Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH AI071815 (CEH) y el Premio al Desarrollo de Nanomedicina Hoja de Ruta Centro PN2EY016586 (MLD).

<ol>
	<li>Bastiani, L., Laal, S., Kim, M., Zolla-Pazner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+cell-dependent+alterations+in+envelope+components+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+virions.">Host cell-dependent alterations in envelope components of human immunodeficiency virus type 1 virions.</a> J. Virol. 71, 3444-3450 (1997).</li><li>Dimitrov, D. S., Willey, R. L., Sato, H., Chang, L. J., Blumenthal, R., Martin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+infection+kinetics.">Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 infection kinetics.</a> J. Virol. 67, 2182-2190 (1993).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+Bond+Dynamics+in+Contacts+between+T+Lymphocytes+and+Glass-supported+Planar+Bilayers+Reconstituted+with+the+Immunoglobulin-related+Adhesion+Molecule+CD58.">Adhesive Bond Dynamics in Contacts between T Lymphocytes and Glass-supported Planar Bilayers Reconstituted with the Immunoglobulin-related Adhesion Molecule CD58.</a> J. Biol. Chem. 272, 15782-15788 (1997).</li><li>Fortin, J. F., Cantin, R., Lamontagne, G., Tremblay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-derived+ICAM-1+glycoproteins+incorporated+on+human+immunodeficiency+virus+type+1+are+biologically+active+and+enhance+viral+infectivity.">Host-derived ICAM-1 glycoproteins incorporated on human immunodeficiency virus type 1 are biologically active and enhance viral infectivity.</a> J. Virol. 71, 3588-3596 (1997).</li><li>Frank, I., Stoiber, H., Godar, S., Stockinger, H., Steindl, F., Katinger, H. W., Dierich, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquisition+of+host+cell-surface-derived+molecules+by+HIV-1.">Acquisition of host cell-surface-derived molecules by HIV-1.</a> Aids. 10, 1611-1620 (1996).</li><li>Hioe, C. E., Bastiani, L., Hildreth, J. E., Zolla-Pazner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cellular+adhesion+molecules+in+HIV+type+1+infection+and+their+impact+on+virus+neutralization.">Role of cellular adhesion molecules in HIV type 1 infection and their impact on virus neutralization.</a> AIDS Res. Hum. Retroviruses. 14, S247-S254 (1998).</li><li>Hioe, C. E., Chien, P. C., Lu, C., Springer, T. A., Wang, X. H., Bandres, J., Tuen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LFA-1+expression+on+target+cells+promotes+human+immunodeficiency+virus+type+1+infection+and+transmission.">LFA-1 expression on target cells promotes human immunodeficiency virus type 1 infection and transmission.</a> J. Virol. 75, 1077-1082 (2001).</li><li>Jolly, C., Kashefi, K., Hollinshead, M., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+cell+to+cell+transfer+across+an+Env-induced,+actin-dependent+synapse.">HIV-1 cell to cell transfer across an Env-induced, actin-dependent synapse.</a> J. Exp. Med. 199, 283-293 (2004).</li><li>Jolly, C., Mitar, I., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+an+intact+T-cell+actin+and+tubulin+cytoskeleton+for+efficient+assembly+and+spread+of+human+immunodeficiency+virus+type+1.">Requirement for an intact T-cell actin and tubulin cytoskeleton for efficient assembly and spread of human immunodeficiency virus type 1.</a> J. Virol. 81, 5547-5560 (2007).</li><li>McDonald, D., Wu, L., Bohks, S. M., KewalRamani, V. N., Unutmaz, D., Hope, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+HIV+and+its+receptors+to+dendritic+cell-T+cell+junctions.">Recruitment of HIV and its receptors to dendritic cell-T cell junctions.</a> Science. 300, 1295-1297 (2003).</li><li>Pearce-Pratt, R., Malamud, D., Phillips, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+cytoskeleton+in+cell-to-cell+transmission+of+human+immunodeficiency+virus.">Role of the cytoskeleton in cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus.</a> J. Virol. , 682898-682905 (1994).</li><li>Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ImageJ. , (1997).</li><li>Rizzuto, C. D., Sodroski, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+virion+ICAM-1+to+human+immunodeficiency+virus+infectivity+and+sensitivity+to+neutralization.">Contribution of virion ICAM-1 to human immunodeficiency virus infectivity and sensitivity to neutralization.</a> J. Virol. 71, 4847-4851 (1997).</li><li>Vardhana, S., Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+Planar+Bilayers+for+the+Formation+of+Study+of+Immunological+Synapses+and+Kinapse.">Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse.</a> J. Vis. Exp. (19), e947-e947 (2008).</li><li>Vasiliver-Shamis, G., Cho, M. W., Hioe, C. E., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+gp120-induced+partial+T-cell+receptor+signaling+creates+an+F-actin-depleted+zone+in+the+virological+synapse.">Human immunodeficiency virus type 1 envelope gp120-induced partial T-cell receptor signaling creates an F-actin-depleted zone in the virological synapse.</a> J. Virol. 83, 11341-11355 (2009).</li><li>Vasiliver-Shamis, G., Tuen, M., Wu, T., Starr, T., Cameron, T., Thomson, R., Kaur, G., Liu, J., Visciano, M., Li, H., Kumar, R., Ansari, R., Han, D., Cho, M., Dustin, M. L., Hioe, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+gp120+induces+a+stop+signal+and+virological+synapse+formation+in+noninfected+CD4++T+cells.">Human immunodeficiency virus type 1 envelope gp120 induces a stop signal and virological synapse formation in noninfected CD4+ T cells.</a> J. Virol. 82, 9445-9457 (2008).</li><li>Zhu, P., Liu, J., Bess, J., Chertova, E., Lifson, J., Grise, H., Ofek, G., Taylor, K., Roux, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+three-dimensional+structure+of+AIDS+virus+envelope+spikes.">Distribution and three-dimensional structure of AIDS virus envelope spikes.</a> Nature. 441, 847-852 (2006).</li></ol>

Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

Estudios previos han VS visualizan en el sistema conjugado célula-célula, sin embargo estos estudios no proporcionan imágenes de alta resolución para visualizar las estructuras supramoleculares en la sinapsis. En nuestro laboratorio, se utilizó el vidrio apoyada sistema bicapa plana para representar la superficie de las células infectadas que expresan la gp120 envoltura del virus y la molécula de adhesión celular ICAM-1. En conjunción con microscopía TIRF, que detecta las señales de fluorescencia dentro de 100-200 nm desde la superficie del bicapa con una alta relación señal-ruido, hemos sido capaces de detectar la segregación supramolecular de la gp120 de la ICAM-1 en el VS. Además, el método estándar de inmunotinción puede aplicarse al sistema bicapa y se utiliza aquí para detectar y cuantificar la contratación específica de sesión Lck, pero no Fionia, a la zona de contacto en la gp120-SV 15. Por lo tanto, la bicapa plana ofrece un sistema experimental para imágenes de alta resolución de la interfaz de sinapsis en un plano 2D TIRF microscopia, así como los métodos de iluminación de campo amplio o confocal. Sin embargo, el sistema también tiene limitaciones como el ajuste de la movilidad ligando, fuera del plano de flexión, y las fluctuaciones de las membranas biológicas no se reproducen por bicapas planas. Además, este es un sistema in vitro y por lo tanto tiene otras limitaciones, tales como la falta de otras moléculas de la membrana que estarían presentes en una célula infectada y la maquinaria citoesqueleto que regula la movilidad molecular y la motilidad celular. Además, la dinámica y la distribución de las moléculas, tales como trímeros frente a monómeros de gp120, no podrán estar representados fisiológicamente en la bicapa. Sin embargo, aun con estas limitaciones, este sistema sigue siendo muy valiosa para el estudio del virus de las células o las interacciones célula-célula, y estos métodos pueden servir como una guía útil para los investigadores que están buscando imágenes de alta resolución para detectar la organización supramolecular que no es discernible en el sistema conjugado convencional célula-célula.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Su etiquetados gp120 del VIH </td><td> Regalo del Dr. Cho </td><td></td><td> DH12 </td></tr><tr><td> Su etiquetados gp120 del VIH </td><td> Tecnología Inmune </td><td></td><td> Varios X4 o R5 trópico </td></tr><tr><td> HSA </td><td> Williams Medical Company </td><td> 521302 </td><td> Albúmina sérica humana al 25% </td></tr><tr><td> Amicon centrífugas Filtros Ultra </td><td> Millipore </td><td> UFC803024 </td><td> Ultracel-30K </td></tr><tr><td> Lck Conejo MAB </td><td> Señalización Celular </td><td> 2787 </td><td></td></tr><tr><td> p-Lck Rabbit pAb </td><td> Santa Cruz Biotechnology Inc. </td><td> Sc-101728 </td><td> Tyr 394 </td></tr><tr><td> Fionia Conejo MAB </td><td> Millipore </td><td> 04-353 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 568 2 °; Ab </td><td> Molecular Probes </td><td> A11034 </td><td> De cabra anti-conejo IgG (H + L) </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 </td><td> Molecular Probes </td><td> Una-20000 </td><td> carboxílico succinimidil éster </td></tr><tr><td> FCS2 Cámara </td><td> Bioptechs </td><td> 060319-2-03 </td><td></td></tr><tr><td> Microaqueduct Slide </td><td> Bioptechs </td><td> 130119-5 </td><td></td></tr><tr><td> 30mm Redonda w / agujeros </td><td> Bioptechs </td><td> 1907-08-750 </td><td> 0,75 mm de espesor </td></tr><tr><td> Rectángulo Junta </td><td> Bioptechs </td><td> 1907-1422-250 </td><td> 0,25 mm de espesor 14x24 </td></tr><tr><td> Tubo Tygon </td><td> Bioptechs </td><td> 20202275 </td><td> 1/16 &quot;(25 pies) </td></tr><tr><td> Llave de tres vías </td><td> BioRad </td><td> 7328103 </td><td></td></tr><tr><td> Llave de paso de dos vías </td><td> BioRad </td><td> 7328102 </td><td></td></tr><tr><td> Slide Sticky E 0.2 Luer </td><td> Ibidi </td><td> 80168 </td><td></td></tr><tr><td> Cubreobjetos </td><td> Ibidi </td><td> 10812 </td><td></td></tr><tr><td> Jeringa 1ml </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> PERROS-NTA </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 790404C </td><td></td></tr><tr><td> DOPC </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 850375C </td><td></td></tr><tr><td> Cubreobjetos </td><td> Bioptechs </td><td> 40-1313-0319 </td><td> 40mm </td></tr><tr><td> TIRF microscopio </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ImageJ </td><td> Los Institutos Nacionales de Salud </td><td></td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/~~V</a> </td></tr></tbody></table>

imaging of hiv-1 envelope-induced virological synapse and signaling on synthetic lipid bilayers

Virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) la infección se produce más eficientemente a través de célula a célula de transmisión 2,10,11. Esta célula a célula de transferencia entre células T CD4 + implica la formación de una sinapsis virológica (VS), que es un F-actina dependiente de célula-célula unión formada sobre el compromiso de VIH-1 sobre la gp120 en la célula infectada con CD4 y el receptor de quimioquinas (CKR) CCR5 o CXCR4 en la célula diana 8. Además de la gp120 y sus receptores, otras proteínas de membrana, en particular la molécula de adhesión de LFA-1 y sus ligandos, la familia ICAM, juegan un papel importante en la formación de VS y la transmisión del virus, ya que están presentes en la superficie de las células del donante infectadas por virus y las células diana, así como sobre la envoltura de VIH-1 viriones 1,4,5,6,7,13. VS formación también es acompañada por eventos de señalización intracelulares que se transducen como resultado de la gp120-compromiso de sus receptores. De hecho, recientemente hemos mostraron que las células CD4 &lt;sup&gt; + la interacción de las células T con gp120 induce el reclutamiento y la fosforilación de moléculas de señalización asociadas a la signalosome TCR como Lck, CD3, ZAP70, LAT, SLP-76, ITK, y 15 PLCγ. En este artículo se presenta un método para visualizar acuerdo supramolecular y proximal a la membrana señalización de eventos que tienen lugar durante la formación de VS. Tomamos ventaja del vidrio-apoyado plana bi-capa del sistema como un modelo reduccionista para representar la superficie de células infectadas por VIH que lleven la envoltura viral gp120 y la molécula de adhesión celular ICAM-1. El protocolo describe los procedimientos generales para el seguimiento de la gp120 del VIH-1 inducida por VS montaje y eventos de la señal de activación que incluyen i) bi-capa de preparación y montaje en una celda de flujo, ii) la inyección de las células y la tinción de inmunofluorescencia para la detección de moléculas de señalización intracelular en las células que interactúan con el VIH-1 de adquisición de imágenes gp120 y la ICAM-1 en bi-capas, iii) por microscopía TIRF, unnd iv) el análisis de datos. Este sistema genera imágenes de alta resolución de la interfaz de VS más allá de lo logrado con el convencional de células-células del sistema ya que permite la detección de distintos grupos de los distintos componentes moleculares de VS, junto con las moléculas de señalización específicos de contratación de estos sub-dominios.

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Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

En este artículo se describe un método para visualizar la formación de una sinapsis virológica de VIH-1 sobre de cristal inducido por el apoyo bicapas planas de reflexión total interna de fluorescencia (TIRF) microscopía. El método también se puede combinar con la tinción de inmunofluorescencia para detectar la activación y la redistribución de las moléculas de señalización que se producen durante el VIH-1 sobre inducida por la formación de sinapsis virológicas.

Imagen del VIH-1 sobre inducida sinapsis virológica y señalización en la bicapa lipídica sintéticas

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.1K vistas.  New York University Langone School of Medicine. En este artículo se describe un método para visualizar la formación de una sinapsis virológica de VIH-1 sobre de cristal inducido por el apoyo bicapas planas de reflexión total interna de fluorescencia (TIRF) microscopía. El método también se puede combinar con la tinción de inmunofluorescencia para detectar la activación y la redistribución de las moléculas de señalización que se producen durante el VIH-1 sobre inducida por la formación de sinapsis viroló...