatergic synapses in acute slices from adult mice. This protocol uses the fluorescent sensor iGluu for glutamate detection, a sCMOS camera for signal acquisition and a device for focal laser illumination.

Indicadores de sinapsis únicas de liberación y aceptación de glutamato en rebanadas cerebrales agudas de ratones normales y Huntington

Synapses are highly compartmentalized functional units that operate independently on each other. In Huntington&#39;s disease (HD) and other ...

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerative disorder causing progressive muscle weakness and death within 2-5 years following diagnosis. Clinical manifestations include weight loss, dyslipidemia, and hypermetabolism; however, it remains unclear how these relate to motor neuron degeneration. Using a Drosophila model of TDP-43 proteinopathy that recapitulates several features of ALS including cytoplasmic inclusions, locomotor dysfunction, and reduced lifespan, we recently identified broad ranging metabolic deficits. Among these, glycolysis was found to be upregulated and genetic interaction experiments provided evidence for a compensatory neuroprotective mechanism. Indeed, despite upregulation of phosphofructokinase, the rate limiting enzyme in glycolysis, an increase in glycolysis using dietary and genetic manipulations was shown to mitigate locomotor dysfunction and increased lifespan in fly models of TDP-43 proteinopathy. To further investigate the effect on TDP-43 proteinopathy on glycolytic flux in motor neurons, a previously reported genetically encoded, FRET-based sensor, FLII12Pglu-700&#181;&#948;6, was used. This sensor is comprised of a bacterial glucose-sensing domain and cyan and yellow fluorescent proteins as the FRET pair. Upon glucose binding, the sensor undergoes a conformational change allowing FRET to occur. Using FLII12Pglu-700&#181;&#948;6, glucose uptake was found to be significantly increased in motor neurons expressing TDP-43G298S, an ALS causing variant. Here, we show how to measure glucose uptake, ex vivo, in larval ventral nerve cord preparations expressing the glucose sensor FLII12Pglu-700&#181;&#948;6 in the context of TDP-43 proteinopathy. This approach can be used to measure glucose uptake and assess glycolytic flux in different cell types or in the context of various mutations causing ALS and related neurodegenerative disorders.

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

Glucose uptake is increased in Drosophila motor neurons affected by TAR DNA binding protein (TDP-43) proteinopathy, as indicated by a FRET-based, genetically encoded glucose sensor.

Medición de la absorción de glucosa en modelos de Drosophila de proteinopatía por TDP-43

Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerative disorder causing progressive muscle weakness and death within 2-5 years following diagnosis. Clinical ...

Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant thiol-disulfide redox buffer glutathione is considered a central player in antioxidant defenses. Therefore, measuring the mitochondrial glutathione redox potential provides useful information about mitochondrial redox status and oxidative stress. Glutaredoxin1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) is a genetically encoded, green fluorescent protein (GFP)-based ratiometric indicator of the glutathione redox potential that has two redox-state-sensitive excitation peaks at 400 nm and 490 nm with a single emission peak at 510 nm. This article describes how to perform confocal live microscopy of mitochondria-targeted Grx1-roGFP2 in primary hippocampal and cortical neurons. It describes how to assess steady-state mitochondrial glutathione redox potential (e.g., to compare disease states or long-term treatments) and how to measure redox changes upon acute treatments (using the excitotoxic drug N-methyl-D-aspartate (NMDA) as an example). In addition, the article presents co-imaging of Grx1-roGFP2 and the mitochondrial membrane potential indicator, tetramethylrhodamine, ethyl ester (TMRE), to demonstrate how Grx1-roGPF2 can be multiplexed with additional indicators for multiparametric analyses. This protocol provides a detailed description of how to (i) optimize confocal laser scanning microscope settings, (ii) apply drugs for stimulation followed by sensor calibration with diamide and dithiothreitol, and (iii) analyze data with ImageJ/FIJI.

This article describes a protocol to determine differences in basal redox state and redox responses to acute perturbations in primary hippocampal and cortical neurons using confocal live microscopy. The protocol can be applied to other cell types and microscopes with minimal modifications.

Imágenes en vivo del estado redox de glutatión mitocondrial en neuronas primarias utilizando un indicador ratiométrico

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.