Este trabalho foi financiado pelo NIH concede AI071815 (CEH) e do Roteiro Nanomedicina prêmio Centro de Desenvolvimento PN2EY016586 (MLD).

<ol>
	<li>Bastiani, L., Laal, S., Kim, M., Zolla-Pazner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+cell-dependent+alterations+in+envelope+components+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+virions.">Host cell-dependent alterations in envelope components of human immunodeficiency virus type 1 virions.</a> J. Virol. 71, 3444-3450 (1997).</li><li>Dimitrov, D. S., Willey, R. L., Sato, H., Chang, L. J., Blumenthal, R., Martin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+infection+kinetics.">Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 infection kinetics.</a> J. Virol. 67, 2182-2190 (1993).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+Bond+Dynamics+in+Contacts+between+T+Lymphocytes+and+Glass-supported+Planar+Bilayers+Reconstituted+with+the+Immunoglobulin-related+Adhesion+Molecule+CD58.">Adhesive Bond Dynamics in Contacts between T Lymphocytes and Glass-supported Planar Bilayers Reconstituted with the Immunoglobulin-related Adhesion Molecule CD58.</a> J. Biol. Chem. 272, 15782-15788 (1997).</li><li>Fortin, J. F., Cantin, R., Lamontagne, G., Tremblay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-derived+ICAM-1+glycoproteins+incorporated+on+human+immunodeficiency+virus+type+1+are+biologically+active+and+enhance+viral+infectivity.">Host-derived ICAM-1 glycoproteins incorporated on human immunodeficiency virus type 1 are biologically active and enhance viral infectivity.</a> J. Virol. 71, 3588-3596 (1997).</li><li>Frank, I., Stoiber, H., Godar, S., Stockinger, H., Steindl, F., Katinger, H. W., Dierich, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquisition+of+host+cell-surface-derived+molecules+by+HIV-1.">Acquisition of host cell-surface-derived molecules by HIV-1.</a> Aids. 10, 1611-1620 (1996).</li><li>Hioe, C. E., Bastiani, L., Hildreth, J. E., Zolla-Pazner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cellular+adhesion+molecules+in+HIV+type+1+infection+and+their+impact+on+virus+neutralization.">Role of cellular adhesion molecules in HIV type 1 infection and their impact on virus neutralization.</a> AIDS Res. Hum. Retroviruses. 14, S247-S254 (1998).</li><li>Hioe, C. E., Chien, P. C., Lu, C., Springer, T. A., Wang, X. H., Bandres, J., Tuen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LFA-1+expression+on+target+cells+promotes+human+immunodeficiency+virus+type+1+infection+and+transmission.">LFA-1 expression on target cells promotes human immunodeficiency virus type 1 infection and transmission.</a> J. Virol. 75, 1077-1082 (2001).</li><li>Jolly, C., Kashefi, K., Hollinshead, M., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+cell+to+cell+transfer+across+an+Env-induced,+actin-dependent+synapse.">HIV-1 cell to cell transfer across an Env-induced, actin-dependent synapse.</a> J. Exp. Med. 199, 283-293 (2004).</li><li>Jolly, C., Mitar, I., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+an+intact+T-cell+actin+and+tubulin+cytoskeleton+for+efficient+assembly+and+spread+of+human+immunodeficiency+virus+type+1.">Requirement for an intact T-cell actin and tubulin cytoskeleton for efficient assembly and spread of human immunodeficiency virus type 1.</a> J. Virol. 81, 5547-5560 (2007).</li><li>McDonald, D., Wu, L., Bohks, S. M., KewalRamani, V. N., Unutmaz, D., Hope, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+HIV+and+its+receptors+to+dendritic+cell-T+cell+junctions.">Recruitment of HIV and its receptors to dendritic cell-T cell junctions.</a> Science. 300, 1295-1297 (2003).</li><li>Pearce-Pratt, R., Malamud, D., Phillips, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+cytoskeleton+in+cell-to-cell+transmission+of+human+immunodeficiency+virus.">Role of the cytoskeleton in cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus.</a> J. Virol. , 682898-682905 (1994).</li><li>Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ImageJ. , (1997).</li><li>Rizzuto, C. D., Sodroski, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+virion+ICAM-1+to+human+immunodeficiency+virus+infectivity+and+sensitivity+to+neutralization.">Contribution of virion ICAM-1 to human immunodeficiency virus infectivity and sensitivity to neutralization.</a> J. Virol. 71, 4847-4851 (1997).</li><li>Vardhana, S., Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+Planar+Bilayers+for+the+Formation+of+Study+of+Immunological+Synapses+and+Kinapse.">Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse.</a> J. Vis. Exp. (19), e947-e947 (2008).</li><li>Vasiliver-Shamis, G., Cho, M. W., Hioe, C. E., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+gp120-induced+partial+T-cell+receptor+signaling+creates+an+F-actin-depleted+zone+in+the+virological+synapse.">Human immunodeficiency virus type 1 envelope gp120-induced partial T-cell receptor signaling creates an F-actin-depleted zone in the virological synapse.</a> J. Virol. 83, 11341-11355 (2009).</li><li>Vasiliver-Shamis, G., Tuen, M., Wu, T., Starr, T., Cameron, T., Thomson, R., Kaur, G., Liu, J., Visciano, M., Li, H., Kumar, R., Ansari, R., Han, D., Cho, M., Dustin, M. L., Hioe, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+gp120+induces+a+stop+signal+and+virological+synapse+formation+in+noninfected+CD4++T+cells.">Human immunodeficiency virus type 1 envelope gp120 induces a stop signal and virological synapse formation in noninfected CD4+ T cells.</a> J. Virol. 82, 9445-9457 (2008).</li><li>Zhu, P., Liu, J., Bess, J., Chertova, E., Lifson, J., Grise, H., Ofek, G., Taylor, K., Roux, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+three-dimensional+structure+of+AIDS+virus+envelope+spikes.">Distribution and three-dimensional structure of AIDS virus envelope spikes.</a> Nature. 441, 847-852 (2006).</li></ol>

Os autores declaram nenhum conflito de interesses.

Estudos anteriores têm VS visualizado no sistema conjugado célula-célula, porém esses estudos não fornecem imagens de resolução alta o suficiente para visualizar as estruturas supramoleculares na sinapse. No nosso laboratório, utilizamos o vidro suportada sistema bicamada planar para representar a superfície das células infectadas que expressam o gp120 envelope do vírus e da molécula de adesão celular ICAM-1. Em conjunção com TIRF microscopia, que detecta sinais de fluorescência dentro 100-200 nm a partir da superfície bicamada com uma relação sinal-ruído elevado, fomos capazes de detectar a segregação supramolecular da gp120 a partir de ICAM-1 no VS. Além disso, o método de imunocoloração padrão pode ser aplicada ao sistema de bicamada e foi utilizado aqui para detectar e quantificar o recrutamento específico de Lck activa, mas não Fyn, para a área de contacto gp120-at VS 15. Assim, a bicamada planar oferece um sistema experimental para geração de imagens de alta resolução de interface de sinapse num plano 2D por TIRF microescopia, bem como métodos de iluminação de campo ou gama-confocal. No entanto, o sistema também tem limitações como ajustar mobilidade ligante, fora do plano de flexão, e as flutuações de membranas biológicas não são reproduzidas por bicamadas planas. Além disso, este é um sistema in vitro e, portanto, tem outras limitações, tais como falta de moléculas da membrana outros que estariam presentes em uma célula infectada e as máquinas citoesqueleto, que regula a mobilidade molecular e da motilidade celular. Além disso, as dinâmicas e distribuição das moléculas, tais como trímeros, versus monómeros de gp120, não podem ser representados fisiologicamente sobre a bicamada. No entanto, mesmo com estas limitações, este sistema é ainda muito valiosa para o estudo do vírus na célula ou interacções célula-célula, e estes métodos podem servir como um guia útil para os investigadores que procuram imagens de alta resolução para detectar organização supramolecular que não é perceptível no sistema conjugado convencional célula-célula.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Sua HIV marcados gp120 </td><td> Presente do Dr. Cho </td><td></td><td> DH12 </td></tr><tr><td> Sua HIV marcados gp120 </td><td> Tecnologia imune </td><td></td><td> Vários X4 ou R5 trópico </td></tr><tr><td> HSA </td><td> Williams Medical Company </td><td> 521302 </td><td> Soro Humano 25% de albumina </td></tr><tr><td> Amicon Ultra Filtros Centrífugos </td><td> Millipore </td><td> UFC803024 </td><td> Ultracel-30K </td></tr><tr><td> Lck Coelho mAb </td><td> Sinalização celular </td><td> 2787 </td><td></td></tr><tr><td> p-Lck coelho pAb </td><td> Santa Cruz Biotechnology Inc. </td><td> Sc-101728 </td><td> Tyr 394 </td></tr><tr><td> Fyn Coelho mAb </td><td> Millipore </td><td> 04-353 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 568 2 °; Ab </td><td> Molecular Probes </td><td> A11034 </td><td> Cabra anti-coelho IgG (H + L) </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 </td><td> Molecular Probes </td><td> Um-20000 </td><td> carboxilico succinimidil éster </td></tr><tr><td> FCS2 Câmara </td><td> Bioptechs </td><td> 060319-2-03 </td><td></td></tr><tr><td> Microaqueduct slide </td><td> Bioptechs </td><td> 130119-5 </td><td></td></tr><tr><td> Rodada 30 milímetros w / furos </td><td> Bioptechs </td><td> 1907-08-750 </td><td> 0,75 milímetros de espessura </td></tr><tr><td> Retângulo Junta </td><td> Bioptechs </td><td> 1907-1422-250 </td><td> 14x24 0,25 milímetros de espessura </td></tr><tr><td> Tubulação de Tygon </td><td> Bioptechs </td><td> 20202275 </td><td> 1/16 &quot;(25 pés) </td></tr><tr><td> Torneira de três vias </td><td> BioRad </td><td> 7328103 </td><td></td></tr><tr><td> Two-way Torneira </td><td> BioRad </td><td> 7328102 </td><td></td></tr><tr><td> Deslize pegajoso eu 0,2 Luer </td><td> Ibidi </td><td> 80168 </td><td></td></tr><tr><td> Cubra óculos </td><td> Ibidi </td><td> 10812 </td><td></td></tr><tr><td> Seringa de 1ml </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> CÃES-NTA </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 790404C </td><td></td></tr><tr><td> DOPC </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 850375C </td><td></td></tr><tr><td> Vidro lamela </td><td> Bioptechs </td><td> 40-1313-0319 </td><td> 40 milímetros </td></tr><tr><td> Microscópio TIRF </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ImageJ </td><td> National Institutes of Health </td><td></td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/~~V</a> </td></tr></tbody></table>

imaging of hiv-1 envelope-induced virological synapse and signaling on synthetic lipid bilayers

Vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) a infecção ocorre de forma mais eficiente através de célula para célula de transmissão 2,10,11. Esta célula para a transferência de células entre células T CD4 + envolve a formação de uma sinapse virológica (VS), que é uma F-actina-dependente junção célula-célula formada a partir do envolvimento do HIV-1 envelope gp120 na célula infectada com CD4 e o receptor de quimiocina (CKR) CCR5 ou CXCR4 na célula alvo 8. Além disso a gp120 e seus receptores, outras proteínas da membrana, em particular a molécula de adesão LFA-1 e os seus ligandos, a família ICAM, desempenham um papel importante na formação VS e transmissão de vírus em que estejam presentes na superfície das células infectadas pelo vírus de doadores e células alvo, bem como no envelope de HIV-1 viriões 1,4,5,6,7,13. Formação VS é também acompanhada por eventos de sinalização intracelulares que são transduzidas como um resultado da gp120-engajamento dos seus receptores. Na verdade, temos recentemente mostrou que os CD4 &lt;sup&gt; + interacção das células T com gp120 induz o recrutamento e fosforilação de moléculas de sinalização associados com o signalosome TCR incluindo Lck, CD3ζ, ZAP70, LAT, SLP-76, ITK, e PLCγ 15. Neste artigo, apresentamos um método para visualizar arranjo supramolecular e eventos membrana proximais de sinalização que ocorrem durante a formação do VS. Nós tirar vantagem do vidro suportada sistema bi-camada plana como um modelo reducionista para representar a superfície de células infectadas pelo HIV munidos do envelope viral gp120 e da molécula de adesão celular ICAM-1. O protocolo descreve procedimentos gerais para a monitorização do HIV-1 gp120 induzida por VS montagem e os eventos de sinal de activação que incluem i) preparação bi-camada e de montagem de uma célula de fluxo, ii) A injecção de células e de coloração de imunofluorescência para detectar moléculas de sinalização intracelulares em células interagindo com HIV-1 de aquisição de imagem gp120 e ICAM-1 em bi-camadas, iii) por microscopia TIRF, umand iv) análise dos dados. Este sistema gera imagens de alta resolução de VS interface além que a obtida com o sistema de célula-célula convencional uma vez que permite a detecção de grupos distintos de componentes individuais moleculares de VS, juntamente com moléculas de sinalização específicas recrutados para essas sub-domínios.

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Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Este artigo descreve um método para visualizar a formação de uma sinapse envelope de HIV-1 induzida por virológica em vidro suportados bicamadas planares por reflexão total interna de fluorescência microscopia (TIRF). O método pode também ser combinado com coloração de imunofluorescência para detectar a activação e redistribuição de moléculas de sinalização que ocorrem durante o HIV-1 a formação de sinapses envelope induzida virológica.

Imagem do HIV-1 Synapse Envelope induzida virológica e Sinalização em bicamadas lipídicas sintéticas

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

imaging-hiv-1-envelope-induced-virological-synapse-signaling-on

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.1K visualizações.  New York University Langone School of Medicine. Este artigo descreve um método para visualizar a formação de uma sinapse envelope de HIV-1 induzida por virológica em vidro suportados bicamadas planares por reflexão total interna de fluorescência microscopia (TIRF). O método pode também ser combinado com coloração de imunofluorescência para detectar a activação e redistribuição de moléculas de sinalização que ocorrem durante o HIV-1 a formação de sinapses envelope induzida virológica.