Ce travail a été soutenu par la US Defense Advanced Research Projects Agency contrat N66001-12-C-4039 à YS, une subvention de la Fondation Alfred P. Sloan à RSL, et US National Institutes of Health des subventions R01 et R21 CA130266 HG003224 à FPRFPR était également soutenu par une bourse de l&#39;Institut canadien de recherches avancées et par le Programme des chaires de recherche du Canada excellence.

1. Génération de ProMonsters <ol><li> Préparer la cassette GFP universelle de remplacement en amplifiant un tetO 2-GFP marqueur et le marqueur URA3 du plasmide pYOGM012 (résistance à l&#39;ampicilline) en utilisant des amorces de séquences: GGATCCCCGGGTTAATTAAGGCGCGCCAGATCTGTTTAGCTTGCC CAAGCTCCTCGAGTAATTCG et GGCGTTAGTATCGAATCGACAGCAGTATAGCGACCAGCATTCAC GTACCGGGTAATAACTGATATAAT (régions en gras fournir une homologie avec les régions adjacentes de la cassette kanMX4 permettant un remplacement ciblé). La réaction de PCR doit être effectuée avec la polymérase Phusion, tampon HF, et 3% de diméthylsulfoxyde (New England Biolabs) à partir de la concentration d&#39;ADN matrice de 0,5 ng / ul. Le programme de PCR est de 98 ° C pendant 30 s et 35 cycles de 98 ° C pendant 10 sec, 49 ° C pendant 30 sec, et 72 ° C pendant 1,5 min. Le volume de réaction doit être&gt; 50 pl de fournir suffisamment d&#39;ADN pour chaque expérience de transformation. Nous purifionsle produit en utilisant un kit de purification de PCR QIAquick (Qiagen) avec ~ 50 pl de la réaction de PCR traités par colonne, mais en sautant l&#39;étape de purification peut augmenter le rendement des transformants. En variante, libérer un fragment contenant le tetO 2-GFP et URA3 marqueurs, ainsi que les régions homologues de kanMX4 ciblage, par digestion du plasmide pYOGM057 (résistance à l&#39;ampicilline) en utilisant l&#39;enzyme de restriction EcoRI (New England Biolabs). La concentration d&#39;ADN dans cette réaction devrait être ~ 30 ng / ul. Le volume de réaction doit être&gt; 34 pl. Pour l&#39;intégration de la cassette de GFP dans une région autre que kanMX4, ajuster la région d&#39;homologie des amorces de PCR ci-dessus pour les séquences homologues appropriés. </li><li> Transformer une souche haploïde un de la collection KO levure kanMX4 12 avec la cassette de délétion GFP universelle. En suivant le protocole par Woods et Gietz 13 0,34 ul de laÉchantillon d&#39;ADN (PCR purifié produit ou non purifiée digestion de restriction) doit être utilisé pour chaque expérience de transformation. Plaque cinquième du mélange de transformation sur une plaque de CAA-Ura (0,67% de base azotée de levure, glucose 2%, 0,6% d&#39;acide Casamino, 0,0025% hémisulfate adénine, tryptophane 0,005%, et 2% de gélose). </li><li> Streak les transformants sur une nouvelle CAA-Ura plaque pour obtenir des colonies isolées. </li><li> Transfert des cellules d&#39;une colonie sur une plaque de YPDA contenant 200 ug / ml de G418 pour confirmer l&#39;absence de croissance. Pour confirmer l&#39;intégration réussie GFP, suivez les étapes (1,5) - (1,9) pour effectuer une PCR sur colonie. </li><li> Ajouter de cellules prélevées sur une colonie dans 2 pl de tampon de lyse (0,1 M phosphate de sodium, pH 7,4, 1 zymolyase unité de ZymoResearch) dans un tube de 0,2 ml PCR ou un puits d&#39;une plaque de 96 puits. Mélanger par pipetage dans la solution et sur une pointe de pipette. </li><li> Superposition avec une goutte (environ 20 pi) d&#39;une huile minérale à l&#39;aide d&#39;un Pipetman P200 (Gilson). </li><li> Incuber le mélange à 37 °C pendant 20 min, puis à 95 ° C pendant 10 min. </li><li> Diluer le lysat avec 50 pi d&#39;eau. Mélanger à la pipette la solution et sortir dix fois. </li><li> Analyser 1 pl du lysat en utilisant 10-yl réactions PCR avec (A) une amorce sens qui s&#39;hybride à la région flanquante en amont associé à une amorce de la séquence CCTGAGAAAGCAACCTGACC (285 pb à partir du début de la cassette), (B) une marche arrière amorce qui s&#39;hybride à la région en aval associé à une amorce de la séquence GCATTGGGTCAACAGTATAG (375 pb de la fin), (C) deux amorces qui s&#39;hybrident à des séquences de kanMX4 CGTACTCCTGATGATGCATG et GACGAAATACGCGATCGCTG (181 pb), et (D) deux amorces qui recuit de la séquence de type sauvage du gène ciblé (Figure 4). (D) est important car environ 8% des souches dans les collections de suppression sont connus pour contenir aneuploïdie 14. Transformant correct doit être positive avec (A) et (B), et négative avec (C) et (D). </li><li> Pour mettre en place unGMToolkit en le transformant, ajouter environ 250.000 cellules de la souche transformée et 250.000 cellules de chacune des RY0146 (contenant GMToolkit-a) ou RY0148 (contenant GMToolkit-α) dans un tube Eppendorf 1,6-ml. Vortex. Les génotypes des RY0146 RY0148 et sont MATa lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 can1Δ :: GMToolkit-a [CMVpr-rtTA kanMX4 STE2pr-Sp-His5] et MATa lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 can1Δ :: GMToolkit-α [CMVpr-rtTA NatMX4 STE3pr- LEU2], respectivement. pr désigne promoteur. Le nombre de cellules doit être estimée à partir de la densité optique de la culture précédente. </li><li> Centrifuger à 800 xg pendant 2 min. </li><li> Enlever le surnageant. </li><li> Afin de permettre l&#39;échange d&#39;air, faire un trou sur le couvercle à l&#39;aide d&#39;une punaise traitée avec de l&#39;éthanol à 70%. </li><li> Ajouter 50 ul de YPDA moyenne (1% extrait de levure, peptone à 2%, 2% de glucose et 0,003% hemisulfat adéninee). Vortex. </li><li> Centrifuger à 800 xg pendant 5 min. </li><li> Placer le tube dans une boîte humide. Ceci peut être réalisé avec une boîte vide pointe, un stand petite astuce, et une serviette en papier humide. </li><li> Incuber la boîte de nuit à 30 ° C. </li><li> Sélectionnez diploïdes accouplées en commençant par stries sur les cellules sur une plaque de CAA-Ura. Incuber la plaque à 30 ° C pendant une journée. </li><li> Prélever des cellules de la zone, les stries en vrac sur de faire des colonies isolées sur des plaques YPDA (1% extrait de levure, peptone à 2%, glucose 2%, 0,003% hémisulfate adénine et agar à 2%) contenant 200 ug / ml de G418 pour la sélection des diploïdes contenant GMToolkit-a ou 100 pg / ml nourséothricine (Nat) 15 pour la sélection des diploïdes contenant GMToolkit-α. </li><li> Incuber la plaque à 30 ° C pendant 3 jours. </li><li> A partir d&#39;une colonie isolée, transférer la plupart des cellules à 500 pi de milieu GNA sans agar (1% extrait de levure, 3% Difco bouillon nutritif, et 5% de glucose, glucose autoclave et le reste du til composants séparément × 2 solutions pour éviter la caramélisation) dans un tube de culture de 5 ml avec le couvercle desserré. </li><li> Tourner le tube horizontalement pendant cinq heures à 30 ° C. L&#39;axe de la rotation doit être parallèle à l&#39;axe longitudinal du tube. </li><li> Confirmer que les colonies utilisées dans (1.21) sont Ura + par les stries sur une plaque de CAA-Ura. </li><li> Centrifuger le tube à 800 xg pendant 2 min. Jeter le surnageant. </li><li> Ajouter 500 ul de milieu de sporulation minime (1% d&#39;acétate de potassium, l&#39;acétate de zinc à 0,005%; filtre à stériliser). Vortex. </li><li> Centrifuger le tube à 800 xg pendant 2 min. Jeter le surnageant. </li><li> Répétition (1,25) - (1,26) deux fois. </li><li> Ajouter 1 ml de milieu de sporulation minimal supplémenté avec 7,5 ug / ml de lysine, 7,5 mg / ml de leucine, 5 pg / ml d&#39;histidine, 5 ug / ml de méthionine et 1,25 pg / ml d&#39;uracile (pour améliorer le taux de sporulation des souches auxotrophes) . Vortex. </li><li> Tourner le tube à température ambiante pendant un jour. </li><li> Tourner le tube à 30 ° C pendant 2 jours. </li><li> Centrifuger 125 ul de ce mélange dans un tube de 1,6 ml Eppendorf à 800 xg pendant 2 min. Jeter le surnageant. </li><li> Ajouter 50 ul de solution zymolyase (100 mM de tampon phosphate de sodium, pH 7,4, 1 M de sorbitol, et 2 unités de zymolyase ZymoResearch). Mélanger par pipetage dans la solution et sur une pointe de pipette. </li><li> Incuber à 30 ° C pendant 1 heure. </li><li> Ajouter 50 ul de 0,02% de NP-40. Mélanger par pipetage dans la solution et sur une pointe de pipette. </li><li> Laisser le tube à température ambiante pendant cinq minutes. </li><li> Ajouter 500 ul d&#39;eau. </li><li> Placer le tube sur la glace. </li><li> Soniquer ce mélange deux fois avec le réglage de sortie de 1 (faible réglage) pendant 15 secondes en utilisant une microsonde 3,2 mm avec Sonifier 450 (Branson). Entre les deux tours de sonication, mettre le tube sur la glace pour ramener la température à 0 ° C ~ </li><li> Centrifuger les tubes à 800 xg pendant 5 min. Jeter le surnageant. </li><li> Ajouter 200 ul de SC-Ura-His(A) ou SC-Ura-Leu (α) moyenne, selon que la croix est d&#39;incorporer un ou GMToolkit-GMToolkit-α. À préparer le support, SC-Ura-His-Leu moyen (0,67% de base azotée de levure, glucose 2%, arginine 0,01%, 0,01% d&#39;acide aspartique, acide glutamique 0,01%, isoleucine 0,01%, 0,01% de lysine, méthionine 0,01% , 0,01% phénylalanine, la sérine 0,08%, thréonine 0,04%, tyrosine 0,002%, valine 0,03%, 0,0025% adénine, tryptophane 0,005%, 0,003% adénine, et 0,005% de tryptophane) et le compléter par l&#39;histidine ou la leucine stérile avant utilisation à l&#39; concentration finale de 0,01%. </li><li> Faire un trou sur le couvercle à l&#39;aide d&#39;une épingle traitée avec de l&#39;éthanol 70%. </li><li> Tourner le tube horizontalement à 30 ° C pendant 2 jours. L&#39;axe de la rotation doit être parallèle à l&#39;axe longitudinal du tube. </li><li> Série sur les cellules sur une plaque de gélose SC-Ura-His ou SC-Ura-Leu (les mêmes ingrédients que ci-dessus, plus 2% d&#39;agar, l&#39;acide aspartique et la thréonine doit être ajouté après unutoclaving, ajouter l&#39;histidine ou la leucine avant de couler) pour faire des colonies isolées des souches ProMonster. </li></ol> 2. Cyclisme sexuelle <ol><li> Faire pivoter une culture d&#39;une souche de deletion GFP établie dans 100 pi de SC-His (a) ou SC-Leu (α) en fonction du type de couplage à 30 ° C pendant la nuit en utilisant un tube de 1,6 ml Eppendorf. Pour l&#39;échange d&#39;air, faire un trou à l&#39;aide d&#39;une punaise traitée avec de l&#39;éthanol à 70%. Tourner le tube horizontalement. L&#39;axe de la rotation doit être parallèle à l&#39;axe longitudinal du tube. Il est possible de traverser de multiples souches en masse via l&#39;accouplement. Quand un échantillon trié est directement utilisé à cette fin, la culture des cellules dans 200 ul à 30 ° C pendant 2 jours. Pour préparer le milieu, ajouter uracile (concentration finale: 0,0025%) et l&#39;histidine (0,01%) ou la leucine (0,01%) pour SC-Ura-His-Leu moyenne. </li><li> Mélanger 250.000 par-cellules haploïdes et 250.000 α-haploïdes cellules souches de deletion de GFP dans un Eppe 1,6 mlTube ndorf. Vortex. </li><li> Accoupler ces cellules par les étapes suivantes (1,11) - (1,17). </li><li> Transférer 10 ul du mélange de l&#39;accouplement à 500 moyen GNA ul contenant 200 ug / ml de G418 et 100 pg / ml Nat dans un tube de culture de 5 ml avec un couvercle desserré. Le point de départ DO 600 est à peu près 0,1. </li><li> Tournez la culture à 30 ° C pendant 24 heures. Cela permet la sélection des diploïdes parce que les diploïdes contenant à la fois dans kanMX4 GMToolkit-a et NatMX4 dans GMToolkit-α peuvent se développer en présence de G418 et Nat (figure 3). </li><li> Transférer 20 ul de la culture d&#39;une journée à 500 pi de frais GNA contenant du G418 et Nat. Le point de départ DO 600 est à peu près 0,2. </li><li> Faire tourner le tube à 30 ° C pendant 5 heures pour amener les cellules à la phase logarithmique (OD 600 de ~ 1). </li><li> Suivez les étapes (1,24) - (1,38) à sporuler les diploïdes et isoler les spores. </li><li> Fractionner la suspension de cellules sporulées dans deux 300-pipièces et mettre chacun dans une séparée de 1,5 ml tube Eppendorf. </li><li> Centrifuger les tubes à 800 xg pendant 5 min. Jeter le surnageant. </li><li> Pour le culot d&#39;un tube, ajouter 100 ul de SC-Son moyen pour sélectionner un haploïdes-. Pour le culot de l&#39;autre tube, ajouter 100 ul de SC-Leu moyen pour sélectionner α-haploïdes. </li><li> Faire tourner les tubes à 30 ° C pendant une nuit. La finale DO 600 doit être inférieur à 0,5. Si DO 600 a tendance à être trop élevée, essayez de culture à température ambiante. </li><li> Pour induire la GFP, ajouter 100 ul de frais SC-His (a) ou SC-Leu (α) contenant 20 ug / ml de doxycycline. La concentration finale de la doxycycline est de 10 pg / ml. Vortex. </li><li> Faire tourner les tubes à 30 ° C pendant 2 jours. </li></ol> 3. Cytométrie en flux <ol><li> Ajouter 900 ul de pré-filtrée tampon TE (pH 7,5) contenant 10 pg / ml de doxycycline à un tube en polypropylène de 5 ml (BD Falcon # 352063) avec le bouchon remplacée par une cellulebouchon du filtre à partir d&#39;un tube en polystyrène de 5 ml (BD Falcon n ° 352235). Des tubes en polypropylène sont adaptés pour la cytométrie en flux. Le bouchon du filtre est nécessaire pour éliminer les particules de grande taille. </li><li> Placez délicatement 75 pl de tampon TE avec de la doxycycline sur le couvercle de la cellule-filtre. </li><li> Ajouter 25 ul de cellules induites à la solution sur le bouchon. </li><li> Tout en appuyant la pointe de Pipetman contre la maille, tirer l&#39;ensemble de la solution combinée à travers le tamis. </li><li> Appuyez sur le bouchon du filtre et le tube vortex. </li><li> Préparer des tubes de prélèvement (1,6 ml tubes Eppendorf) remplis avec 200 pi de SC-His-Leu ou SC. </li><li> Démarrez le trieur de cellules et ajuster les réglages selon le manuel du fabricant. </li><li> Vortex fois le tube de prélèvement (pour enduire le mur avec le support) et le tube contenant des cellules avant de les charger sur le trieur de cellules. </li><li> Acquérir des données de cytométrie en flux de l&#39;échantillon. Une souche ne contenant pas de GFP peut être un témoin négatif. </li><li> Dessinez portes pour le tri. (A)Pour éviter des agrégats de cellules, qui pourraient présenter intensité élevée GFP, jetez valeurs aberrantes avec largeur d&#39;impulsion disproportionnée pour diffusion vers l&#39;avant (FSC) en utilisant un terrain de largeur d&#39;impulsion et la hauteur d&#39;impulsion pour MoFlo trieuse ou disproportionnellement faible hauteur FSC par une parcelle de hauteur FSC et FSC zone pour FACSAria trieur (Figure 5, en haut à gauche du panneau). (B) Depuis grande FSC (région) est prévu pour les agrégats de cellules, les cellules ne prennent en bas à 20% en CFA, tout en évitant les régions ayant la plus faible dispersion FSC et latérale (SSC) où les valeurs débris cellulaires sont souvent trouvés (figure 5, en haut à droite du panneau). (C) SSC (surface) et GFP signal (région) sont souvent corrélées positivement. Parce que tout simplement en prenant les plus brillants cellules données les portes ci-dessus va également enrichir des cellules à haute valeur SSC, dessiner une porte le long de la périphérie de la population utilisant une parcelle de l&#39;intensité de la GFP et de la SSC à prendre un pourcentage similaire de cellules les plus brillants de chaque point de l&#39;axe de la SSC (figure 5, bottom-gauche diagramme). Dans la population sélectionnée (C) doit être 0.1-1% de la population sélectionnée dans (B). </li><li> Trier 200 cellules dans le tube de prélèvement, compte tenu des critères dans (3.10). Pour un procédé en masse ou pour d&#39;autres projets nécessitant une population plus complexe, trier plus de cellules que nécessaire. </li><li> Vortexer le tube de prélèvement pour couvrir les cellules triées avec le milieu. </li><li> Un sous-ensemble de plaque de cellules (par exemple, 50 cellules) sur une plaque de YPDA pour le génotypage. </li><li> Incuber la plaque à 30 ° C pendant 2 jours. </li><li> Faire un lysat pendant environ 12 colonies en suivant les étapes (1,5) - (1,8). </li><li> Transférer les cellules résiduelles sur la pointe utilisée dans (1,5) à un endroit sur une plaque YPDA contenant du G418 et Nat doucement toucher la plaque avec la pointe. Haploïdes sélectionnés ne doivent pas se développer sur cette plaque. Diploïdes peuvent avoir des copies GFP plus et peut donc être plus claire. Ce test peut montrer l&#39;efficacité de la sélection haploïde. </li><li> Pour le génotypage, l&#39;analyse 1 pl du lysat en utilisant un 10-ul PCR reaction avec une amorce sens qui s&#39;hybride à la région flanquante en amont de chaque gène délété associé à une amorce de la séquence CCTGAGAAAGCAACCTGACC. Les réactions de PCR multiplex si possible (les conditions peuvent être déterminées en utilisant des lysats de mutants simples). La PCR peut être effectuée dans un 96 - ou 384 puits de format. Le format de celui-ci est adapté pour le volume de réaction de seulement 5 pl. Des rangées des PCR Master Mix dans différentes amorces et plus de lysats de cellules à ces mélanges peuvent être effectués à l&#39;aide d&#39;une pipette multi-canaux ou un robot de manipulation de liquide. Astuce changements sont facultatifs lors de l&#39;ajout du lysat même à différents mélanges de PCR. </li><li> Analyser les produits de PCR. Le Gel Ultra XL système V-2 électrophorèse (Labnet) est compatible avec le chargement des échantillons à l&#39;aide de pipettes multicanaux. </li><li> Sur la base des informations de (3,16) et (3,18), d&#39;identifier les haploïdes probables qui ont voulu génotypes. </li><li> Établir ces souches sur une plaque fraîche (YPDA, CAA-Ura, ou SC-Ura-His/Leu). En outre, les congeler dans25% de glycerol à -80 ° C. Des tests supplémentaires telles que la confirmation de l&#39;absence de séquences de type sauvage des gènes supprimés et l&#39;électrophorèse en champ pulsé sont recommandés. </li><li> Répétez vélo sexuelle de (2.1) avec des souches utiles. </li></ol>

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Comme nous l&#39;avons développé l&#39;approche Green Monster, nous étions préoccupés par la possibilité d&#39;une recombinaison entre différentes cartouches de rechange GFP, ce qui conduit à un réarrangement du génome. Atténuer contre cette possibilité est notre sélection des cellules qui ont subi avec succès plusieurs séries d&#39;accouplement et de la méiose. Les cellules porteuses de génomes réarrangés sont censés être moins en forme après l&#39;accouplement aux cellules sans un réarrangement ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Le nom du réactif ou de l&#39;instrument </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> G418 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A1720 </td><td> Dissoudre dans l&#39;eau et le filtre à stériliser (0,2 um filtre). Concentration Stock: 200 mg / ml. Stocker à 4 ° C. </td></tr><tr><td> ClonNAT (nourséothricine) </td><td> WERNER agents biologiques </td><td> 5001000 </td><td> Dissoudre dans l&#39;eau et le filtre à stériliser (0,2 um filtre). Concentration Stock: 100 mg / ml. Stocker à 4 ° C. </td></tr><tr><td> Doxycycline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9891 </td><td> Dissoudre dans de l&#39;éthanol à 50% et de filtrer les stériliser (0,2 um filtre). Concentration Stock: 10 mg / ml. Assurez frais toutes les quatre semaines. Bouclier de la lumière en utilisant du papier d&#39;aluminium et conserver à 4 ° C. </td></tr><tr><td> Zymolyase </td><td> ZymoResearch </td><td> E1005 </td><td></td></tr><tr><td> Difco yeast nitrogen base w / o acides aminés </td><td> BD </td><td> 291940 </td><td></td></tr><tr><td> Revolver (rotateur pour tubes) </td><td> Labnet </td><td> H5600 </td><td></td></tr><tr><td> Gel Enduro unité d&#39;électrophorèse XL </td><td> Labnet </td><td> E0160 </td><td></td></tr><tr><td> Sonifier 450 </td><td> Branson </td><td> 101-063-198 </td><td></td></tr><tr><td> Microtip pour Sonifier 450 </td><td> Branson </td><td> 101-148-062 </td><td></td></tr><tr><td> Trieur de cellules FACSAria </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Trieur de cellules MoFlo </td><td> Beckman-Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Biomek FX ou un robot équivalent </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td> Facultatif. Pour la mise en place de génotypage PCR. </td></tr></tbody> &lt;/ Table&gt;

the green monster process for the generation of yeast strains carrying multiple gene deletions

Phénotypes pour une délétion du gène sont souvent révélée que lorsque la mutation est testé dans un fond génétique particulier ou 1,2 état ​​de l&#39;environnement. Il ya des exemples où de nombreux gènes doivent être supprimés pour démasquer les fonctions des gènes cachés 3,4. Malgré le potentiel de découvertes importantes, les interactions génétiques impliquant trois ou plusieurs gènes sont en grande partie inexploré. Une recherche exhaustive de plusieurs mutants interactions serait impossible, en raison de la multiplicité des combinaisons possibles de suppressions. Cependant, les études d&#39;ensembles sélectionnés de gènes, tels que les jeux de paralogues avec une plus grande chance de partager priori une fonction commune, serait instructive. Dans la levure Saccharomyces cerevisiae, inactivation du gène est réalisée par le remplacement d&#39;un gène d&#39;un marqueur de sélection par recombinaison homologue. Parce que le nombre de marqueurs est limitée, des méthodes ont été développées pour enlever et réutiliser le sam<html> marqueur e 5,6,7,8,9,10. Cependant, les mutations d&#39;ingénierie séquentielle multiples en utilisant ces méthodes est temps parce que le temps nécessaire échelles linéairement avec le nombre de suppressions d&#39;être généré. Ici, nous décrivons la méthode de Green Monster régulièrement ingénierie suppressions multiples dans la levure 11. Dans cette méthode, une protéine fluorescente verte (GFP) journaliste intégré suppressions est utilisé pour les souches d&#39;étiquette quantitativement en fonction du nombre de suppressions contenues dans chaque souche (figure 1). Cycles répétés de gamme de la GFP marqués par des suppressions conjugaison de la levure et de la méiose couplé avec cytométrie de flux enrichissement de souches transportant plus de ces suppressions conduire à l&#39;accumulation de délétions dans des souches (figure 2). Effectuer des traitements multiples en parallèle, chaque processus comprenant une ou plusieurs délétions par tour, réduit le temps nécessaire pour la construction de la souche. contenu &quot;&gt; La première étape consiste à préparer haploïdes simples mutants appelé« ProMonsters, «dont chacun porte un rapporteur GFP dans un locus supprimé et l&#39;un des« boîte à outils »loci-soit-GMToolkit un monstre vert ou GMToolkit-α à l&#39; . can1Δ locus (figure 3) En utilisant des souches de la collection suppression de levure 12, GFP-marqués délétions peuvent être facilement généré par le remplacement de la cassette de kanMX4 commun qui sont dans ces souches avec une GFP universel - URA3 fragment Chaque GMToolkit contient:. supporte la une - ou α-accouplement du type spécifique de marqueur de sélection haploïde 1 et exactement un des deux marqueurs qui, lorsque les deux sont présents GMToolkits, collectivement permettent la sélection des diploïdes. La deuxième étape consiste à effectuer le cycle sexuel par lequel locus d&#39;effacement peuvent être combinés dans une seule cellule par l&#39;assortiment aléatoire et / ou recombinaison génétiques méiotiquemination qui accompagne chaque cycle de l&#39;accouplement et de la sporulation.

Quand une souche haploïde a-bord quatre suppressions GFP-marqués (ycl033cΔ yer042wΔ ykl069wΔ yol118cΔ) a été croisée avec une souche haploïde α-portant quatre suppressions (ycl033cΔ ydl242wΔ ydl227cΔ yer042wΔ), avec deux délétions (ycl033cΔ yer042wΔ) partagée par deux souches, un représentant résultat a été obtenu. Le mélange accouplement a été cultivée dans un milieu contenant du G418 YPDA et Nat pour sélectionner diploïdes. Les diploïdes obtenu...

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The Green Monster Process for the Generation of Yeast Strains Carrying Multiple Gene Deletions

La méthode de Green Monster permet l&#39;assemblage rapide de suppressions multiples marqués d&#39;un gène rapporteur codant pour la protéine fluorescente verte. Cette méthode est basée sur la conduite des souches de levures par des cycles répétés de l&#39;assortiment sexuelle des suppressions et basée sur la fluorescence d&#39;enrichissement de cellules portant des délétions plus.

Le processus de monstre vert pour la génération de souches de levure portant la délétion de gènes multiples

Phenotypes  for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a  particular genetic background or environmental condition1,2. ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.2K vues.  J. Craig Venter Institute. La méthode de Green Monster permet l'assemblage rapide de suppressions multiples marqués d'un gène rapporteur codant pour la protéine fluorescente verte. Cette méthode est basée sur la conduite des souches de levures par des cycles répétés de l'assortiment sexuelle des suppressions et basée sur la fluorescence d'enrichissement de cellules portant des délétions plus.

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A Rapid Technique for the Visualization of Live Immobilized Yeast Cells

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence microscopy. The technique is equally suited for visualization of static yeast populations, or time courses experiments up to ten hours in length. My microscopy investigates epigenetic inheritance at the silent mating loci in S. cerevisiae. There are two silent mating loci, HML and HMR, which are normally not expressed as they are packaged in heterochromatin. In the sir1 mutant background silencing is weakened such that each locus can either be in the expressed or silenced epigenetic state, so in the population as a whole there is a mix of cells of different epigenetic states for both HML and HMR. My microscopy demonstrated that there is no relationship between the epigenetic state of HML and HMR in an individual cell. sir1 cells stochastically switch epigenetic states, establishing silencing at a previously expressed locus or expressing a previously silenced locus. My time course microscopy tracked individual sir1 cells and their offspring to score the frequency of each of the four possible epigenetic switches, and thus the stability of each of the epigenetic states in sir1 cells. See also  Xu et al., Mol. Cell 2006.

A rapid technique for the visualization of growing immobilized yeast cells, here applied to fluorescent reporters at the silent mating loci HML and HMR

Une technique rapide pour la visualisation de Live cellules de levure immobilisées

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence ...

Recherche

Biologie

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La préparation des cultures primaires de cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse murine pour l&#39;électroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

Molécules simples à l&#39;imagerie du transport nucléaire

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

La reconstitution in vitro de l&#39;actif T. La télomérase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

La délétion de gènes dans le génome entier<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Par PCR à haut débit

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

Bourgeonnement de levure extraction et purification des protéines pour l&#39;étude de la fonction, Interactions, et des modifications post-traductionnelles

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the plasma membrane and the Golgi. As a result the endosomal system plays a central role in maintaining cell homeostasis, and mutations in genes belonging to this network of organelles interconnected by vesicular transport, cause severe pathologies including cancer and neurobiological disorders. It is therefore of prime relevance to understand the mechanisms underlying the biogenesis and organization of the endosomal system. The yeast Saccharomyces cerevisiae has been pivotal in this task. To specifically label and analyze at the ultrastructural level the endosomal system of this model organism, we present here a detailed protocol for the positively charged nanogold uptake by spheroplasts followed by the visualization of these particles through a silver enhancement reaction. This method is also a valuable tool for the morphological examination of mutants with defects in endosomal trafficking. Moreover, it is not only applicable for ultrastructural examinations but it can also be combined with immunogold labelings for protein localization investigations.

Yeast, Saccharomyces cerevisiae, has been a key model organism to identify and study genes regulating the biogenesis and functions of the endosomal system. Here we present a detailed protocol for the specific labeling of the endosomal compartments for ultrastructural studies.

Nanogold étiquetage du système levure endosomique pour les analyses ultrastructurales

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the ...

Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic lateral sclerosis, and &#945;-synuclein, implicated in Parkinson&#8217;s disease, are toxic and form cytoplasmic aggregates in yeast. These features recapitulate protein pathologies observed in patients with these disorders. Thus, yeast are an ideal platform for isolating toxicity suppressors from libraries of protein variants. We are interested in applying protein disaggregases to eliminate misfolded toxic protein conformers. Specifically, we are engineering Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast that is uniquely capable of solubilizing both disordered aggregates and amyloid and returning the proteins to their native conformations. While Hsp104 is highly conserved in eukaryotes and eubacteria, it has no known metazoan homologue. Hsp104 has only limited ability to eliminate disordered aggregates and amyloid fibers implicated in human disease. Thus, we aim to engineer Hsp104 variants to reverse the protein misfolding implicated in neurodegenerative disorders. We have developed methods to screen large libraries of Hsp104 variants for suppression of proteotoxicity in yeast. As yeast are prone to spontaneous nonspecific suppression of toxicity, a two-step screening process has been developed to eliminate false positives. Using these methods, we have identified a series of potentiated Hsp104 variants that potently suppress the toxicity and aggregation of TDP-43, FUS, and &#945;-synuclein. Here, we describe this optimized protocol, which could be adapted to screen libraries constructed using any protein backbone for suppression of toxicity of any protein that is toxic in yeast.

Yeast proteinopathy models are valuable tools to assess the toxicity and aggregation of proteins implicated in disease. Here, we present methods for screening Hsp104 variant libraries for toxicity suppressors. This protocol could be adapted to screen any protein library for toxicity suppressors of any protein that is toxic in yeast.

Isoler Potentiated Hsp104 Variantes utilisant de la levure Proteinopathy modèles

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic ...

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific eukaryotic genome engineering. CRISPR/Cas9 is an inexpensive, facile, and efficient genome editing tool that allows genetic perturbation of genes and genetic elements. Here we present a simple methodology for CRISPR design, cloning, and delivery for the production of genomic deletions. In addition, we describe techniques for deletion, identification, and characterization. This strategy relies on cellular delivery of a pair of chimeric single guide RNAs (sgRNAs) to create two double strand breaks (DSBs) at a locus in order to delete the intervening DNA segment by non-homologous end joining (NHEJ) repair. Deletions have potential advantages as compared to single-site small indels given the efficiency of biallelic modification, ease of rapid identification by PCR, predictability of loss-of-function, and utility for the study of non-coding elements. This approach can be used for efficient loss-of-function studies of genes and genetic elements in mammalian cell lines.

CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.

Génération de suppressions génomiques dans des lignées cellulaires de mammifères via CRISPR / Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

Applications de pHluorin pour Quantitative, Kinetic et à haut débit Analyse des endocytose dans la levure bourgeonnante

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...