Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni NIH AI071815 (CEH) e la tabella di marcia Nanomedicina premio Development Center PN2EY016586 (MLD).

<ol>
	<li>Bastiani, L., Laal, S., Kim, M., Zolla-Pazner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+cell-dependent+alterations+in+envelope+components+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+virions.">Host cell-dependent alterations in envelope components of human immunodeficiency virus type 1 virions.</a> J. Virol. 71, 3444-3450 (1997).</li><li>Dimitrov, D. S., Willey, R. L., Sato, H., Chang, L. J., Blumenthal, R., Martin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+infection+kinetics.">Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 infection kinetics.</a> J. Virol. 67, 2182-2190 (1993).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+Bond+Dynamics+in+Contacts+between+T+Lymphocytes+and+Glass-supported+Planar+Bilayers+Reconstituted+with+the+Immunoglobulin-related+Adhesion+Molecule+CD58.">Adhesive Bond Dynamics in Contacts between T Lymphocytes and Glass-supported Planar Bilayers Reconstituted with the Immunoglobulin-related Adhesion Molecule CD58.</a> J. Biol. Chem. 272, 15782-15788 (1997).</li><li>Fortin, J. F., Cantin, R., Lamontagne, G., Tremblay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-derived+ICAM-1+glycoproteins+incorporated+on+human+immunodeficiency+virus+type+1+are+biologically+active+and+enhance+viral+infectivity.">Host-derived ICAM-1 glycoproteins incorporated on human immunodeficiency virus type 1 are biologically active and enhance viral infectivity.</a> J. Virol. 71, 3588-3596 (1997).</li><li>Frank, I., Stoiber, H., Godar, S., Stockinger, H., Steindl, F., Katinger, H. W., Dierich, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquisition+of+host+cell-surface-derived+molecules+by+HIV-1.">Acquisition of host cell-surface-derived molecules by HIV-1.</a> Aids. 10, 1611-1620 (1996).</li><li>Hioe, C. E., Bastiani, L., Hildreth, J. E., Zolla-Pazner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cellular+adhesion+molecules+in+HIV+type+1+infection+and+their+impact+on+virus+neutralization.">Role of cellular adhesion molecules in HIV type 1 infection and their impact on virus neutralization.</a> AIDS Res. Hum. Retroviruses. 14, S247-S254 (1998).</li><li>Hioe, C. E., Chien, P. C., Lu, C., Springer, T. A., Wang, X. H., Bandres, J., Tuen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LFA-1+expression+on+target+cells+promotes+human+immunodeficiency+virus+type+1+infection+and+transmission.">LFA-1 expression on target cells promotes human immunodeficiency virus type 1 infection and transmission.</a> J. Virol. 75, 1077-1082 (2001).</li><li>Jolly, C., Kashefi, K., Hollinshead, M., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+cell+to+cell+transfer+across+an+Env-induced,+actin-dependent+synapse.">HIV-1 cell to cell transfer across an Env-induced, actin-dependent synapse.</a> J. Exp. Med. 199, 283-293 (2004).</li><li>Jolly, C., Mitar, I., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+an+intact+T-cell+actin+and+tubulin+cytoskeleton+for+efficient+assembly+and+spread+of+human+immunodeficiency+virus+type+1.">Requirement for an intact T-cell actin and tubulin cytoskeleton for efficient assembly and spread of human immunodeficiency virus type 1.</a> J. Virol. 81, 5547-5560 (2007).</li><li>McDonald, D., Wu, L., Bohks, S. M., KewalRamani, V. N., Unutmaz, D., Hope, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+HIV+and+its+receptors+to+dendritic+cell-T+cell+junctions.">Recruitment of HIV and its receptors to dendritic cell-T cell junctions.</a> Science. 300, 1295-1297 (2003).</li><li>Pearce-Pratt, R., Malamud, D., Phillips, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+cytoskeleton+in+cell-to-cell+transmission+of+human+immunodeficiency+virus.">Role of the cytoskeleton in cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus.</a> J. Virol. , 682898-682905 (1994).</li><li>Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ImageJ. , (1997).</li><li>Rizzuto, C. D., Sodroski, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+virion+ICAM-1+to+human+immunodeficiency+virus+infectivity+and+sensitivity+to+neutralization.">Contribution of virion ICAM-1 to human immunodeficiency virus infectivity and sensitivity to neutralization.</a> J. Virol. 71, 4847-4851 (1997).</li><li>Vardhana, S., Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+Planar+Bilayers+for+the+Formation+of+Study+of+Immunological+Synapses+and+Kinapse.">Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse.</a> J. Vis. Exp. (19), e947-e947 (2008).</li><li>Vasiliver-Shamis, G., Cho, M. W., Hioe, C. E., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+gp120-induced+partial+T-cell+receptor+signaling+creates+an+F-actin-depleted+zone+in+the+virological+synapse.">Human immunodeficiency virus type 1 envelope gp120-induced partial T-cell receptor signaling creates an F-actin-depleted zone in the virological synapse.</a> J. Virol. 83, 11341-11355 (2009).</li><li>Vasiliver-Shamis, G., Tuen, M., Wu, T., Starr, T., Cameron, T., Thomson, R., Kaur, G., Liu, J., Visciano, M., Li, H., Kumar, R., Ansari, R., Han, D., Cho, M., Dustin, M. L., Hioe, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+gp120+induces+a+stop+signal+and+virological+synapse+formation+in+noninfected+CD4++T+cells.">Human immunodeficiency virus type 1 envelope gp120 induces a stop signal and virological synapse formation in noninfected CD4+ T cells.</a> J. Virol. 82, 9445-9457 (2008).</li><li>Zhu, P., Liu, J., Bess, J., Chertova, E., Lifson, J., Grise, H., Ofek, G., Taylor, K., Roux, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+three-dimensional+structure+of+AIDS+virus+envelope+spikes.">Distribution and three-dimensional structure of AIDS virus envelope spikes.</a> Nature. 441, 847-852 (2006).</li></ol>

Gli autori dichiarano assenza di conflitto di interessi.

Studi precedenti hanno VS visualizzato nella cellula-cellula sistema coniugato, tuttavia questi studi non hanno fornire immagini di alta risoluzione sufficiente per visualizzare le strutture supramolecolari alla sinapsi. Nel nostro laboratorio, abbiamo utilizzato il vetro supportato sistema bistrato planare per rappresentare la superficie di cellule infettate esprimono gp120 il virus e la molecola di adesione cellulare ICAM-1. In combinazione con la microscopia TIRF, che rileva segnali di fluorescenza entro 100-200 nm dalla superficie doppio strato con un alto rapporto segnale-rumore, siamo stati in grado di rilevare la segregazione supramolecolare di gp120 da ICAM-1 a VS. Inoltre, il metodo immunostaining standard può essere applicato al sistema doppio strato ed è stato usato qui per rilevare e quantificare il reclutamento specifico di Lck attivo, ma non Fyn, la gp120-area di contatto a VS 15. Quindi, il bistrato planare offre un sistema sperimentale per immagini ad alta risoluzione dell&#39;interfaccia sinapsi in un piano 2D TIRF microscopia, così come i metodi di illuminazione a largo campo o confocale. Tuttavia, il sistema presenta anche limitazioni regolazione mobilità ligando, fuori piano di piegatura, e le fluttuazioni di membrane biologiche non riprodotta da doppi strati planari. Inoltre, questo è un sistema in-vitro e quindi ha limitazioni, quali la mancanza di altre molecole di membrana che sarebbe presente in una cellula infettata e la macchina citoscheletro che regola la mobilità molecolare e la motilità cellulare. Inoltre, la dinamica e la distribuzione delle molecole, come trimeri rispetto monomeri di gp120, non può essere rappresentato fisiologicamente sul doppio strato. Tuttavia, anche con queste limitazioni, questo sistema è ancora molto utile per studiare virus-cellula o interazioni cellula-cellula, e questi metodi possono servire come guida utile per i ricercatori che ricercano immagini ad alta risoluzione per rilevare organizzazione supramolecolare che non è distinguibile nel convenzionale cellula-cellula sistema coniugato.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Il suo tag HIV gp120 </td><td> Regalo da Dr. Cho </td><td></td><td> DH12 </td></tr><tr><td> Il suo tag HIV gp120 </td><td> Tecnologia Immune </td><td></td><td> Vari X4 o R5 tropico </td></tr><tr><td> HSA </td><td> Williams Medical Company </td><td> 521302 </td><td> Albumina di siero umano al 25% </td></tr><tr><td> Amicon Filtri ultracentrifugo </td><td> Millipore </td><td> UFC803024 </td><td> Ultracel-30K </td></tr><tr><td> Lck Coniglio mAb </td><td> Segnalazione cellulare </td><td> 2787 </td><td></td></tr><tr><td> p-Lck Coniglio pab </td><td> Santa Cruz Biotechnology Inc. </td><td> Sc-101728 </td><td> Tyr 394 </td></tr><tr><td> Fyn Coniglio mAb </td><td> Millipore </td><td> 04-353 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 568 2 °; Ab </td><td> Molecular Probes </td><td> A11034 </td><td> Capra anti-coniglio IgG (H + L) </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 </td><td> Molecular Probes </td><td> A-20000 </td><td> carbossilico succinimmidil estere </td></tr><tr><td> FCS2 Camera </td><td> Bioptechs </td><td> 060319-2-03 </td><td></td></tr><tr><td> Microaqueduct diapositive </td><td> Bioptechs </td><td> 130119-5 </td><td></td></tr><tr><td> 30 millimetri rotonda w / fori </td><td> Bioptechs </td><td> 1907-08-750 </td><td> 0,75 millimetri di spessore </td></tr><tr><td> Rettangolo Guarnizione </td><td> Bioptechs </td><td> 1907-1422-250 </td><td> 14x24 0,25 millimetri di spessore </td></tr><tr><td> Tygon Tubing </td><td> Bioptechs </td><td> 20202275 </td><td> 1/16 &quot;(25 piedi) </td></tr><tr><td> Valvola a tre vie </td><td> BioRad </td><td> 7328103 </td><td></td></tr><tr><td> Rubinetto a due vie </td><td> BioRad </td><td> 7328102 </td><td></td></tr><tr><td> Presentazione Sticky I 0,2 Luer </td><td> Ibidi </td><td> 80168 </td><td></td></tr><tr><td> Coprire gli occhiali </td><td> Ibidi </td><td> 10812 </td><td></td></tr><tr><td> Siringa da 1 ml </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> CANI-NTA </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 790404C </td><td></td></tr><tr><td> DOPC </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 850375C </td><td></td></tr><tr><td> Vetrino coprioggetto </td><td> Bioptechs </td><td> 40-1313-0319 </td><td> 40 millimetri </td></tr><tr><td> TIRF microscopio </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ImageJ </td><td> National Institutes of Health </td><td></td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/~~V</a> </td></tr></tbody></table>

imaging of hiv-1 envelope-induced virological synapse and signaling on synthetic lipid bilayers

Virus dell&#39;immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) l&#39;infezione si verifica in modo più efficiente per la trasmissione via cellulare delle cellule 2,10,11. Questa cellula di trasferimento di celle tra cellule T CD4 + comporta la formazione di una sinapsi virologica (VS), che è un F-actina-dipendente cellula-cellula giunzione formata per l&#39;impegno di HIV-1 gp120 busta sulla cellula infettata con CD4 e il recettore di chemiochina (CKR) CXCR4 o CCR5 sulla cellula bersaglio 8. Oltre a gp120 e suoi recettori, proteine ​​di membrana altri, in particolare la molecola di adesione LFA-1 e dei suoi ligandi, la famiglia ICAM, giocano un ruolo importante nella formazione VS e la trasmissione del virus come sono presenti sulla superficie di cellule infettate da virus donatore e cellule bersaglio, nonché sulla busta di HIV-1 virioni 1,4,5,6,7,13. Formazione VS è accompagnata anche da eventi intracellulari di segnalazione che sono trasdotti come risultato di gp120-impegno dei suoi recettori. Infatti, abbiamo recentemente dimostrato che i CD4 &lt;sup&gt; + l&#39;interazione delle cellule T con gp120 induce il reclutamento e la fosforilazione di molecole di segnalazione associate al TCR signalosome compresa Lck, CD3ζ, ZAP70, LAT, SLP-76, ITK, e PLCγ 15. In questo articolo, vi presentiamo un metodo per visualizzare arrangiamento supramolecolare e membrana-prossimali segnalazione eventi che si svolgono durante la formazione VS. Prendiamo vantaggio del vetro supportato planare bi-strato come sistema modello riduzionista per rappresentare la superficie di cellule infettate da HIV recanti l&#39;involucro virale gp120 e la molecola di adesione cellulare ICAM-1. Il protocollo descrive procedure generali per monitorare HIV-1 gp120 indotta VS assemblaggio e gli eventi di attivazione del segnale che comprendono i) bi-strato di preparazione e di montaggio in una cella di flusso, ii) iniezione di cellule e immunofluorescenza per rilevare molecole di segnalazione intracellulare in cellule interagenti con HIV-1 gp120 di acquisizione immagini e ICAM-1 in bi-strati, iii) da microscopia TIRF, unond iv) l&#39;analisi dei dati. Questo sistema genera immagini ad alta risoluzione di interfaccia VS al di là di quello ottenuto con la tradizionale cellula-cellula del sistema in quanto permette di individuare gruppi distinti di singoli componenti molecolari di VS insieme con le molecole di segnalazione specifici assunti a queste sub-domini.

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Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Questo articolo descrive un metodo per visualizzare la formazione di una sinapsi HIV-1 busta-indotta virologici vetro bistrati planari supportate da fluorescenza riflessione interna totale (TIRF) microscopia. Il metodo può anche essere combinato con immunofluorescenza per rilevare l&#39;attivazione e ridistribuzione di molecole di segnalazione che si verificano durante HIV-1 busta indotta la formazione di sinapsi virologica.

Imaging di HIV-1 Envelope indotta Synapse virologica e segnalazione sui doppi strati lipidici sintetici

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.1K Views.  New York University Langone School of Medicine. Questo articolo descrive un metodo per visualizzare la formazione di una sinapsi HIV-1 busta-indotta virologici vetro bistrati planari supportate da fluorescenza riflessione interna totale (TIRF) microscopia. Il metodo può anche essere combinato con immunofluorescenza per rilevare l'attivazione e ridistribuzione di molecole di segnalazione che si verificano durante HIV-1 busta indotta la formazione di sinapsi virologica.